玉米赤霉烯酮暴露對秀麗線蟲生殖系統的損傷作用

楊振東，王加生,,*，唐莉莉,，孫秀蘭，Kathy S. Xue

1. 江南大學食品學院，無錫 214122 2. 美國佐治亞大學環境健康科學系，佐治亞雅典30602

玉米赤霉烯酮暴露對秀麗線蟲生殖系統的損傷作用

楊振東1，王加生1,2,*，唐莉莉1,2，孫秀蘭1，Kathy S. Xue2

1. 江南大學食品學院，無錫 214122 2. 美國佐治亞大學環境健康科學系，佐治亞雅典30602

環境雌激素玉米赤霉烯酮(ZEN)的生態安全性近年來受到越來越多的關注。以秀麗隱桿線蟲(Caenorhabdites elegans)為模式生物研究ZEN對線蟲的生殖損傷作用。在DIC顯微鏡下觀察，48 h暴露后與對照組相比，暴露組線蟲性腺臂明顯萎縮，卵母細胞數目和大小均受到顯著影響(P<0.01)，并且可見部分暴露組線蟲產卵器嚴重畸形。這均表明ZEN暴露對秀麗隱桿線蟲生殖系統的發育和功能可產生損害作用。

玉米赤霉烯酮；秀麗隱桿線蟲；生殖損傷

玉米赤霉烯酮(ZEN)是一種由禾谷鐮刀菌、粉紅鐮刀菌、擬枝孢鐮刀菌等多種鐮刀菌代謝產生的具有雌激素生物活性的霉菌毒素[1]。因為首先從污染了禾谷鐮刀菌的發霉玉米中分離得到，所以命名為玉米赤霉烯酮[2]。ZEN廣泛存在于玉米、小麥、高粱、燕麥以及以這些谷物為原料的食品和飼料中[3]，是世界上污染范圍最廣的一種霉菌毒素。目前的研究證明ZEN具有很強的雌激素效應，可以導致暴露動物生殖器官畸形、胎兒死亡、繁殖障礙，給畜牧業造成巨大的經濟損失。實驗表明ZEN可以通過胎盤，影響胚胎和母體之間的物質吸收、利用和與轉運，間接地損害胚胎進而影響了后代的生長發育[4]。ZEN進入人體，還可能誘發腫瘤，給人類健康造成極大危害[5]。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans, C. elegans)是一種簡單的多細胞生物，20世紀60年代分子遺傳學專家Sydney Brenner利用其探索神經發育的遺傳調控機制，逐漸引起科學家們廣泛關注[6]。秀麗隱桿線蟲可以在水中或者土壤中生存，蟲體小，繁殖能力強，生命周期短，其全身透明方便顯微鏡觀察。目前科學家們已經完成了對秀麗隱桿線蟲基因測序，其基因組序列清晰且突變體資源豐富。當前秀麗線蟲在環境毒理學、環境監測等領域已經得到廣泛應用。有報道顯示真菌毒素可以引起秀麗線蟲壽命縮短[7]、蟲體死亡和生殖能力降低[8]。筆者首次利用秀麗隱桿線蟲作為模式生物，研究了ZEN對秀麗線蟲生殖系統器官發育及其功能的影響。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑與線蟲品系

玉米赤霉烯酮購自于Sigma-Aldrich公司。玉米赤霉烯酮粉末先溶解于二甲基亞砜(DMSO)制備成儲備液，然后稀釋為實驗分析使用的濃度。

秀麗線蟲品系為野生型N2，購買于國際線蟲遺傳中心(CGC)。線蟲儲備培養使用含有大腸桿菌OP50的線蟲生長瓊脂培養基[9]。用于指標測試的線蟲培養使用含OP50的液體培養基L-broth[10]。所有線蟲培養均在20 ℃條件下進行。

1.2 線蟲同期化

將成蟲線蟲用K-medium沖洗轉移到10 mL離心管中，3 000 r·min-1離心7 min，取沉淀加10 mL裂解液(8 mol·mL-1NaOH:NaClO = 5:1, V/V)，靜置5 min，2 000 r·min-1離心7 min留沉淀。繼續加入10 mL K-medium輕輕混勻后2 000 r·min-1離心7 min，將沉淀接種到NGM培養板，20 ℃下培養。

1.3 暴露方法

使用12孔細胞板培養線蟲，每孔滴入1 mL含有特定濃度ZEN的L-broth溶液。同期化線蟲生長到L2期后，每孔轉入20條線蟲，20 ℃培養48 h。

1.4 單側性腺臂卵母細胞體積和數目測定

將同期化的線蟲在ZEN中暴露48 h，隨機每組挑取6條線蟲至載玻片上，用10%福爾馬林溶液處死線蟲，蓋上蓋玻片，使用顯微鏡DIC鏡頭觀察拍照記錄。使用Image-Pro?Express software進行卵母細胞體積測量。并統計線蟲單側性腺臂遠端loop區到性腺臂近端儲精囊之間的卵母細胞數目[11]。

1.5 統計學分析

實驗結果均用SPSS 16.0軟件進行分析。應用ONEWAY-ANOVA檢驗方法對數據間進行組間差異顯著性分析。P<0.05為差異具有統計學意義。實驗至少重復3次，結果以均值和標準差形式給出。

2 結果(Results)

2.1 ZEN暴露可以導致秀麗線蟲性腺臂近端臂形態變化

性腺臂是秀麗線蟲形成卵母細胞的場所，功能上與哺乳動物的卵巢相似，是線蟲的重要生殖器官。圖1結果顯示同等放大比例下對照組的線蟲單側性腺臂呈U型彎曲，外觀平滑粗壯，而ZEN暴露組線蟲的性腺臂表現出明顯退化萎縮，不但寬度變窄，長度也縮短。5 mg·L-1ZEN暴露組的線蟲性腺臂還可見U型彎曲，長度和寬度已經明顯縮小。隨ZEN暴露濃度逐漸增加，10 mg·L-1暴露組線蟲性腺臂已經不見U型彎曲，不可區分性腺臂遠端和近端。80 mg·L-1ZEN暴露組的線蟲，甚至在顯微鏡照片中觀察不到明顯的性腺臂輪廓。

2.2 ZEN暴露可以導致秀麗線蟲卵母細胞形態變化

圖2為不同濃度ZEN暴露組線蟲卵母細胞與對照組對比圖片。由圖2可見對照組性腺臂內的卵母細胞排列整齊，細胞數目較多接觸緊密，形狀為飽滿的橢圓形。而暴露組線蟲的卵母細胞形狀均由飽滿變為瘦長型，并且排列松散。20 mg·L-1和50 mg·L-1暴露組線蟲卵母細胞不再呈現規則橢圓，多為不規則形狀，尺寸明顯減小，并且原始生殖細胞與支持細胞排列散亂。暴露組線蟲卵母細胞相較于對照組尺寸可見明顯變化(如圖3所示)，并且呈現ZEN暴露濃度依賴關系。不同濃度ZEN暴露組的卵母細胞大小普遍小于對照組，5 mg·L-1暴露組即出現顯著縮小現象，高濃度50 mg·L-1暴露組線蟲的卵母細胞尺寸僅為對照組的44.5%。

圖1 不同濃度玉米赤霉烯酮(ZEN)暴露下秀麗線蟲(C. elegans)的性腺臂形態對比注：箭頭所指是性腺臂。Fig. 1 Comparison of gonad arm morphology of C. elegans under different ZEN concentrationNote: Arrow refers to the gonadal arm.

圖2 不同濃度ZEN暴露下秀麗線蟲的卵母細胞形態比較(標尺=50 μm)Fig. 2 Comparison of oocyte cells morphology of C. elegans under different ZEN concentration (scale bars, 50 μm)

2.3 ZEN暴露可以導致秀麗線蟲卵母細胞數目減少

使用DIC鏡頭觀察秀麗線蟲單側性腺臂并記錄卵母細胞數目。如圖4所示5 mg·L-1ZEN暴露組線蟲單側性腺臂卵母細胞數目無顯著性變化，從10 mg·L-1暴露濃度線蟲卵母細胞明顯減少，并且表現出一定的濃度依賴性。50 mg·L-1暴露組線蟲性腺臂內卵母細胞較之對照組顯著減少，僅為對照組卵母細胞數目的39.17%。并且暴露48 h，對照組中成蟲第1天的線蟲已經有明顯成熟的卵母細胞，但在80 mg·L-1暴露組同齡線蟲并沒有可觀測到的卵母細胞。

2.4 ZEN暴露可以導致C.elegans產卵器畸形

如圖5a中所示，對照組線蟲產卵器由左右對稱兩組肌肉組成，肌肉之間自然存在狹縫，外觀平滑沒有明顯凸起。而ZEN暴露組線蟲產卵器出現多種畸形：狹縫消失(圖5b)、產卵器肌肉組群不對稱和肌肉凸起(圖5c)，有的甚至長出贅瘤(圖5d)。這些畸變有可能導致線蟲無法正常產出蟲卵，蟲卵在母體內孵化導致母體死亡(圖e和f)，這種現象通常被叫做“蟲袋(worm bag)”[12]。

圖3 不同ZEN濃度下秀麗線蟲卵母細胞大小比較注：與對照組卵母細胞面積對比得出比率，**P<0.01。Fig. 3 Comparison of oocytes size rate of C. elegans under different ZEN concentrationsNote: The oocytes size rate is calculated as that exposed oocytes size is divided by normal oocytes size. **P<0.01.

圖4 不同ZEN濃度下秀麗線蟲單側性腺臂卵母細胞數目注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。Fig. 4 Comparison of oocytes number in gonad arm of C. elegans under different ZEN concentrationsNote: compared with the control, *P<0.05, **P<0.01.

圖5 秀麗線蟲產卵器形態比較(黑圈內為線蟲產卵器)注：a，正常產卵器；b，狹縫消失；c，產卵器肌肉群不對稱并且異常凸起；d，產卵器贅瘤；e，蟲袋；f，蟲袋。Fig. 5 Comparison of normal and abnormal vulva morphology of C. elegans under ZEN exposure (black circles point to vulva)Note: a, normal vulva morphology; b, disappeared vulva slit; c, asymmetrical and protruding vulva; d, vulva neoplasm; e, worm bag; f, worm bag.

3 討論(Discussion)

秀麗線蟲近幾年成為科學研究的重要模式生物，它存活在土壤中，成蟲體長僅1 mm，周身透明，以細菌為食。另外秀麗線蟲有雌雄同體和雄性2種性別，但是絕大部分為雌雄同體，僅1%左右為雄性。雌雄同體個體既可以進行自體受精，也可以與雄性個體交配[13]。本實驗以雌雄同體線蟲為研究對象，觀察ZEN暴露對秀麗線蟲生殖系統發育和功能的影響。

雌雄同體線蟲的生殖系統由一條左右對稱的性腺臂(圖6a)組成，單側性腺臂可劃分為近端臂和遠端臂(圖6b)。遠端臂即為線蟲的卵巢部分，卵子的產生和成熟都在此完成。遠端臂是線蟲排出卵子，形成受精卵和受精卵發育的場所。受精卵發育成熟后，由生在線蟲腹部中部的產卵器排出[14]。本實驗中對照組秀麗線蟲卵母細胞從單側性腺臂的遠端臂到性腺臂近端儲精囊之間是緊密排列并且與體細胞充分接觸，隨著靠近儲精囊，卵子發育愈發成熟，體積會逐漸增大，形狀大多為規則飽滿的橢圓形。而ZEN暴露組線蟲的卵母細胞不但數目減少，體積明顯變小，形態也發生了變化，由橢圓發展為不規則形狀，飽滿變為瘦長，卵母細胞之間也不再緊密排列而是出現縫隙(圖2)。這些現象體現ZEN暴露影響了秀麗線蟲性腺臂生成正常卵母細胞的功能，導致卵母細胞數量減少，發育不完全。Wolke等[15]研究發現線蟲卵母細胞的生長主要依靠性腺臂粗黑線區域細胞流(圖6b)向近端臂的卵巢輸送營養物質，而細胞間接觸承擔了營養輸送功能。本研究中圖1顯示ZEN暴露使線蟲性腺臂長度明顯縮短，已經無法區分近端和遠端性腺臂。這可能導致卵母細胞無法得到充足營養物質，影響正常發育。而卵母細胞不規則排列，細胞間間隙增大，也可能是阻礙營養正常運輸的另一個原因，抑制卵母細胞發育，從而導致卵母細胞發育緩慢，體積縮小，子宮內受精卵數目減少[16]。

圖6 秀麗線蟲的生殖系統示意圖注：a, 雌雄同體秀麗線蟲的生殖系統示意圖；b，單側性腺臂的結構圖。Fig. 6 Reproductive system structure of C. elegans Note: a, reproductive system for hermaphrodites; b, unilateral gonad arm structure.

秀麗線蟲從胚胎發育成成蟲，要經歷4個階段，而產卵期發育基本在第3階段即可全部完成。本實驗所用線蟲均為L2期，L2到L3大概要經歷10 h。盡管ZEN可產生影響的時間較短，圖5依然顯示秀麗線蟲產卵器產生嚴重畸形。這些畸形對秀麗線蟲的排卵功能可能造成一定程度的損傷，導致秀麗線蟲排卵受阻。這種損傷會降低秀麗線蟲的生殖能力，同時受精卵無法排出體外便會在蟲體內孵化，導致秀麗線蟲母體死亡(圖5e和f)。據研究報道ZEN暴露可引起脊椎動物體內雌激素紊亂，母豬表現出陰戶腫脹、乳腺增大等生殖器官異常現象[17]，而秀麗線蟲本身并沒有成熟的生殖系統，僅有性腺臂和子宮、產卵器等簡單生殖器官，是否由于ZEN的類雌性激素作用引起這種生殖器官畸形還有待進一步驗證。

有研究證明ZEN可以通過p53依賴的線粒體信號通絡，導致HepG2細胞凋亡，也可以使人腸細胞系細胞中的線粒體和溶酶體產生過氧化反應，使細胞器結構遭到破壞，導致細胞死亡[18]。另外ZEN導致卵母細胞的不正常發育在大鼠中也有發現，對大鼠腹腔注射ZEN，暴露96 h后剖殺觀察其卵巢組織，可見其卵巢組織出現不同程度損傷，卵泡顆粒細胞畸形發育并可見凋亡[2]。ZEN可以通過影響性腺各組織的能量代謝導致細胞的死亡，使組織產生退行性病變，影響其正常的結構與功能，筆者因此推斷這是ZEN暴露組線蟲性腺臂退化、卵母細胞減少的原因(圖1)。

綜上所述，ZEN可以導致秀麗隱桿線蟲生殖腺臂萎縮，卵母細胞數目減少、形狀突變，誘發產卵器發育畸形，這表明ZEN對秀麗線蟲具有生殖毒性。筆者的前期研究表明ZEN導致器官畸變從而誘發秀麗線蟲死亡以及生殖能力下降[8]。秀麗線蟲作為一種簡單模式生物在生殖毒性實驗中表現出易操作、短周期、高靈敏等獨特的優勢。這種優勢奠定了它在環境毒性評價中的應用價值，可用于進行環境毒素毒性的快速篩檢。不過本研究雖證明了ZEN暴露對秀麗線蟲生殖系統可以產生不利影響，但其作用機理機制仍有待深入研究。

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The Reproductive Toxic Effects of Zearalenone onCaenorhabditiselegans

Yang Zhendong1, Wang Jia-Sheng1,2,*, Tang Lili1,2, Sun Xiulan1, Kathy S. Xue2

1. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China 2. Department of Environmental Health and Science, University of Georgia, Athens 30602, USA

Received 6 March 2016 accepted 3 April 2016

Ecological safety of zearalenone (ZEN), a potent environmental endocrine disruptor, has been a great concern. To study the reproductive toxic effects of ZEN, L2 Caenorhabdites elegans (C. elegans) were exposed to different doses of ZEN in various times. After 48 h exposure to ZEN, the morphology of the gonad arm, the vulva, and the oocytes in uterus was examined by DIC microscope. As compared to the control group, atrophic gonad arms, abnormal vulva structures and smaller oocytes were found with significantly statistical differences in worms treated with ZEN (P<0.01). The oocytes numbers and their size were significantly affected by ZEN. Worms in ZEN-treated group also showed abnormal vulva structures and defects. These results demonstrated severe damages of reproductive and developmental functions following ZEN exposure in C. elegans.

zearalenone; Caenorhabditis elegans; reproductive damage

國家自然科學基金聯合基金項目(u1301214)

楊振東(1986-)，女，博士，研究方向為真菌毒素毒性檢測，E-mail: zdyang777@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: jswang@uga.edu

10.7524/AJE.1673-5897.20160306002

2016-03-06 錄用日期：2016-04-03

1673-5897(2016)6-171-06

X171.5

A

王加生(1955-)，男，分子流行病學博士，長江學者特聘教授，長期從事生物毒素分子生物標志物研究。

楊振東, 王加生, 唐莉莉, 等. 玉米赤霉烯酮暴露對秀麗線蟲生殖系統的損傷作用[J]. 生態毒理學報，2016, 11(6): 171-176

Yang Z D, Wang J S, Tang L L, et al. The reproductive toxic effects of zearalenone on Caenorhabditis elegans [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(6): 171-176 (in Chinese)