水環境中重金屬銅暴露下青鳉魚的行為響應

梁鴻，劉勇，饒凱鋒，馬梅，許旺，唐亮，馬嵩，潘曉峰，陳慧明，楊瑩瑩

1. 深圳市環境監測中心站，深圳 518049 2. 中科水質(無錫)環境技術有限公司，無錫 214024 3. 中國科學院生態環境研究中心 環境水質學國家重點實驗室，北京 100085 4. 中國科學院生態環境研究中心 中國科學院飲用水科學與技術重點實驗室，北京 100085 5. 中國科學院大學資源與環境學院，北京 101407 6. 廣東省環境監測中心，廣東 510308

水環境中重金屬銅暴露下青鳉魚的行為響應

梁鴻1，劉勇2,*，饒凱鋒3,#，馬梅4,5，許旺1，唐亮2，馬嵩1，潘曉峰1，陳慧明6，楊瑩瑩2

1. 深圳市環境監測中心站，深圳 518049 2. 中科水質(無錫)環境技術有限公司，無錫 214024 3. 中國科學院生態環境研究中心 環境水質學國家重點實驗室，北京 100085 4. 中國科學院生態環境研究中心 中國科學院飲用水科學與技術重點實驗室，北京 100085 5. 中國科學院大學資源與環境學院，北京 101407 6. 廣東省環境監測中心，廣東 510308

采用生物行為傳感器監測青鳉魚在重金屬銅暴露下的行為數據，分析不同暴露濃度(20、10、5、1和0.1 TU)下青鳉魚的行為響應。20、10、5、1和0.1 TU的暴露濃度下青鳉魚對重金屬污染的行為反應模式符合環境脅迫閾值模型，且不同濃度梯度重金屬對青鳉魚產生不同的行為毒性效應。利用重金屬作用下青鳉魚的行為變化來研究重金屬環境脅迫導致的生物行為響應機制，從而得到重金屬暴露下生物行為的實時變化過程和趨勢，可對水環境生態系統質量進行綜合評價。

重金屬；銅；青鳉魚；行為響應；水質評價

近年來突發性水污染事故的發生，如污染源事故性排放、工業化學品運輸泄漏以及人為投放有毒物質等事件，給水生態安全和公眾健康造成了極大的危害[1-2]。環境污染物中銅是常見的重金屬有毒污染物，主要來自冶煉加工、機械制造及電鍍、化工、礦山開采等的污染排放[3]。有毒污染物是指一類對生物體能夠產生毒害影響的污染物，可能導致生物體生理、生態改變等一系列危害。通過生物傳感器可監測水體內指示生物不同水平上的生物學參數變化，從而反映水質綜合毒性，因此生物傳感器可以用于有毒物質污染事件的在線監測和預警[4]。

在一定的環境脅迫下，生物對外界環境變化進行適應的首要體現在生物行為反應上。所以當外界環境因子發生改變時，生物運動行為的改變是一種主動的“逃避”方式，并通過行為調節機制保持生物體內在生理環境的穩定，以快速適應外界環境變化。因此，生物行為狀態的由強至弱或由弱至強是外界環境變化導致其死亡前的早期診斷指標。如果水生生物異常的行為改變能被監測到，則說明外界水環境內關系到水生生物生存的因子的變化接近或超出了其生存的正常范圍，并可由此對水質變化程度進行分析[5]。

基于生物行為生態學的水質生物預警監測技術是通過生物行為傳感器監測水體內受試水生生物行為變化，可以進行連續實時在線監測，以實現水環境污染事故的快速分析，對水質的變化進行監測預警。由于生物監測技術的簡便快捷，歐美國家在此基礎上開發水質在線生物監測設備，最早運用是在歐洲，德國從1990年開始就先后將該系統成功地運用于多個河流。目前國內在線生物監測技術包括發光菌監測技術[6]、水溞監測技術、藻類監測技術和魚類監測技術等，盡管起步較晚，但由于其具有簡便快捷、直觀的技術優勢并適合我國水環境污染現狀，已經逐步應用于水體突發性污染事故的在線監測預警。水環境水質生物監測預警體系方面的研究多側重于飲用水源水，一些城市已初步構建了水源水在線監測預警系統[7]。

本研究通過生物行為傳感器監測受試生物青鳉魚暴露于被監測水體內的行為變化，獲取青鳉魚在污染物暴露下的特征性行為模式。青鳉魚(Oryzias latipes)屬于鳉科魚種，個體小對污染物敏感性高，生命周期一般在2年左右，可以耐受較寬的溶解氧和水溫范圍[5]。自從Denny[8]對青鳉魚的繁殖管理與毒理實驗操作進行了規范化后，由于其具有非常充分的生物學背景研究基礎，青鳉魚作為毒理學標準模式生物應用廣泛[9]，為國際標準化組織認定的毒理學實驗標準物種之一，其中中國科學院生態環境研究中心已利用青鳉魚制定多個水質評價標準。目前，水質監測技術已經將青鳉魚的行為變化經作為一個重要指標進行應用[10]。

本研究利用重金屬作用下青鳉魚的行為變化來分析的環境脅迫導致的生物行為變化機制，基于在實際水質環境下青鳉魚的行為反應過程，發展重金屬環境脅迫下生物行為脅迫閾值模型。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 監測系統

采用生物行為傳感器對青鳉魚行為數據進行提取。由于不同的模式生物個體大小不同，需要匹配不同型號生物行為傳感器：標準模式青鳉魚采用直徑為6 cm、高20 cm的雙層生物行為傳感器。其中生物行為傳感器為中國科學院生態環境研究中心與中科水質(無錫)環境技術有限公司聯合研制，并形成擁有自主知識產權的“水質在線生物安全預警系統(BEWs)”的產業化能力，已在我國飲用水水源地廣泛應用，為飲用水水質安全提供安全保障。

1.2 生物培養

標準模式青鳉魚采用流水繁殖，繁殖溫度為25 ℃±2 ℃，光照周期16 h∶8 h。幼魚孵出2 d后，需投喂剛孵出的豐年蝦幼蟲作為開口餌料，每天早晚進行2次投喂。2周后可配合飼料投喂，每天投喂2次。養殖密度保持在每升水2～3條[11]。本實驗采用中科水質(無錫)依據毒理學規范培養的性成熟青鳉魚不久的成魚，魚齡為3月齡。

1.3 實驗設計

本實驗采用流水環境下的生物行為傳感器(圖1)提取青鳉魚行為數據，傳感器分為雙層，上層為暴露層，放置受試生物，下層為行為數據背景層，不放置受試生物。

在污染物流水暴露實驗過程中，選取五水合硫酸銅作為實驗藥品。將重金屬銅對青鳉魚的48 h半數致死劑量(50% lethal concentration of 48 h)，LC50, 48 h作為1個毒性單位(toxic unit, TU)[12]，實驗設定5個濃度梯度，分別為20、10、5、1和0.5 TU。每個濃度梯度污染物采用8通道平行生物行為傳感器進行測試。

在實驗中，采用生物綜合行為強度(behavior strength)來反映其行為變化[12]，在青鳉魚流水暴露實驗過程中，每通道保持3條2.5～3.0 cm體長的健康性成熟青鳉魚。實驗過程中不投加食物，并控制每個通道水體流速2 Lh-1[12-14]。

實驗用水為曝氣充分的自來水，溫度25 ℃±2 ℃，溶解氧>8 mgL-1，硬度以CaCO3計，(250±25) mgL-1，控制光照周期16 h∶8 h(白天∶黑夜，白天04:00—20:00，夜間21:00—04:00)，為保證各濃度梯度生物行為監測前的平行，每次濃度梯度監測實驗開始于第1天上午16:00，第3天上午16:00結束[14]。每個濃度梯度暴露實驗開始前，需將青鳉魚置于充滿無污染水的生物行為傳感器中適應2 h后通入所需濃度梯度重金屬溶液，直至48 h后實驗結束。

圖1 生物行為傳感器Fig. 1 Biological behavior sensor

2 結果(Results)

由靜水暴露實驗得出：重金屬Cu2+對青鳉魚48 h半數致死計量為4.8 mgL-1。在本研究中，以Cu2+的LC50,48 h作為青鳉魚行為毒性的1個毒性單位(1 TU)研究不同濃度梯度污染物暴露下的青鳉魚的行為強度變化響應。

不同濃度梯度Cu2+作用下青鳉魚48 h的行為強度變化如圖2所示。青鳉魚暴露于0.1 TU濃度Cu2+中的行為強度變化結果中，在暴露開始階段青鳉魚行為強度基本保持在0.2至0.8之間，但其最大值為0.1或0.9左右，最小值位于0.5左右，尤其在暴露時間4 h左右和32 h左右，青鳉魚行為強度有明顯降低過程。低濃度暴露梯度下青鳉魚行為強度變化的主要原因在于青鳉魚內在行為變化的周期節律現象，即生物鐘現象(biological clock)[15-17]。因此，在不同濃度梯度(尤其是小于1 TU)的重金屬作用下青鳉魚的行為變化模式分析中，應該將青鳉魚行為變化中周期節律現象(生物鐘)的影響作為重要參考。

隨著暴露濃度梯度的升高，各個濃度梯度之間青鳉魚行為強度變化明顯。在高濃度梯度(5、10和20 TU)暴露過程中，青鳉魚行為強度出現一個短暫升高后又逐漸降低的變化過程后，迅速趨于0.5(死亡)。在低濃度梯度(1和0.1 TU)暴露中，青鳉魚行為變化過程以自我適應為主(行為調整過程)，并且其自我適應過程具有明顯周期節律現象(生物鐘)。但是，在暴露后期該低濃度梯度中青鳉魚的行為強度出現降低趨勢，這是由于行為毒性累積造成的。

在不同濃度梯度的48 h的暴露中，青鳉魚行為強度變化與暴露時間具有明顯規律性變化[12]。在圖2中，20 TU濃度梯度暴露初期，青鳉魚行為強度維持在0.2至0.8之間，但隨暴露時間增加，尤其在1 h以后，青鳉魚行為強度降低明顯，在此過程中，自我適應行為過程不明顯。大約在2 h左右，行為強度接近零，直至死亡。而在10 TU和5 TU的濃度梯度暴露過程中，青鳉魚行為強度降低明顯所需時間分別為2 h和3 h之間，同時，自我適應行為過程明顯多于20 TU濃度梯度。

暴露濃度梯度越高，青鳉魚行為變化過程越劇烈，而隨暴露濃度梯度降低，青鳉魚行為自我適應過程增加。故在一定的暴露時間內，青鳉魚行為強度變化過程與水環境內污染物濃度密切相關。

3 討論(Discussion)

從青鳉魚行為強度變化過程與暴露時間和暴露濃度綜合分析：在重金屬銅暴露濃度固定的情況下，青鳉魚行為強度變化隨暴露時間出現與之對應的行為規律性變化過程；而在同樣48 h暴露過程中，行為強度變化與暴露濃度有明顯的劑量效關系。同時，當外界環境出現污染之后，青鳉魚行為變化首先表現在自我適應過程，直至毒性累積產生明顯行為毒性效應[14]。在青鳉魚的自我適應過程中，外界環境污染形成的環境脅迫閾值是青鳉魚產生行為變化的主因。

圖2 不同濃度梯度Cu2+暴露下青鳉魚48 h行為強度變化注：以Cu2+的LC50,48 h作為青鳉魚行為毒性的1個毒性單位(1 TU)。Fig. 2 The effects of different concentration of Cu2+ on the behavior strength of medaka in 48 hours exposureNote: 1 TU was based on the LC50,48 h of Cu2+ for the behavior strength of medaka.

圖3 環境脅迫閾值模型[18]Fig. 3 Environment stress model[18]

青鳉魚行為變化過程與暴露時間和暴露濃度之間的關系，符合如圖3所示環境脅迫閾值模型[18]。

環境脅迫閾值模型中，暴露污染物濃度產生的環境脅迫是影響青鳉魚行為強度變化過程(回避行為)持續的時間長短主要原因，并具有明顯規律性，并決定了青鳉魚接觸污染環境后行為增強的持續時間和強度[18]。環境脅迫越大，回避行為強度越高，過程越短，脅迫閾值1對青鳉魚產生的壓力越大，在自我適應失效以后，青鳉魚的行為毒性效應會直接出現。在較強且持續的環境脅迫下，在經歷行為自我適應過程，青鳉魚經過行為調整后，脅迫閾值2將會作用于青鳉魚行為反應。所以，青鳉魚行為調整，尤其是在行為增強產生以后，既受環境污染物濃度影響，又與污染物暴露時間相關[18-19]。

通過本研究利用重金屬作用下青鳉魚的行為變化來分析研究環境脅迫導致的生物行為響應機制，發展一定環境脅迫下生物行為脅迫閾值模型，豐富水質在線連續實時生物監測預警的生物毒性數據模型。因此將在一定環境污染脅迫下受試水生生物行為生態學變化與正常水體內受試水生生物行為生態學變化進行解析，得到一定環境脅迫下受試水生生物運動行為的規律性變化，并在此基礎上對生物行為變化趨勢進行模式識別和實時解析，從而得到生物相對行為的實時變化過程和趨勢，能夠對水環境生態系統質量進行綜合性評價。

[1] 洪維民. 加強預警監測體系建設 高效應對突發生態環境問題[J]. 環境監測管理與技術, 2009, 21(2): 1-3, 11

Hong W M. Strengthening warning system of environmental monitoring efficiently dealing with local eco-environmental emergency [J]. The Administration and Technique of Environmental Monitoring, 2009, 21(2): 1-3, 11 (in Chinese)

[2] 邱祖楠. 完善應急監測網絡 提高環境管理能力[J]. 環境監測管理與技術, 2008, 20(2): 4-6

Qiu Z N. Perfecting Guangdong emergency monitoring network for improvement of environmental management capability [J]. The Administration and Technique of Environmental Monitoring, 2008, 20(2): 4-6 (in Chinese)

[3] 曾麗璇, 陳桂珠, 余日清, 等. 水體重金屬污染生物監測的研究進展[J]. 環境監測管理與技術, 2003, 15(3): 12-15

Zeng L X, Chen G Z, Yu R Q, et al. Review of biological monitoring about water heavy metal pollutants [J]. The Administration and Technique of Environmental Monitoring, 2003, 15(3): 12-15 (in Chinese)

[4] 王子健, 饒凱鋒. 突發性水源水質污染的生物監測、預警與應急決策[J]. 給水排水, 2013, 39(10): 1-3

[5] Putman R J, Wratten S D. Principles of Ecology [M]. London and Canberra: Groom Helm LTD, 1984: 200-201

[6] 黃燦克. 發光細菌毒性法在水質評估與預警中的應用研究[D]. 杭州: 浙江大學, 2014: 12-16

Huang C K. The application of photobacteria toxicity detection method in water quality [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2014: 12-16 (in Chinese)

[7] 張奇磊, 高琦, 沈琰. 飲用水源地水質預警系統的建立和應用研究[J]. 環境科學與管理, 2014, 39(2): 123-125

Zhang Q L, Gao Q, Shen Y. Construction and application of water quality warning system in drinking water source [J]. Environmental Science and Management, 2014, 39(2): 123-125 (in Chinese)

[8] Denny J S. Guidelines for the Culture of Fathead Minnows for Use in Toxicity Tests. EPA /600/3-87/001. [R]. Duluth, Minn.: Environmental Research Laboratory, 1987

[9] Yamamoto T. Medaka (Killifish):Biology and Strains Keigaku [M]. Tokyo: Keigaku Pub Co, 1975: 22

[10] Shioda T, Wakabayashi M. Effect of certain chemicals on the reproduction of medaka (Oryzias latipes) [J]. Chemosphere, 2000, 40: 239-243

[11] Teather K, Harris M, Boswell J, et al. Effects of Acrobat MZ and Tatto C on Japanese medaka (Oryzias latipes) development and adult male behavior [J]. Aquatic Toxicology, 2001, 51: 419-430

[12] 劉勇, 付榮恕, 等. 2種有機磷農藥聯合脅迫下日本青鳉的逐級行為響應[J]. 環境科學, 2010, 31(5): 1328-1332

Liu Y, Fu R S, et al. Stepwise behavioral responses of the Japanese medaka under the joint stress of two organophosphorus pesticides [J]. Environmental Science, 2010, 31(5): 1328-1332 (in Chinese)

[13] Guilhermino L, Diamantino T, Silva M C, et al. Acute toxicity test with Daphnia magna: An alternative to mammals in the prescreening of chemical toxicity [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2000, 46: 357-362

[14] 劉勇, 張高生, 陳琳琳, 等. 2種除草劑聯合脅迫下日本青鳉的逐級行為響應[J]. 生態毒理學報, 2010, 5(1): 32-37

Liu Y, Zhang G S, Chen L L, et al. The stepwise behavioral responses of the Japanese medaka under the joint stress of two herbicides[J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2010, 5(1): 32-37 (in Chinese)

[15] Binkley S A, Riebman J B, Reilly K B. The pineal gland: A biological clock in vitro [J]. Science, 1978, 202: 1198-1120

[16] Wang G, Fu C, Li J, et al. Circadian rhythms and different photoresponses of Clock gene transcription in the rat suprachiasmatic nucleus and pineal gland [J]. Acta Physiologica Sinica, 2006, 58: 359-364

[17] 劉勇. 環境污染物聯合脅迫下水生生物行為響應研究[D]. 濟南: 山東師范大學, 2010: 34-37

Liu Y. Study on behavioral responses of the aquatic organisms under the joint stress of environmental pollutants[D]. Jinan: Shandong Normal University, 2010: 34-37 (in Chinese)

[18] Gerhardt A, de Bisthoven L J, Mo Z, et al. Short-term responses of Oryzias latipes (Pisces: Adrianichthyidae) and Macrobrachium nipponense (Crustacea: Palaemonidae) to municipal and pharmaceutical wastewater in Beijing, China: Survival, behavior, biochemical biomarkers [J]. Chemosphere, 2002, 47: 35-47

[19] 劉勇, 張高生, 陳琳琳, 等. Cd2+與2,4,6-TCP聯合脅迫下日本青鳉的逐級行為響應[J]. 供水技術, 2010, 4(4): 1-4

Liu Y, Zhang G S, Chen L L, et al. Stepwise behavioral responses of Japanese medaka (Oryzias latipes) under the joint stresses of Cd2+and 2,4,6-TCP [J]. Water Technology, 2010, 4(4): 1-4 (in Chinese)

◆

The Behavioral Responses of the Medaka under the Stress of Heavy Metal Copper in Water Environment

Liang Hong1, Liu Yong2,*, Rao Kaifeng3,#, Ma Mei4,5, Xu Wang1, Tang Liang2, Ma Song1, Pan Xiaofeng1, Chen Huiming6, Yang Yingying2

1. Shenzhen Environmental Monitoring Center, Shenzhen 518049, China 2. CASA (Wuxi) Environmental Technology Co., Ltd, Wuxi 214024, China 3. State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China 4. Key Laboratory of Drinking Water Science and Technology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China 5. College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 101407, China 6. Guangdong Environmental Monitoring Center, Guangdong 510308, China

Received 6 December 2016 accepted 20 December 2016

In this study, behavioral data for medaka (Oryzias latipes) exposed to the heavy metal Cu2+were monitored using bio-behavioral sensors, to analyze the behavioral responses of medaka at different exposure concentrations (20, 10, 5, 1 and 0.1 TU). The behavioral response profiles of medaka to Cu2+were in accordance with the environmental stress threshold model. And Cu2+at different concentrations had different behavioral toxic effects on medaka. According to the behavioral response mechanism of environmental stress caused by heavy metals, we can obtain the real-time change profiles and trends of biological behavior for medaka under heavy metal pollution. Furthermore, it can be also used for the comprehensive assessment of water ecological quality.

heavy metal; copper; medaka (Oryzias latipes); behavioral responses; water quality evaluation.

863課題(2014AA06A506)；中國科學院科技服務網絡計劃(STS計劃)：KFJ-SW-STS-171

梁鴻(1966-)，男，北京大學地球物理系本科，研究方向為城市生態監測，E-mail: szlhong@szhec.gov.cn；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: liuy@casaet.com

10.7524/AJE.1673-5897.20161206001

2016-12-06 錄用日期：2016-12-20

1673-5897(2016)6-345-08

X171.5

A

劉勇(1983-)，男，高級工程師，主要研究方向為生物行為學、水生態毒理學和生物在線監測預警。

饒凱鋒(1976-)，男，助理研究員，主要研究方向為水生態毒理學、生物在線監測預警和環境監測預警物聯網。

# 共同通訊作者(Co-corresponding author)， E-mail: raokf@rcees.ac.cn

梁鴻, 劉勇, 饒凱鋒, 等. 水環境中重金屬銅暴露下青鳉魚的行為響應[J]. 生態毒理學報，2016, 11(6): 345-352

Liang H, Liu Y, Rao K F, et al. The behavioral responses of the medaka under the stress of heavy metal copper in water environment [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(6): 345-352 (in Chinese)