鎘脅迫對脊尾白蝦的毒性效應(yīng)研究

薛蓓，張培，李志輝，趙蓮，賴曉芳，陳建華，高煥，閻斌倫,*

1. 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，淮海工學(xué)院，連云港 222005 2. 江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，連云港 222001 3. 江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺，南京 210014

鎘脅迫對脊尾白蝦的毒性效應(yīng)研究

薛蓓1,2,3，張培1,2,3，李志輝1,2,3，趙蓮1,2,3，賴曉芳1,2,3，陳建華1,2,3，高煥1,2,3，閻斌倫1,2,3,*

1. 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，淮海工學(xué)院，連云港 222005 2. 江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，連云港 222001 3. 江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺，南京 210014

為揭示重金屬鎘對脊尾白蝦的毒性效應(yīng)，采用急性毒性實(shí)驗(yàn)方法，研究了不同濃度鎘(Cd2+)對脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)血清氧化應(yīng)激相關(guān)生理指標(biāo)的活性以及肌肉組織中腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因(ANT)和熱激蛋白70基因(HSC70)表達(dá)水平的影響。共設(shè)置4個Cd2+濃度脅迫(0、0.0002、0.001、0.005 mmol·L-1)，分別在0、3、6、9、12、24、36、48、72和96 h共10個時間點(diǎn)對相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測定。結(jié)果顯示：不同濃度鎘脅迫下，脊尾白蝦血清中H2O2含量、MDA含量和GSH含量均表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，H2O2含量在脅迫3 h時即出現(xiàn)明顯的升高，而MDA和GSH則均在9 h時出現(xiàn)升高趨勢，表現(xiàn)為一定的滯后性。H2O2含量在0.005 mmol·L-1脅迫3 h時出現(xiàn)峰值，MDA含量在0.005 mmol·L-1脅迫9 h時出現(xiàn)峰值，GSH含量在0.001 mmol·L-1脅迫48 h時出現(xiàn)峰值，且均與對照組存在顯著性差異(P < 0.05)。HSC70基因的表達(dá)量在不同濃度脅迫下均表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢，且均在24 h時達(dá)到峰值，具體表達(dá)量水平的順序?yàn)椋?.0002 mmol·L-1> 0.001 mmol·L-1> 0.005 mmol·L-1。ANT基因的表達(dá)量在不同濃度下則均表現(xiàn)為明顯的下調(diào)趨勢。由此可見，急性Cd2+脅迫不僅影響脊尾白蝦的氧化應(yīng)激相關(guān)生理指標(biāo)，還影響機(jī)體內(nèi)組成型HSC70及與能量傳遞有關(guān)的ANT基因的表達(dá)水平。

鎘；脊尾白蝦；急性毒性；氧化應(yīng)激；ANT；HSC70

重金屬鎘(Cd)是生物體非必需的有毒重金屬元素，目前已成為近海主要污染物之一，且主要積聚在沉積物中，表現(xiàn)為強(qiáng)富集性[1]。鎘污染在水體中不能被微生物降解，只能在環(huán)境中遷移或轉(zhuǎn)化，并通過食物鏈在各營養(yǎng)級的生物體內(nèi)蓄積，富集可達(dá)到數(shù)千乃至萬倍以上，且極少量能被排出體外[2]。鎘不僅對水生生物的酶活性產(chǎn)生影響，還可能破壞膜系統(tǒng)、改變細(xì)胞形態(tài)從而影響組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并能對卵巢發(fā)育產(chǎn)生抑制作用，降低受精卵的孵化率，導(dǎo)致胚胎畸形，影響蝦蟹類的生長發(fā)育[3]。

脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)是一種重要的經(jīng)濟(jì)蝦類，目前在我國沿海區(qū)域均有分布，其中以黃海、渤海資源量最為豐富[4]。由于脊尾白蝦具備繁殖能力強(qiáng)、生長速度快、環(huán)境適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)，已被作為沿海地區(qū)池塘混養(yǎng)的主要物種之一，其產(chǎn)量已達(dá)到東部沿海混養(yǎng)池塘總量的三分之一左右[5]。近年來，脊尾白蝦繁育和養(yǎng)殖區(qū)所屬的近海海域受到重金屬鎘污染的問題越來越受到關(guān)注[6]。本研究通過對不同濃度鎘離子脅迫下脊尾白蝦氧化應(yīng)激響應(yīng)以及代謝和HSC基因表達(dá)量的變化研究，探討脊尾白蝦應(yīng)答不同濃度鎘離子的生理反應(yīng)機(jī)制，以期揭示重金屬鎘對脊尾白蝦生長發(fā)育的影響及其相應(yīng)的內(nèi)在響應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用脊尾白蝦為連云港贛榆養(yǎng)殖池塘自繁而來的個體。選擇大小相近的個體，平均體長為(6.65±0.50) cm，平均體質(zhì)量為(4.81±0.63) g于實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。暫養(yǎng)和后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用海水用海水晶配制，鹽度26，pH 8.0，并保持水溫26 ℃。暫養(yǎng)期間保持連續(xù)充氣。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，本研究中采用靜水暴露方式[7]，單因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計，設(shè)置1個對照組(0 mmol·L-1)和3個不同鎘離子濃度實(shí)驗(yàn)組：實(shí)驗(yàn)組1(0.0002 mmol·L-1)、實(shí)驗(yàn)組2(0.001 mmol·L-1)、實(shí)驗(yàn)組3(0.005 mmol·L-1)。毒性實(shí)驗(yàn)在80 cm×60 cm×60 cm(長×寬×高)的養(yǎng)殖箱中進(jìn)行，每組放置約80尾蝦，各梯度以1 mol·L-1氯化鎘原液調(diào)節(jié)，實(shí)驗(yàn)期間，為保持水體中鎘離子濃度穩(wěn)定，不喂食、不吸污。鎘離子脅迫實(shí)驗(yàn)進(jìn)行96 h，期間，分別在0、3、6、9、12、24、36、48、72和96 h共10個時間點(diǎn)取樣，每個時間點(diǎn)對照組和實(shí)驗(yàn)組各取3尾。

1.3 血淋巴制備

用1 mL注射器從脊尾白蝦心臟中插入抽取血淋巴，置于1.5 mL Eppendorf管中，并與抗凝劑(NaCl 450 mmol·L-1，KCl 10 mmol·L-1，EDTA·2Na 10 mmol·L-1，HEPES 10 mmol·L-1)以體積比1∶1混合均勻，經(jīng)冷凍離心機(jī)(MIKRO 220R，德國，湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司)3 500 r·min-1，4 ℃離心10 min獲取上清液即為血清，置于-20 ℃保存，以備測定非特異性免疫因子活性。

1.4 總RNA提取和cDNA合成

解剖脊尾白蝦，獲得肌肉樣品，迅速將其置于液氮中研磨成粉狀，隨后轉(zhuǎn)入液氮預(yù)冷過的無RNase的Eppendorf管中，加入Trizol并按試劑盒(生工生物工程有限公司)說明書提取總RNA，以DEPC水溶解，置于-80 ℃保存。用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA的完整性，并用AMV第一鏈cDNA合成試劑盒(生工生物工程有限公司)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，置于-20 ℃保存。

1.5 氧化應(yīng)激相關(guān)生理指標(biāo)的測定

采用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定3種生理指標(biāo)：過氧化氫(H2O2)、丙二醛(MDA)和還原型谷胱甘肽(GSH)。血清中蛋白濃度采用考馬斯亮藍(lán)法測定，牛血清白蛋白(Amresco)為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。采用成組數(shù)據(jù)的t-test法對實(shí)驗(yàn)組和對照組進(jìn)行比較。P<0.05時表示差異顯著。

1.6 ANT和HSC70基因熒光定量表達(dá)分析

以10個時間點(diǎn)對照組和實(shí)驗(yàn)組中獲得的cDNA為熒光定量PCR模板，采用熒光定量PCR技術(shù)對脊尾白蝦腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因(ANT)(GenBank號: KP892663)和組成型熱激蛋白70基因(HSC70)(GenBank號: AGF80339.1)表達(dá)變化情況進(jìn)行分析。

由已知的脊尾白蝦腺苷酸轉(zhuǎn)移酶基因(ANT)和熱激蛋白70基因(HSC70)分別設(shè)計特異引物。ANT基因上游引物和下游引物分別為：5’-TTCAAGGACAAATACAAGCA-3’，5’-GAGGATACACAAAGCAGAGG-3’；HSC70基因上游引物和下游引物分別為：5’-TGCTGTAGTCACTGTACCTGCC-3’，5’-CGTTCCCCAACTTTTTT-3’。由脊尾白蝦18S rRNA序列設(shè)計引物作為內(nèi)參，上游引物和下游引物分別為為5’-TATACGCTAGTGGAGCTGGAA-3’，5’-GGGGAGGTAGTGACGAAAAAT-3’。引物均利用Primer Premier 5設(shè)計后，由上海生工生物工程有限公司合成并稀釋為10 μmol·L-1待用。實(shí)驗(yàn)儀器為ABI StepOnePlus實(shí)時熒光定量PCR儀(美國，南京貝登生物科技有限公司)，實(shí)時熒光定量PCR按照SYBR Premix Ex TaqTM熒光定量試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)說明書進(jìn)行，并設(shè)置以滅菌水替代模板的陰性對照。擴(kuò)增體系為20 μL，包括10 μL SYBR Premix Ex TaqTM(2×)、0.4 μL上游引物(10 μmol·L-1)、0.4 μL下游引物(10 μmol·L-1)、0.4 μL ROX Reference Dye II(50×)、1.0 μL cDNA模板和7.8 μL滅菌水。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 min，95 ℃ 15 s。利用ΔΔCt法分別計算ANT和HSC70基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果(Results)

2.1 鎘離子脅迫對過氧化氫(H2O2)含量的影響

受不同濃度鎘離子脅迫的脊尾白蝦體內(nèi)過氧化氫(H2O2)含量隨時間的變化如圖1所示。與對照組相比，3個實(shí)驗(yàn)組H2O2含量均呈現(xiàn)出先升高后降低的總體趨勢。高濃度0.005 mmol·L-1脅迫時，H2O2含量變化與其他實(shí)驗(yàn)組相比更為明顯，而濃度為0.001 mmol·L-1和0.0002 mmol·L-1時，H2O2含量僅略高于對照組。其中鎘離子濃度為0.005 mmol·L-1時，受脅迫3 h時，H2O2含量達(dá)到峰值，且在3 h至12 h內(nèi)H2O2含量均顯著高于對照組(P < 0.05)；而鎘離子濃度為相對較低的0.001 mmol·L-1和0.0002 mmol·L-1時，H2O2含量在3 h至9 h時與對照組存在顯著性差異(P < 0.05)，但其含量明顯低于濃度為0.005 mmol·L-1的實(shí)驗(yàn)組。脅迫時間達(dá)到24 h后，各實(shí)驗(yàn)組與對照組均不存在顯著性差異(P>0.05)。

2.2 鎘離子脅迫對丙二醛(MDA)含量的影響

受不同濃度鎘離子脅迫的脊尾白蝦體內(nèi)丙二醛(MDA)含量隨時間的變化如圖2所示。與對照組脊尾白蝦體內(nèi)MDA含量平穩(wěn)的變化趨勢相比，3個實(shí)驗(yàn)組均在9 h時出現(xiàn)MDA含量的急劇增加，且脅迫濃度越高，MDA含量也越高。鎘離子濃度為0.005 mmol·L-1時，MDA含量僅在9 h和12 h時高于對照組，在9 h時出現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組中的最高值，與對照組相比差異顯著(P<0.01)；濃度為0.001 mmol·L-1時，MDA含量在9 h、12 h和24 h時與對照組存在顯著性差異(P<0.05)，且在9 h時出現(xiàn)峰值；濃度為0.0002 mmol·L-1時，MDA含量在9 h至36 h與對照組相比有明顯升高，在12 h出現(xiàn)峰值，且在12 h、24 h和36 h時與對照組相比差異顯著(P<0.01)。

圖1 不同鎘離子濃度下脊尾白蝦體內(nèi)H2O2含量隨時間的變化注：*表示與對照差異顯著(P < 0.05)。下同。Fig. 1 H2O2 content in Exopalaemon carinicauda after exposure to different concentration of Cd2+Note: * indicates that the values are significantly different from the control at 0.05 level. The same below.

圖2 不同鎘離子濃度下脊尾白蝦體內(nèi)MDA含量隨時間的變化注：與對照相比，*、** P < 0.05、P < 0.01。下同。Fig. 2 MDA content in Exopalaemon carinicauda after exposure to different concentration of Cd2+Note: *, ** indicate that the values are significantly different from the control at 0.05 and 0.01 level, respectively. The same below.

2.3 鎘離子脅迫對還原型谷胱甘肽(GSH)含量的影響

受不同濃度鎘離子脅迫的脊尾白蝦體內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)含量隨時間的變化如圖3所示。對照組中GSH含量呈現(xiàn)相對平穩(wěn)的趨勢，而3個實(shí)驗(yàn)組均自9 h時開始出現(xiàn)GSH含量的升高，但在GSH含量的變化上表現(xiàn)為：0.001 mmol·L-1> 0.0002 mmol·L-1> 0.005 mmol·L-1。鎘離子濃度為0.005 mmol·L-1時，GSH含量僅在9 h和12 h時有所升高，與對照組相比差異顯著(P<0.01)；濃度為0.001 mmol·L-1時，GSH含量在9 h至96 h均較對照組有所升高，且在48 h時出現(xiàn)峰值，與對照組相比差異顯著(P<0.01)；濃度為0.0002 mmol·L-1時，GSH含量在9 h至48 h略高于對照組，且在24 h時出現(xiàn)峰值，與對照組存在顯著差異(P<0.01)。

2.4 鎘離子脅迫對HSC70基因的相對表達(dá)量的影響

受不同濃度鎘離子脅迫的脊尾白蝦體內(nèi)HSC70基因的相對表達(dá)量隨時間的變化如圖4所示。從圖4可以發(fā)現(xiàn)，不同濃度鎘離子脅迫均導(dǎo)致脊尾白蝦體內(nèi)HSC70基因的表達(dá)量的異常，從9 h開始，鎘離子濃度為0.0002、0.001和0.005 mmol·L-1時均表現(xiàn)為明顯的上升趨勢，且均在24 h時達(dá)到峰值，之后HSC70基因的表達(dá)量迅速降低至對照組水平。同時，可以發(fā)現(xiàn)鎘離子濃度越高對應(yīng)的HSC70基因的表達(dá)量越低，在0.0002 mmol·L-1時，HSC70基因的相對表達(dá)量最高，其次為濃度0.001 mmol·L-1，在濃度為0.005 mmol·L-1時，表達(dá)量最低。

2.5 鎘離子脅迫對ANT基因相對表達(dá)量的影響

受不同濃度鎘離子脅迫的脊尾白蝦體內(nèi)ANT基因的相對表達(dá)量隨時間的變化如圖5所示。受不同濃度鎘離子脅迫后的脊尾白蝦體內(nèi)ANT基因的相對表達(dá)量均明顯低于對照組(P<0.05)，在3 h時均出現(xiàn)最低值，之后隨時間雖略有波動但相對表達(dá)量均明顯低于對照組(P<0.05)。

3 討論(Discussion)

目前，重金屬對甲殼類的遺傳毒理學(xué)研究大多都限于重金屬脅迫后氧化還原系統(tǒng)的活動規(guī)律，一般認(rèn)為鎘等重金屬可以誘導(dǎo)諸如超氧根離子(O2-·)、氫氧根離子(OH-)、羥自由基(·OH)、過氧化氫(H2O2)等活性氧(active oxygen species, AOS)的產(chǎn)生，或抑制生物體內(nèi)的重要酶，使機(jī)體產(chǎn)生的活性氧等有害物質(zhì)不能及時清除，繼而引發(fā)細(xì)胞的廣泛損傷如脂質(zhì)過氧化作用，從而損害機(jī)體細(xì)胞和組織正常的生理機(jī)能和免疫防御能力[8-10]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，水中重金屬鎘離子對于水生生物的抗氧化酶活力、脂質(zhì)過氧化水平等存在顯著的影響[11-12]，并且不同的鎘離子濃度對生物體的影響可能不同[13]。但是，重金屬鎘對生物機(jī)體的損傷可能并不僅僅是產(chǎn)生活性氧，更可能在免疫系統(tǒng)和分子機(jī)理水平產(chǎn)生影響，甚至不同重金屬對生物的毒性作用的機(jī)理也未必都是一樣的，這些都需要去驗(yàn)證，因此，本研究通過對過氧化氫(H2O2)、丙二醛(MDA)和還原型谷胱甘肽(GSH)3種與脊尾白蝦氧化應(yīng)激相關(guān)的生理指標(biāo)的含量以及參與逆境脅迫的HSC70基因和細(xì)胞內(nèi)能量代謝的關(guān)鍵蛋白ANT基因的表達(dá)量的變化情況來探討脊尾白蝦在不同濃度的鎘離子脅迫下的生理反應(yīng)。

圖3 不同鎘離子濃度下脊尾白蝦體內(nèi)GSH含量隨時間的變化Fig. 3 GSH content in Exopalaemon carinicauda after exposure to different concentration of Cd2+

圖4 不同鎘離子濃度下脊尾白蝦體內(nèi)HSC70基因表達(dá)量隨時間的變化Fig. 4 HSC70 expression detected with real-time PCR technique in the muscle of Exopalaemon carinicauda exposed to different concentration of Cd2+

圖5 不同鎘離子濃度下脊尾白蝦體內(nèi)ANT基因表達(dá)量隨時間的變化Fig. 5 ANT expression detected with real-time PCR technique in the muscle of Exopalaemon carinicauda exposed to different concentration of Cd2+

過氧化氫(H2O2)作為活性氧的一種，具有較活潑的化學(xué)反應(yīng)特性，在正常的生物體內(nèi)可以被過氧化氫酶和超氧化物歧化酶等抗氧化酶清除，維持正常的機(jī)體生命活動，而鎘可以結(jié)合與抗氧化系統(tǒng)有關(guān)的酶類，改變其分子構(gòu)象使其失活，導(dǎo)致H2O2含量的升高[14]。本研究中，處理組的H2O2含量出現(xiàn)了升高的趨勢，說明鎘離子脅迫會導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)氧化還原系統(tǒng)的異常反應(yīng)，這與之前研究中發(fā)現(xiàn)的鎘可以誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生的結(jié)論相一致[14]；在濃度較低的0.0002 mmol·L-1和0.001 mmol·L-1的處理組中，H2O2含量僅在3 h、6 h和9 h時略有升高，而整體含量與對照組差異不大；但在較高濃度的0.005 mmol·L-1時，H2O2含量在脅迫后3 h即出現(xiàn)極高的峰值，且直至12 h時均顯著高于對照組，說明鎘離子濃度越高，脊尾白蝦體內(nèi)產(chǎn)生的H2O2含量就越多。隨脅迫時間的延長，各處理組H2O2含量逐漸降低，說明機(jī)體具有應(yīng)答鎘脅迫并清除H2O2的功能。

丙二醛(MDA)是機(jī)體內(nèi)氧自由基代謝的最終分解產(chǎn)物，它可以反映機(jī)體內(nèi)活性氧的積累，以及生物體受外界毒物的脅迫程度，作為指示生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度的檢測指標(biāo)，并且通過與蛋白質(zhì)的互作，引起蛋白質(zhì)分子與分子間的交聯(lián)從而損傷細(xì)胞[12,15-17]。本研究中發(fā)現(xiàn)處理組中MDA含量均在9 h后出現(xiàn)升高趨勢，整體變化與H2O2含量相比表現(xiàn)為一定的滯后性，進(jìn)一步說明丙二醛是機(jī)體內(nèi)活性氧的代謝產(chǎn)物；隨著脅迫時間延長，MDA含量降低，這與許星鴻等[13]在以≤0.1 mg·L-1的鎘處理日本蟳時得到的結(jié)果類似。就不同濃度的處理組而言，較低濃度(0.0002 mmol·L-1和0.001 mmol·L-1)時，MDA含量表現(xiàn)為較長時間的緩慢增加及隨后降低的變化(其中0.0002 mmol·L-1時為9 h至36 h，0.001 mmol·L-1時為9 h至24 h)，而較高濃度(0.005 mmol·L-1)時，表現(xiàn)為短時間的急劇增加和降低(9 h至12 h，其中9 h時的MDA含量明顯高于其他)，說明較高濃度的鎘離子對脊尾白蝦的毒性效應(yīng)劇烈，而較低濃度時，脊尾白蝦中MDA含量的積累較為緩慢。

還原型谷胱甘肽(GSH)是抗氧化系統(tǒng)中一種重要的抗氧化物質(zhì)，可以在谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的作用下將H2O2及有機(jī)氫過氧化物(ROOH)分別還原為H2O和ROH[18]。在本研究中，不同處理組中GSH的含量則表現(xiàn)為先升高后降低的變化趨勢。鎘離子濃度為0.0002 mmol·L-1時，GSH含量在9 h至48 h略高于對照組，而濃度為0.001 mmol·L-1時，GSH含量在9 h至96 h較對照組均有所升高，且含量較0.0002 mmol·L-1時略高，說明最低濃度時重金屬鎘對生物體的氧化脅迫程度較低；而濃度為0.005 mmol·L-1時，GSH含量僅在9 h和12 h時有所升高，且相對于其他處理組GSH含量最低，說明高濃度的鎘脅迫可能造成毒性效應(yīng)，使GSH因中毒而受到抑制；也可能由于機(jī)體對鎘及其代謝物的解毒能力的飽和作用使GSH含量降低。這與金芬芬等[11]在長江華溪蟹受鎘脅迫后肝胰臟線粒體GSH含量變化的研究結(jié)果相一致。

熱激蛋白(heat shock proteins, HSPs)是所有生物細(xì)胞在受到外源性刺激后產(chǎn)生的一類特殊的蛋白質(zhì)，可以提高細(xì)胞的耐受性，對生物細(xì)胞具有保護(hù)修復(fù)的作用[19]。HSP70家族是HSPs家族中最保守的一類，在大多數(shù)生物中含量最多[20]。它主要可以分為2類：一種是誘導(dǎo)型HSP70，在正常生理情況下，HSP70基因無表達(dá)或低表達(dá)，但在應(yīng)激刺激下表達(dá)量上升[21]；目前對于HSP70的研究發(fā)現(xiàn)鎘脅迫可以誘導(dǎo)渦蟲(Dugesia japonica)DjHsp70的表達(dá)量及鯽魚(Carassius auratus)肝臟組織內(nèi)熱激蛋白HSP70的表達(dá)[22-23]。另一種是組成型HSC70(heat shock cognate 70)，通常在細(xì)胞內(nèi)有組成型表達(dá)，并且能被外界刺激所誘導(dǎo)[24]，有研究表明不同濃度Cu2+處理可以顯著誘導(dǎo)近江牡蠣(Crassostrea hongkongensis)外套膜、鰓和消化腺中HSC70基因的表達(dá)水平[25]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，各處理組脊尾白蝦肌肉組織中HSC70基因的表達(dá)量與對照組相比均表現(xiàn)為先升高后降低的變化趨勢，且脅迫濃度越高，對應(yīng)HSC70的表達(dá)量越低，這說明低濃度鎘脅迫與高濃度鎘脅迫相比在HSC70的表達(dá)量變化中呈現(xiàn)較強(qiáng)的誘導(dǎo)作用，其內(nèi)在機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

腺苷酸轉(zhuǎn)移酶(adenine nucleotide translocase，ANT)作為真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員，是線粒體中最豐富的蛋白質(zhì)之一，也是保持細(xì)胞內(nèi)能量代謝的關(guān)鍵成分[26-27]。有研究發(fā)現(xiàn)，凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)ANT基因可能在低溫應(yīng)激中發(fā)揮作用[28]；擬穴青蟹(Scylla paramamosain)在溫度、鹽度變化時ANT基因均存在一定的應(yīng)答反應(yīng)[29]。本研究中發(fā)現(xiàn)，不同濃度鎘離子脅迫下的脊尾白蝦肌肉組織中ANT基因的表達(dá)量均表現(xiàn)為明顯的下調(diào)趨勢，說明鎘離子脅迫可能影響脊尾白蝦體內(nèi)能量傳遞過程，使機(jī)體能量代謝機(jī)制出現(xiàn)異常，導(dǎo)致ANT基因的低表達(dá)。

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◆

Toxicity Effects of Cadmium on the Ridgetail White PrawnExopalaemoncarinicauda

Xue Bei1,2,3, Zhang Pei1,2,3, Li Zhihui1,2,3, Zhao Lian1,2,3, Lai Xiaofang1,2,3, Chen Jianhua1,2,3, Gao Huan1,2,3, Yan Binlun1,2,3,*

1. Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology, Huaihai Institute of Technology, Lianyungang 222005, China 2. Co-Innovation Center of Jiangsu Marine Bio-industry Technology, Lianyungang 222005, China 3. The Jiangsu Provincial Platform for Conservation and Utilization of Agricultural Germplasm, Nanjing 210014, China

Received 6 April 2016 accepted 31 May 2016

To investigate cadmium toxicity in the ridgetail white prawn Exopalaemon carinicauda, individual prawns were exposed to cadmium at different concentrations (0, 0.0002, 0.001, and 0.005 mmol·L-1) for 0, 3, 6, 9, 12, 24, 36, 48, 72 and 96 hours. A number of indexes were used to evaluate how the prawns were affected by Cd stress, including content of H2O2, MDA and GSH, and expression level of genes encoding adenine nucleotide translocase (ANT) and heat shock cognate 70 (HSC70). The results showed that the content of H2O2, MDA and GSH increased initially, and then decreased with the duration of Cd stress. The content of H2O2tended to increase after exposure to different Cd concentrations for 3 hours. In contrast, the content of MDA and GSH increased, following a lag period, after being stressed for 9 hours. After exposure to 0.005 mmol·L-1for 3 hours, the content of H2O2reached its maximum value, but for MDA and GSH, the maximum values appeared after 9 hours at 0.005 mmol·L-1(MDA) and after 48 hours at 0.001 mmol·L-1(GSH). The differences between treatment and control for the maximum values were significant (P < 0.05). HSC70 expression in each treatment tended to increase at first, and then reach a plateau after 24 hours, before decreasing. For expression levels, the order of maximum values after 24 hours occurred at concentrations of: 0.0002 mmol·L-1> 0.001 mmol·L-1> 0.005 mmol·L-1. Compared to the control, ANT expression was inhibited after Cd stress. Therefore, in E. carinicauda, cadmium influenced not only the activity of physiological indicators related to oxidative stress, but also the expression levels of HSC70 and ANT mRNA.

cadmium; Exopalaemon carinicauda; acute toxicity; oxidative stress; ANT; HSC70

江蘇省農(nóng)業(yè)科技支撐計劃(BE2013363)；江蘇省高校“青藍(lán)工程”培養(yǎng)基金；連云港市產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目(CXY1517)；淮海工學(xué)院江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究基金(2015HS001)；江蘇省2015年度普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃項(xiàng)目(KYLX15_1486)

薛蓓(1992-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楹Ｑ笊锓敝撑c遺傳育種學(xué)，E-mail: malvsy@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: yanbl@hhit.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160406002

2016-04-06 錄用日期：2016-05-31

1673-5897(2016)6-207-07

X171.5

A

閻斌倫(1962—)，男，學(xué)士，教授，研究方向海洋甲殼類種質(zhì)資源保護(hù)與利用。

薛蓓, 張培, 李志輝, 等. 鎘脅迫對脊尾白蝦的毒性效應(yīng)研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2016, 11(6): 207-213

Xue B, Zhang P, Li Z H, et al. Toxicity effects of cadmium on the ridgetail white prawn Exopalaemon carinicauda [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(6): 207-213 (in Chinese)