羰基鎳急性染毒致大鼠淋巴細胞DNA損傷的劑量時間效應

蘆永斌，李宇，馬國煜，王秋英，劉靜，吳喜江，宣小強，徐東海，程寧,*

1. 蘭州大學公共衛生學院，蘭州 730000 2. 金川公司鎳鈷工業衛生研究所，金昌 737103 3. 蘭州大學甘肅省新藥臨床前研究重點實驗室，蘭州 730000

羰基鎳急性染毒致大鼠淋巴細胞DNA損傷的劑量時間效應

蘆永斌1，李宇3，馬國煜2，王秋英2，劉靜3，吳喜江2，宣小強2，徐東海2，程寧3,*

1. 蘭州大學公共衛生學院，蘭州 730000 2. 金川公司鎳鈷工業衛生研究所，金昌 737103 3. 蘭州大學甘肅省新藥臨床前研究重點實驗室，蘭州 730000

通過急性動物實驗觀察不同劑量羰基鎳(Ni(CO)4)染毒對大鼠淋巴細胞DNA的損傷程度。采用靜態方式對SD大鼠染毒30 min，以羰基鎳20 mg·m-3、135 mg·m-3和250 mg·m-3為低、中和高劑量染毒組，250 mg·m-3氯氣染毒組為陽性對照組，未染毒組為正常對照組。大鼠染毒后1 d、2 d、3 d和7 d分別收集樣本。采用單細胞凝膠電泳測量淋巴細胞DNA的損傷程度。通過對所得彗星圖像的尾長和Olive尾距(OTM)指標結果分析發現，大鼠淋巴細胞損傷程度隨著羰基鎳染毒劑量的增加而增加，4個時間點各劑量組間均有顯著差異(P<0.05)，4個劑量組各時間點均有顯著差異(P<0.05)，且隨時間變化有一定的變化規律，損傷程度在3 d時達最大，而后緩慢下降；在高劑量組染毒和染毒后3 d，損傷程度達到最大。急性羰基鎳染毒可致淋巴細胞DNA顯著損傷，且存在明顯的劑量、時間和交互效應。

羰基鎳；大鼠；淋巴細胞；DNA損傷；劑量效應關系；時間效應關系；交互效應關系

羰基鎳是鎳和一氧化碳在一定壓力下反應而生成的一種金屬化合物，它以蒸氣形態迅速由呼吸道吸入，造成急性中毒反應[2]。動物實驗表明急性吸入羰基鎳肺臟損傷最為嚴重[3]，其次為肝臟等臟器[4]。羰基鎳急性中毒對外周血淋巴細胞的損傷效應國內外報道很少[5]。有研究表明Ni2+主要作用于遺傳物質，引起DNA氧化損傷[6]。魏巧妙等[7]的研究也顯示鎳及其化合物導致DNA損傷，Ni2+通過與細胞質、細胞核中不同配體形成多種復合物，影響細胞功能，這些復合物通過鐵離子催化Fenton反應，抑制DNA損傷修復酶的活性，從而引起DNA的氧化損傷。本實驗利用單細胞凝膠電泳(SCGE)觀測不同劑量羰基鎳染毒后不同時間點大鼠外周血淋巴細胞DNA損傷情況，分析其劑量及時間變化規律。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗方法

SPF級SD大鼠170只，雌雄各半，體重180～200 g(西安交通大學提供，許可證號SCXK (陜)2007 -001)。按照性別隨機分成4個組，由一個正常對照組(10只)和4個染毒組(40只/組)。根據大鼠靜態吸入羰基鎳30 min半數致死濃度的5%、33.8%和62.5%進行低、中、高劑量羰基鎳染毒，濃度分別為20 mg·m-3、135 mg·m-3和250 mg·m-3；氯氣染毒組(250 mg·m-3)為陽性對照組；正常對照組不做處理。靜態方式染毒30 min。分別于染毒后1 d、2 d、3 d、和7 d共4個時間點處死取材。

1.2 單細胞凝膠電泳技術(SCGE)

按單細胞凝膠電泳實驗進行操作和分析[8]，對于實驗條件進行了改良，改良部分包括膠體調整為底膠層、細胞層低熔點膠層、低熔點膠層，具體儀器及操作過程詳見文獻[9]。

1.3 統計學處理

表1 各染毒組不同染毒時間大鼠淋巴細胞DNA的尾長(μm)Table 1 Tail moment of lymphocyte DNA of the rat in every groups at different times

注：a，與正常對照組比較，P<0.05；b，與氯氣染毒組比較，P<0.05。

Note: a, Compared with the control group, P<0.05; b, Compared with the positive control group, P<0.05.

2 結果(Results)

2.1 羰基鎳對淋巴細胞的損傷情況

從表1可以看出，在4個時間點，不同羰基鎳染毒組尾長隨著劑量的增加而增加；各染毒組在3 d時尾長達最大，7 d又有所下降，提示存在劑量效應關系。經LSD法多重比較可以看出不同羰基鎳染毒組與正常對照組的尾長之間均有差異(P<0.05)。陽性對照組染毒后，尾長先增加后降低，2 d時達到最大。

從表2中可以看出，在4個時間點，不同羰基鎳染毒組Olive尾矩(OTM)隨著劑量的增加而增加；各染毒組OTM在3 d達到最大，7 d又有所下降，提示存在劑量效應關系。經LSD法多重比較可以看出不同羰基鎳染毒組與正常對照組的OTM均數之間均有差異(P<0.05)。氯氣對照組染毒后，OTM先增加后降低，2 d達到最大。

2.2 羰基鎳染毒劑量與尾長和OTM的劑量效應關系

從表3可以看出，在同一時間點，羰基鎳染毒劑量與尾長之間呈線性相關，隨著染毒劑量增加尾長也逐漸增加，提示DNA損傷程度逐漸增強，存在明顯的劑量效應關系；染毒劑量與OTM之間呈曲線相關，在一定染毒劑量下，隨著染毒劑量增加OTM

表2 各染毒組不同染毒時間大鼠淋巴細胞DNA的Olive尾矩Table 2 Olive tail moment of lymphocyte DNA of the rat in every groups at different times

注：a，與正常對照組比較，P<0.05；b，與氯氣染毒組比較，P<0.05。

Note: a, Compared with the control group, P<0.05; b, Compared with the positive control group, P<0.05.

表3 羰基鎳染毒劑量與尾長和Olive尾矩的劑量效應關系Table 3 Dose-response relationships between nickel carbonyl dose and tail moment and Olive tail moment

表4 羰基鎳染毒時間與尾長和Olive尾矩的時間效應關系Table 4 Time-response relationships between nickel carbonyl infected time and tail moment and Olive tail moment

逐漸增加，提示DNA損傷程度逐漸增強，存在明顯的劑量效應關系。在7 d時OTM不再隨著劑量的增加而增加，而是出現緩慢下降狀態。

2.3 羰基鎳染毒后時間與尾長和OTM的時間效應關系

從表4可以看出，在同一染毒組中，羰基鎳染毒后時間與尾長呈曲線相關，存在時間效應關系，分別在0～0.75、0～2.31、0～2.32 d內，尾長逐漸增加，提示淋巴細胞DNA損傷程度逐漸增強；染毒時間與OTM呈曲線相關，存在時間效應關系，分別在0～2.46、0～1.88、0～2.41、0～2.31 d內，OTM逐漸增加，提示DNA損傷程度逐漸增強。

2.4 染毒劑量與時間的交互作用

在尾長和OTM指標測定中，染毒后時間和染毒劑量之間存在明顯的交互作用，差異有統計學意義(F=30.507、P=0.000，F=38.427、P=0.000)。在3 d和高劑量組中，尾長和OTM均達到最大，提示損傷程度達到最大；在7 d和高劑量組中，尾長和OTM均達到最小，提示損傷程度降到最小，見圖1。

圖1 染毒劑量和時間的交互作用Fig. 1 Interaction effect relationships between dose and time infected

3 討論(Discussion)

羰基鎳是急性毒性最強的一類鎳化合物[10]。短時間大量吸入可發生急性中毒，累及機體多種重要器官。王寧等[11]研究發現，急性羰基鎳中毒對大鼠肺、肝、腎靶器官細胞的DNA均有一定的損傷作用。劉靜等[6]的研究提示鎳化合物導致明顯的DNA單鏈斷裂發生，表明DNA或蛋白質受到損傷。M’Bemba-Meka等[12]實驗證明，鎳化合物導致人體血液淋巴細胞的染色體和核染色質DNA鏈斷裂。SCGE是一種快速檢測單細胞DNA完整性的實驗技術。SCGE中彗尾的出現是細胞DNA斷裂的一個標志，能反映DNA損傷程度和損傷特征[13]。細胞DNA受損愈重，產生的斷鏈或斷片就愈多，其斷鏈或斷片也就愈小，在電場作用下遷移的DNA量多，遷移的距離長，表現為彗星尾長增加和彗星尾部熒光強度增強。本實驗對羰基鎳急性中毒大鼠淋巴細胞DNA損傷的彗星圖像進行分析，統計了彗星尾長和OTM這2個指標，探討羰基鎳急性中毒對大鼠淋巴細胞DNA損傷，以及劑量和時間對其損傷的影響。

本實驗結果顯示大鼠吸入不同劑量的羰基鎳后，對淋巴細胞DNA有損傷作用，呈明顯的劑量和時間效應關系。以高劑量組的損傷作用最為明顯。在染毒后1 d、2 d和3 d，低、中、高、氯氣對照組損傷程度均高于正常對照組，呈明顯的劑量效應關系，隨著劑量增加，淋巴細胞DNA損傷加重，且在高劑量組(250 mg·m-3)時損傷程度達到最大。Werfel等[14]研究顯示，接觸鎳煙塵的電焊工人淋巴細胞DNA鏈斷裂情況與Ni2+的濃度呈正相關，與本研究結論一致。這可能是大劑量的羰基鎳進入體內后，對機體產生嚴重損傷。本實驗結果還提示染毒后時間對DNA損傷作用的影響明顯，低、中和高劑量組在染毒后3 d損傷程度最大；從變化趨勢上看，染毒后3 d損傷達最高，7 d又有所下降，但尚未恢復至正常水平，原因可能是一定時間后排泄系統加大毒物排泄，毒物在體內的分布減少所致。有研究報道顯示羰基鎳無明顯蓄積性，吸入后6 h內即有30%～40%由呼氣中排出，吸入后1 d，體內僅存留吸入量的17%，鎳還可以隨糞和尿排出[15]。急性羰基鎳中毒后臨床病程中，死亡病例一般發生于中毒后3 d之內，存活者中毒癥狀也以3 d內最重，7 d后癥狀消失，提示存在時間效應關系，這與本實驗結論一致。氯氣對照組染毒后，損傷程度先加重后降低，2 d達到最大值，且損傷程度也低于羰基鎳染毒高劑量組，提示羰基鎳的毒性及持續時間強于氯氣。通過上述2個指標觀察到羰基鎳可以引起淋巴細胞DNA損傷，且隨著劑量增加損傷程度也隨之增加。

致謝：感謝耶魯大學的Cynthia Chan在文章修改中給予的幫助。

[1] Sunderman F W. A pilgrimage into the archives of nickel toxicology [J]. Annals of Clinical & Laboratory Science, 1989, 19: 1-16

[2] 時海英, 王寧, 王秋英, 等. 急性羰基鎳中毒大鼠肺臟Na+-K+ATP酶活性及其基因表達的觀察[J]. 衛生研究, 2013, 42: 818-821

Shi H Y, Wang N, Wang Q Y, et al. Observation on both Na+-K+ATPase activity and expression of Na+-K+ATPase α1mRNA in lung tissues of rats acute poisoned with nickel carbonyl [J]. Journal of Hygiene Research, 2013, 42: 818-821 (in Chinese)

[3] 周巧玲, 閆銘峰, 王秋英, 等. 大鼠急性羰基鎳中毒抗超氧陰離子變化的實驗觀察[J]. 工業衛生與職業病, 2013, 39(6): 332-335

Zhou Q L, Yan M F, Wang Q Y, et al. Changes of anti-superoxide anion during acute nickel carbonyl poisoning of rats in an experimental observational study [J]. Industrial Health and Occupaiona Disease, 2013, 39(6): 332-335 (in Chinese)

[4] Seet R C, Johan A, Teo C E, et al. Inhalational nickel carbonyl poisoning in waste processing workers [J]. Chest, 2005, 128: 424-429

[5] 王輝, 程寧. 鎳化合物致氧化應激損傷機制的研究進展[J]. 工業衛生與職業病, 2014, 40(5): 390-392

[6] 劉靜, 程寧. 鎳化合物細胞毒理學研究的某些進展[J]. 工業衛生與職業病, 2010, 36(5): 306-309

[7] 魏巧妙, 程寧. 鎳及其化合物DNA損傷的研究進展[J]. 工業衛生與職業病, 2015, 41(6): 471-473

[8] 張遵真, 衡正昌. 用單細胞凝膠電泳技術檢測鉻和砷化物的DNA損傷作用[J]. 中華預防醫學雜志, 1997, 31(6): 365-367

[9] 李宇. 大鼠急性羰基鎳中毒的細胞與分子機制的實驗研究[D]. 蘭州: 蘭州大學, 2009: 9-14

Li Y. Research on the cell and molecule mechanisum of acute toxicity of nickel carbonyl in rats [D]. Lanzhou: Lanzhou University, 2009: 9-14 (in Chinese)

[10] Proietti L, Ferrara A, Freni V, et al. Adverse reaction following suspected inhalation of nickel tetracarbonyl: Case report [J]. LaMedicina del Lavoro, 2005, 96: 155-161

[11] 王寧, 程寧, 王秋英. 急性羰基鎳中毒大鼠不同臟器Ca(2+)-Mg(2+)-ATP酶活性的動態觀察[J]. 衛生研究, 2015, 44(2): 341-346

[12] M’Bemba-Meka P, Lemieux N, Chakrabarti S K. Nickel compound-induced DNA single-strand breaks in chromosomal and nuclear chromatin in human blood lymphocytes in vitro: Role of oxidative stress and intracellular calcium [J]. Mutation Research/genetic Toxicology & Environmental Mutagenesis, 2005, 586: 124-137

[13] Kassie F, Parzefall W, Knasmüller S. Single cell gel electrophoresis assay: A new technique for human biomonitoring studies [J]. Mutation Research/Fundamental & Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 2000, 463: 13-31

[14] Werfel U, Langen V, Eickhoff I, et al. Elevated DNA single-strand breakage frequencies in lymphocytes of welders exposed to chromium and nickel [J]. Carcinogenesis, 1998, 19: 413-418

[15] 嚴永華, 杜鵑, 吳曉琴, 等. 羰基鎳中毒[J]. 工業衛生與應急救援, 2002, 20: 221-223

Yan Y H, Du J, Wu X Q, et al. Nickel carbonyl poisoning [J]. Industrial Health & Emergency Rescue, 2002, 20: 221-223 (in Chinese)

◆

Dose-Response and Time-Effect Relationships between Lymphocyte DNA Damage of Rats Poisoned with Nickel Carbonyl

Lu Yongbin1, Li Yu3, Ma Guoyu2, Wang Qiuying2, Liu Jing3, Wu Xijiang2, Xuan Xiaoqiang2, Xu Donghai2, Cheng Ning3,*

1. School of Public Health, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China 2. Jinchuan Nickel and Cobalt Industrial Health Institute, Jinchang 737103, China 3. Provincial Key Laboratory of Pre-clinical Study of New Pharmaceuticals, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China

Received 3 May 2016 accepted 26 June 2016

To investigate DNA damage in SD rat peripheral blood lymphocytes under different doses of nickel carbonyl, SD rats were exposed through inhalation of 20, 135, 250 mg·m-3nickel carbonyl (Ni(CO)4) for 30 minutes. Rats poisoned by 250 mg·m-3chlorine gas served as the positive control group, and healthy SD rats served as the control group. After 1 day (d), 2 d, 3 d, and 7 d inhalation, bone marrow samples were taken from the rats. Single cell gel eletrophoresis (SCGE) was used to measure comet tail moment, and Olive tail moment was measured from the comet image, to determine lymphocytes DNA damage. Lymphocytes DNA damage increased with increasing Ni(CO)4dose. The significant differences were observed in different doses and times (P<0.05). Extreme DNA damage was found after 3 d and decreased after 7 d in Ni(CO)4groups. The damage increased with inhalation time. Extreme DNA damage was found at the highest dose and 3 d exposure. Acute nickel carbonyl could induce lymphocyte DNA damage in dose-response, time-effect and interaction effect manner.

nickel carbonyl; rat; lymphocyte; DNA damage; dose-response relationship; time- effect relationship; interaction effect relationship

金川集團公司與蘭州大學產學研合作項目

蘆永斌(1989-)，男，碩士，研究方向為流行病與衛生統計學，E-mail: luyb14@lzu.edu.cn

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: chengn@lzu.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160503003

2016-05-03 錄用日期：2016-06-26

1673-5897(2016)6-277-05

X171.5

A

程寧(1959—)，男，教授，研究方向為安全性評價。

蘆永斌, 李宇, 馬國煜, 等. 羰基鎳急性染毒致大鼠淋巴細胞DNA損傷的劑量時間效應[J]. 生態毒理學報，2016, 11(6): 277-281

Lu Y B, Li Y, Ma G Y, et al. Dose-response and time-effect relationships between lymphocyte DNA damage of rats poisoned with nickel carbonyl [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(6): 277-281 (in Chinese)