狼尾草根系對阿特拉津長期脅迫的氧化應激響應

馬兵兵，姜昭1,，Kehinde Olajide Erinle，曹博，李金梅，陳玉坤，張穎,*

1. 農業部產地環境質量重點實驗室/天津市農業環境與農產品安全重點實驗室，天津 300191 2. 東北農業大學資源與環境學院，哈爾濱 150030

狼尾草根系對阿特拉津長期脅迫的氧化應激響應

馬兵兵2，姜昭1,2，Kehinde Olajide Erinle2，曹博2，李金梅2，陳玉坤2，張穎2,*

1. 農業部產地環境質量重點實驗室/天津市農業環境與農產品安全重點實驗室，天津 300191 2. 東北農業大學資源與環境學院，哈爾濱 150030

通過盆栽實驗研究了抗性植物狼尾草根部丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)、抗壞血酸(AsA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽還原酶(GR)等氧化應激生理指標對不同濃度阿特拉津長期(48 d)脅迫的響應規律。結果表明：當阿特拉津脅迫濃度分別高于20 mg·kg-1和50 mg·kg-1時，狼尾草根系的MDA與Pro含量較對照組顯著升高(P < 0.05)；隨著阿特拉津脅迫濃度的增加，狼尾草根部SOD和GR活性呈先升高后降低的趨勢，其中當阿特拉津脅迫濃度為20 mg·kg-1時，SOD和GR活性達到最大值；供試植物根系中AsA含量與阿特拉津脅迫濃度呈正相關。綜上，中低濃度(≤ 20 mg·kg-1)阿特拉津處理沒有對狼尾草的根系產生明顯的氧化脅迫效應，狼尾草根系的上述抗氧化應激生理指標對于發揮阿特拉津抗性起著重要的作用。

阿特拉津；狼尾草；根系；氧化應激；長期脅迫

阿特拉津(2-氯-4-乙氨基-6-異丙氨基-1, 3, 5-三嗪)是一種三嗪類除草劑，別名莠去津，從1959年投產并推廣以來[1]，至今已有57年的使用歷史。其主要施用于玉米、甘蔗、高粱、茶園和果園等地，可防除1年生禾本科雜草和闊葉雜草，對某些多年生雜草也有較好的抑制作用[2]，因此其使用量每年正以20%的速率在遞增[3]。阿特拉津水溶性相對較強，其容易在雨水、灌溉水的作用下從土壤中遷移到地表水和地下水中，由于其結構較為穩定，可在生態環境中長期存在。有數據顯示：阿特拉津在水中的半衰期為42 d，而在土壤中的半衰期大約為382～742 d[4]。除具有上述遷移性與長殘留特性外，阿特拉津也具有一定的生物毒性。EL-Sheekh等[5]研究表明：當水體中阿特拉津的污染濃度達到15 μmol·L-1時，小球藻的生長即受到抑制。此外，其他的毒性試驗也表明，阿特拉津暴露與哺乳動物腫瘤的發生有一定的關系[6]，會干擾內分泌水平，導致肝癌等[7-8]。因此，阿特拉津對生態環境及各類生物健康所構成的威脅已引起人們的廣泛關注。近年來，有關阿特拉津對植物的毒理效應與相關機制的研究結果表明，阿特拉津脅迫可顯著的增加敏感植物體內自由基的數量。由于上述敏感植物體內過多的自由基不能及時被清除，因此導致敏感植物膜脂過氧化水平加劇，細胞膜的完整性遭到破壞、細胞質交換平衡被打破，抑制植物的光合作用，進而使敏感植物的一系列的生理生化代謝發生紊亂，最終使植物的生長受到抑制[9-12]。

當植物處于逆境條件時，會通過體內的一些代謝反應應答來降低或修復逆境造成的損傷，這種反應被認為是抗性植物耐受逆境脅迫的重要生理生化機制[13]。抗壞血酸作為一種非酶促小分子抗氧化劑，與其他小分子抗氧化劑和抗氧化酶(超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽還原酶(GR)等)共同調節著植物細胞內的活性氧水平，在對環境氧化脅迫響應的過程中起著至關重要的作用。同時，抗氧化劑數量及抗氧化酶活性的增加可以增強植物的抗逆性[14]。脯氨酸是植物在逆境脅迫條件下體內所積累的代謝產物，積累的脯氨酸除了作為植物細胞質內滲透調節物質外，還可以穩定生物大分子結構、降低細胞酸性，在一定程度上能夠提升植物對于逆境環境脅迫的耐受能力[15]。

狼尾草為多年生禾本科狼尾草屬，其具有株形優美、花序美麗、適應性強、根系發達、耐干旱等特點[16-17]。已有研究表明：只有在阿特拉津短期(28 d)脅迫下且濃度高于50 mg·kg-1處理，狼尾草生長及典型生理指標才逐漸受到顯著影響[18]。此外，與蘇丹草和黑麥草相比，狼尾草能夠快速降解其根際土壤中的阿特拉津。因此，狼尾草具有較強的修復阿特拉津污染土壤的潛在優勢[19]。然而，包括狼尾草在內的大多數抗性植物在修復污染土壤過程中均需與供試土壤中的污染持續接觸，因此深入探討污染物長期脅迫下抗性植物的生理響應對于更好地揭示植物修復機理尤為重要。目前，有關狼尾草在阿特拉津長期脅迫下的抗逆境生理指標研究的報道尚未明確。針對上述科學問題，本研究將著重考察阿特拉津長期脅迫條件下狼尾草根系典型氧化應激指標，如丙二醛、游離脯氨酸含量，抗氧化酶(SOD、GR)活性、非酶物質(AsA)含量等的響應規律，以期進一步的完善狼尾草耐受阿特拉津脅迫的相關理論。

1 材料與方法(Material and methods)

1.1 試驗材料

試驗所采用的供試植物為狼尾草屬中的美洲狼尾草P. americanum L. (cv. K. Schum)，供試植物種子購自江蘇興隆種子公司。阿特拉津原藥(純度≥ 97%)由山東農藥研究所提供。盆栽試驗所需土壤樣品采自黑龍江省阿城區舍利屯玉米地耕層(0～20 cm)，供試土壤中檢測無阿特拉津殘留。供試土壤(按質量比土壤∶蛭石=3∶1混合而成)的理化性質如表1所示。

1.2 試驗處理與幼苗培養

供試狼尾草種子在室溫條件下經蒸餾水浸泡4 h后，再用30%(V/V)H2O2溶液消毒處理10 min后將種子在恒溫氣候箱暗培養的條件下萌發過夜。將阿特拉津-丙酮溶液與適量的供試土壤攪拌均勻，使供試土壤中阿特拉津的終濃度分別為0、5、10、20、50、100、200 mg·kg-1。靜置于通風廚內待丙酮揮發完畢后，上述各阿特拉津添加濃度處理的供試土壤平均分裝于3個小型花盆中(即每個處理設置3個平行，每盆500 g供試土壤)開展后續盆栽試驗。選擇發芽一致的狼尾草種子播種于上述含有不同濃度梯度的阿特拉津土壤中，每盆20顆，并置于東北農業大學園藝站溫室內進行培養，溫度為(27±1) ℃/(20±1) ℃(日/夜)。幼苗培養過程中，每天觀察盆栽土壤的水分含量，通過稱重法添加補充適宜體積的Hoagland營養液[20]使上述盆栽土壤的含水量維持在土壤田間最大持水量的60%左右。于培養48 d后收獲狼尾草植株的根系用于測定其丙二醛(MDA)、游離脯氨酸(Pro)、抗壞血酸(AsA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽還原酶(GR)活性。

1.3 測定指標及方法

提取液的制備采用周啟星等[21]所使用的方法，即稱取0.3 g鮮狼尾草根，加入50 mmol·L-1預冷的磷酸緩沖液(pH 7.8)，研磨，定容至5 mL。4 ℃、10 000 g離心10 min，上清液用于測定MDA含量、SOD活性和GR活性。

MDA含量的測定采用硫代巴比妥酸法[22]，單位為mmol·g-1FW。

SOD活性采用NBT還原法進行測定[23]，在560 nm處測定吸光度，單位為U·g-1FW·min-1。

GR活性參考Foster and Hess[24]使用的方法進行測定，反應混合液包括1 mL的磷酸緩沖溶液，15 mmolL-1乙二胺四乙酸二鈉0.1 mL，10 mmolL-1疊氮化鈉0.1 mL，6.3 mmolL-1氧化型谷胱甘肽0.1 mL和0.1 mL的酶液并且用蒸餾水定容到2 mL，試管保溫3 min并且添加0.1 mL的還原型輔酶II，在340 nm測定2 min內吸光度的減少量來衡量酶活性的大小，單位為U·mg-1FW。

Pro含量的測定采用酸性茚三酮染色法[25]，稱取鮮狼尾草根0.3 g，加入質量分數為3%磺基水楊酸5 mL，在沸水浴中提取10 min，冷卻至室溫。吸取2 mL上述提取液，加入2 mL冰醋酸及2 mL質量分數為2.5%的酸性茚三酮，于沸水浴中加熱30 min，冷卻后加5 mL甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質，靜止分層取上清液。在520 nm處測定吸光度，單位為μg·g-1FW。

AsA含量的測定，狼尾草根采用液氮速凍后，使用質量分數為6%的三氯乙酸(TCA)迅速研磨成勻漿定容至25 mL，離心后取上清液用于測定AsA含量。測定過程參照Hodges等[26]報道的方法，在525 nm測定吸光度，單位為μg·g-1FW。

1.4 數據分析

本試驗結果數據均以平均值±標準差(mean ± SD)的形式表示。運用SPSS 19.0軟件進行方差分析，利用Duncan方法對不同處理間的數據進行顯著性分析(P < 0.05)。采用Origin 9.0軟件作圖。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 阿特拉津長期脅迫對狼尾草根系丙二醛(MDA)含量的影響

阿特拉津長期(48 d)脅迫條件下狼尾草根系MDA含量的變化情況如圖1所示。結果表明：隨著阿特拉津濃度的增加，供試植物狼尾草根系MDA含量呈現先升高后降低的趨勢，其中阿特拉津濃度為100 mg·kg-1時處理樣品根系中MDA含量最大。此外，阿特拉津濃度為50～200 mg·kg-1時處理樣品根系中MDA含量較空白處理及其他低濃度(< 50 mg·kg-1)處理顯著升高(P < 0.05)。

2.2 阿特拉津長期脅迫對狼尾草根系脯氨酸(Pro)含量的影響

不同濃度阿特拉津脅迫條件下供試植物根系Pro含量的變化情況如圖2所示。結果表明：隨著阿特拉津脅迫濃度的增加，狼尾草根系Pro含量呈逐漸升高的趨勢，即Pro含量變化與阿特拉津脅迫濃度呈顯著正相關(表2)。此外，阿特拉津脅迫濃度為100 mg·kg-1和200 mg·kg-1時處理樣品根系中Pro含量較對照組及其他低濃度(< 50 mg·kg-1)組相比顯著升高(P < 0.05)。

表1 供試土壤的理化性質Table 1 The physical and chemical properties of the test soil

圖1 阿特拉津長期脅迫對狼尾草根系丙二醛(MDA)含量的影響注：不同小寫字母表示處理組與對照之間的顯著性差異，P < 0.05，n=3。Fig. 1 Effect of long term atrazine exposure on malonaldehyde (MDA) content in root of P. americanum seedlingsNote: Different lower-case letters represent significant differences between the control and atrazine treatment, P < 0.05, n=3.

圖2 阿特拉津長期脅迫對狼尾草根系脯氨酸(Pro)含量的影響注：不同小寫字母表示處理組與對照之間的顯著性差異，P < 0.05，n=3。Fig. 2 Effect of long term atrazine exposure on proline (Pro) content in root of P. americanum seedlingsNote: Different lower-case letters represent significant differences between the control and atrazine treatment, P < 0.05, n=3.

圖3 阿特拉津長期脅迫對狼尾草根系超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響注：不同小寫字母表示處理組與對照之間的顯著性差異，P < 0.05，n=3。Fig. 3 Effect of long term atrazine exposure on superoxide dismutase (SOD) activity in root of P. americanum seedlingsNote: Different lower-case letters represent significant differences between the control and atrazine treatment, P < 0.05, n=3.

2.3 阿特拉津長期脅迫對狼尾草根系超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

供試植物狼尾草根系SOD活性在不同濃度阿特拉津長期脅迫條件下的變化趨勢如圖3所示。隨著阿特拉津脅迫濃度的增加，各試驗處理樣品根系中SOD活性呈現先升高后降低的趨勢。中低濃度(5～20 mg·kg-1)阿特拉津脅迫處理使狼尾草根系中的SOD活性較對照組明顯提升，其中阿特拉津脅迫水平為20 mg·kg-1時處理樣品根系SOD活性最大。伴隨著脅迫濃度的繼續升高，供試植物根系SOD活性逐漸降低，200 mg·kg-1阿特拉津處理樣品的SOD活性降至最低并明顯低于對照組。上述結果說明阿特拉津對狼尾草根部SOD活性的影響呈現“低濃度促進高濃度抑制”的規律。

2.4 阿特拉津長期脅迫對狼尾草根系谷胱甘肽還原酶(GR)活性的影響

供試植物種植48 d后，各污染脅迫處理條件下，其根中GR活性變化如圖4所示。0～20 mg·kg-1阿特拉津處理條件下，狼尾草根系GR活性保持在7.38～7.58 U·mg-1FW之間，差異不明顯。隨著阿特拉津脅迫濃度進一步增加(50～200 mg·kg-1)，狼尾草根系GR活性開始降低，保持在6.04～5.36 U·mg-1FW之間。盡管高濃度(50～200 mg·kg-1)阿特拉津處理在一定程度上會抑制狼尾草根部GR活性，但上述抑制程度均未達到顯著差異水平。

2.5 阿特拉津長期脅迫對狼尾草根系抗壞血酸(AsA)的影響

供試植物狼尾草根系AsA含量對不同濃度阿特拉津長期(48 d)脅迫的響應規律如圖5所示。與空白處理相比，低濃度(5～10 mg·kg-1)阿特拉津脅迫會使狼尾草根部AsA含量降低，伴隨著脅迫濃度的繼續增加，供試植物根系AsA的含量開始持續增加，當阿特拉津脅迫濃度為200 mg·kg-1時其含量達到最高值。

圖4 阿特拉津長期脅迫對狼尾草根系谷胱甘肽還原酶(GR)活性的影響注：不同小寫字母表示處理組與對照之間的顯著性差異，P < 0.05，n=3。Fig. 4 Effect of long term atrazine exposure on glutathione reductase (GR) activity in root of P. americanum seedlingsNote:Different lower-case letters represent significant differences between the control and atrazine treatment, P < 0.05, n=3.

3 討論(Discussion)

MDA是超氧自由基氧化生物膜時(膜質過氧化過程)所形成的產物，因此，其含量被認為是一種能夠很好地反映細胞膜被氧化損傷程度的指標[27]。研究發現，當狼尾草暴露在濃度為50 mg·kg-1的阿特拉津中時，其根系MDA含量較對照組相比顯著增加，說明上述脅迫水平可引起狼尾草根系細胞膜氧化損傷。結合我們前期研究[19]所觀察到的結果(濃度為100 mg·kg-1的阿特拉津處理才會使狼尾草葉片中MDA含量明顯增加)可以發現：狼尾草根系對阿特拉津較葉片相比更為敏感。分析其原因可能是由于狼尾草的根系是直接接觸并吸收阿特拉津的器官，故而根系受阿特拉津的影響較大。另有研究表明，一些抗性植物在適宜濃度(抗性范圍內)重金屬[28]、除草劑[14]等污染物脅迫下，其體內MDA含量能夠維持在比較穩定的水平。本研究結果與上述研究相吻合，即供試植物狼尾草經中低濃度(≤ 20 mg·kg-1)阿特拉津脅迫48 d后，其根系MDA含量較空白組相比僅表現為輕微升高，并未達到顯著差異水平，說明該污染脅迫水平并未對狼尾草根系造成明顯的氧化損傷。這可能與中低濃度阿特拉津脅迫激活了狼尾草根系的抗氧化防御系統或提高了細胞內的滲透壓調節物質有關。

圖5 阿特拉津長期脅迫對狼尾草根系抗壞血酸(AsA)含量的影響注：不同小寫字母表示處理組與對照之間的顯著性差異，P < 0.05，n=3。Fig. 5 Effect of long term atrazine exposure on ascorbic acid (AsA) content in root of P. americanum seedlingsNote: Different lower-case letters represent significant differences between the control and atrazine treatment, P < 0.05, n=3.

表2 MDA、Pro、AsA含量、SOD、GR活性，阿特拉津濃度之間相關性分析Table 2 Correlation analysis among MDA, Pro, AsA content, SOD, GR activity and atrazine concentration

注：*表示在0.05水平上顯著相關；**在0.01水平上顯著相關。

Note: * represent significant correlations at P < 0.05;**represent significant correlations at P < 0.01.

植物在非生物脅迫條件下會通過增加其體內脯氨酸含量來調節細胞滲透壓，清除活性氧自由基，緩解氧化還原電位升高等保持膜的完整性以及抗氧化酶和蛋白質的穩定性等，最終使其耐受逆境環境脅迫[29]。此外，已有報道證實，在環境脅迫下[30]植物體內積累的脯氨酸與環境脅迫的抗逆性有關，如水稻在缺水的條件下其葉片中脯氨酸濃度會大量增加[31]。本研究結果發現，狼尾草根系中的脯氨酸含量隨著阿特拉津脅迫濃度的增加呈逐漸升高的趨勢，說明供試植物所承受的污染脅迫程度在不斷地升高，這一研究結果與焦樹英等[32]、張懷山等[33]對狼尾草研究的結果相吻合。基于上述研究結果分析認為：狼尾草在中低濃度(0～50 mg·kg-1)阿特拉津脅迫下可通過增加其體內脯氨酸含量來使細胞質濃度增大或激活具有自由基清除作用的抗氧化防御系統，抵御阿特拉津脅迫對其造成的氧化損傷。

谷胱甘肽還原酶(GR)也是植物體內一種重要的抗氧化酶類，其主要的生理功能是將氧化型谷胱甘肽(GSSG)還原成還原型谷胱甘肽(GSH)，進而為活性氧的清除提供還原力，保護植物免受傷害[38]。同時，GR作為抗氧化酶類參與植物抗壞血酸谷胱甘肽循環并與SOD等酶相互作用，降低植物體內過量的活性氧，從而保護植物免受氧化脅迫的傷害[38-39]。本研究結果發現：供試植物根系的GR活性與SOD活性呈顯著正相關，與AsA含量呈顯著負相關(如表2)，這一結果充分說明GR、SOD活性與AsA含量間存在著密切的關系，在保護狼尾草根系耐受阿特拉津脅迫方面發揮重要作用。試驗結果表明在不同濃度阿特拉津脅迫下狼尾草根系GR活性變化遵循著先升高后降低的變化趨勢，分析認為狼尾草根系GR活性的升高是供試植物主動防御一定水平(≤ 20 mg·kg-1)阿特拉津脅迫的表現。這一機制與很多研究發現相類似，如Kornyeyev等[40]研究棉花在低溫脅迫下通過增加葉綠體GR活性來使植物葉片光化學比率增加從而減輕植物的氧化脅迫。Aghaei等[41]的研究結果也表明耐鹽土豆中GR活性要比鹽敏感土豆中GR活性高。

除了上述抗氧化酶系統在減輕活性氧對植物細胞膜及胞內生物大分子傷害方面發揮作用外，一些非酶促小分子抗氧化物質在上述脅迫防御方面也起到重要作用。抗壞血酸(AsA)作為一種小分子抗氧化劑能夠參與植物體系活性氧的代謝過程，同時也對植物體內的抗氧化酶具有一定的調節作用，進而有效地增強植物在逆境環境脅迫下的抗逆能力[14,42]。本研究發現，供試植物根系AsA含量與阿特拉津脅迫濃度呈顯著正相關(表2)，說明根系AsA在面對不同濃度阿特拉津脅迫水平時能夠靈敏有效地進行應答。此外，相關性分析表明：供試植物根系AsA含量與GR活性呈顯著的負相關(表2)，說明狼尾草根系中的AsA在阿特拉津污染脅迫時與抗氧化酶之間存在著較為密切的聯系。基于相關報道與研究結果，可以推測狼尾草根系內的上述非酶促小分子抗氧化物質與抗氧化酶類物質聯合作用在維持其阿特拉津抗性方面發揮一定的作用。

表2中的數據表明：膜質過氧化產物MDA含量與阿特拉津濃度呈正相關，同時MDA含量與SOD、GR活性存在明顯的負相關，與Pro、AsA含量呈正相關，說明本研究所探討的幾類生理指標能夠有效地表征供試植物狼尾草根系暴露于不同濃度阿特拉津時所產生的氧化脅迫。另外，由于中低濃度水平(≤ 20 mg·kg-1)阿特拉津脅迫并未對供試植物根系造成顯著的氧化損傷(表2)，說明上述指標間的相關作用對于維持供試植物表現出一定的阿特拉津氧化脅迫防御能力也將發揮著一定的作用。

致謝：感謝農業部環境保護科研監測所省部級重點實驗室開放基金對于本研究的資助。

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Oxidative Stress Response in Root ofPennisetumamericanumL.(cv. K. Schum) to Long Term Atrazine Exposure

Ma Bingbing2, Jiang Zhao1,2, Kehinde Olajide Erinle2, Cao Bo2, Li Jinmei2, Chen Yukun2, Zhang Ying2,*

1. Key Laboratory of Original Agro-environment Quality of Ministry of Agriculture, Tianjin Key Laboratory of Agro-environment and Safe-product, Tianjin 300191, China 2. School of Resources & Environment, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China

Received 6 February 2016 accepted 1 June 2016

Pennisetum americanum L. ( cv. K. Schum) has been reported as a phytoremediator which exhibits tolerance to atrazine. Atrazine is a herbicide that can effectively control broadleaf and grass weeds, but its use also causes serious pollution issues. To evaluate the influence of atrazine stress on the tolerant plant, an experiment was conducted focusing on the response of malondialdehyde (MDA), proline (Pro), ascorbic acid (AsA) content, superoxide dismutase (SOD) and glutathione reductase (GR) activities in the root of P. americanum exposed to different concentrations of atrazine during a long-term (48 d) period. The results showed that MDA and Pro contents in the root of the plant increased significantly under atrazine concentrations above 20 mg·kg-1and 50 mg·kg-1, respectively, when compared with the control (P < 0.05). With the increase in atrazine concentration, SOD and GR activities in the root of P. americanum first increased and then decreased; their activities reached the maximum when exposed to 20 mg·kg-1atrazine. AsA content in the root of the test plant and atrazine concentration were positively correlated. The above results demonstrated that low atrazine concentrations (≤ 20 mg·kg-1) did not show significant oxidative stress effect on the root of P. americanum. Physiological response characteristics of the antioxidant defense system in the root of the test plant played an important role for atrazine tolerance.

atrazine; Pennisetum americanum L. ( cv. K. Schum); root; oxidative stress; long term stress

農業部環境保護科研監測所省部級重點實驗室2015年度開放基金課題；國家自然科學基金(31300433)；黑龍江省高校創新團隊建設計劃項目(2013TD003)

馬兵兵(1989-)，女，碩士研究生，研究方向為污染物生態毒理效應，E-mail：492912579@qq.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: zhangyinghr@hotmail.com

10.7524/AJE.1673-5897.20160206001

2016-02-06 錄用日期：2016-06-01

1673-5897(2016)6-214-09

X171.5

A

張穎(1972—)，女，工學博士，教授，主要研究方向為農業環境保護。

馬兵兵, 姜昭, Kehinde Olajide Erinle, 等. 狼尾草根系對阿特拉津長期脅迫的氧化應激響應[J]. 生態毒理學報，2016, 11(6): 214-222

Ma B B, Jiang Z, Erinle K O, et al. Oxidative stress response in root of Pennisetum americanum L. (cv. K. Schum) to long term atrazine exposure [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(6): 214-222 (in Chinese)