鎘脅迫下黑點青鳉(Oryziasmelastigma)肝臟金屬硫蛋白mRNA性別差異性表達研究

謝晴，薄軍，鄭榕輝，洪幅坤，張玉生

國家海洋局第三海洋研究所，廈門 361005

鎘脅迫下黑點青鳉(Oryziasmelastigma)肝臟金屬硫蛋白mRNA性別差異性表達研究

謝晴，薄軍，鄭榕輝，洪幅坤，張玉生*

國家海洋局第三海洋研究所，廈門 361005

魚類金屬硫蛋白(metallothionein, MT)mRNA作為生物標志物已越來越多地應用到水環境重金屬污染的監測中，然而重金屬脅迫下魚類MT mRNA表達是否具有性別差異性特征目前尚無相關報道。以海洋模式魚類—黑點青鳉(Oryzias melastigma)為實驗魚類，首次克隆了其MT基因全長cDNA序列，分析了黑點青鳉MT基因和氨基酸序列特征，然后進一步研究了水體中鎘暴露后雌、雄性黑點青鳉肝臟中MT mRNA表達的差異性。結果顯示，黑點青鳉MT基因cDNA全長為385 bp，編碼60個氨基酸，預測編碼的多肽分子量為5 990 Da，含有脊椎動物MT基因特征性序列結構cys-x-cys、cys-x-x-cys和cys-x-cys-cys。鎘脅迫下雌、雄性黑點青鳉肝臟MT mRNA表達結果顯示，在0.8，4.0和8.0 μg·L-1環境濃度的鎘暴露1～7 d條件下，與對照組相比，雄性黑點青鳉在所有的不同暴露濃度和不同暴露時間的實驗組中肝臟MT mRNA幾乎均被顯著性誘導表達；而雌性黑點青鳉只在較高暴露濃度和較長暴露時間的實驗組中才被顯著性誘導表達，并且MT mRNA的表達水平比雄性低得多。上述研究結果表明，在相同的鎘脅迫條件下，雄性黑點青鳉肝臟MT mRNA的表達比雌性更敏感；以黑點青鳉MT mRNA作為生物標志物監測海洋環境重金屬污染生物效應狀況時，應選擇更敏感的雄性黑點青鳉作為監測魚類。利用生物標志物監測水環境污染物生物效應時，監測動物的性別差異是一個應當考慮的重要因素。

鎘；黑點青鳉；金屬硫蛋白mRNA；性別差異

近年來，我國海洋生態環境狀況總體較好，但近岸局部海域海水環境污染依然嚴重，其中重金屬污染是我國海洋污染的主要類型之一。我國每年產生400億t左右的工業廢水，其中重金屬廢水約占60%[1]。《2014年中國海洋環境狀況公報》顯示[2]，我國河流排海污染物總量依然居高不下，陸源入海排污口達標率僅為52%，重點監測的72條河流入海的重金屬污染物總量2.1萬t，其中鎘為120 t。重金屬對生物的危害主要通過3種途徑產生：直接生物毒性效應、在微生物作用下轉化為毒性更強的重金屬化合物以及生物富集作用。重金屬鎘的生物學毒性主要包括早期發育階段毒性、遺傳毒性和蛋白毒性[3-4]等。20世紀30至70年代在日本發生的“骨痛病”就是鎘污染物通過食物鏈傳遞危害人體健康的典型例證。因此鎘的生物效應及其危害至今仍然受到國際社會廣泛關注，也是目前海洋生態毒理學領域的研究熱點之一。

金屬硫蛋白(metallothionein, MT)是一類普遍存在于生物體內、富含半胱氨酸、具有結合金屬能力和高誘導特性的低分子量蛋白質。Margoshes和Vallee[5]在1957年從馬的腎臟外皮細胞中首次分離獲得了MT，并發現該蛋白可能與鎘的生物代謝過程有關。早在20世紀70年代末，Bayne[6]就提出水生生物MT可作為一種生物標志物指示水環境重金屬污染狀況；隨后MT逐漸成為監測環境重金屬污染最重要的生物標志物之一[7-8]。Bebianno和Langston[9]研究發現，雙殼類貽貝的鰓和消化腺等器官中的鎘濃度與MT誘導水平相關，貽貝MT作為響應重金屬污染的一種早期生物標志物已得到廣泛應用。許多野外研究也發現，在野生魚類體內MT的表達水平與水環境中重金屬含量，尤其是與鎘、鋅和銅3種重金屬污染程度呈現較好的相關性[10-12]，我國很多學者也進行了重金屬誘導魚類或貝類MT mRNA表達的相關研究[13-15]。聯合國環境規劃署于1999年開展的“地中海行動計劃”中，把MT作為海洋環境監測的生物標志物之一[16]，歐盟及其他相關國際組織也把MT作為水生環境重金屬污染狀況評估的生物標志物，并將MT作為關鍵性生物標志物列入歐洲監測計劃生物效應質量保證(Biological Effects Quality Assurance in Monitoring Programmes, BEQUALM)中[17]。目前，海洋動物MT含量已被認為是海洋環境中重金屬污染監測、暴露風險和健康評價的重要指標，并受到廣泛重視[18-19]。然而，由于MT分子量比較小和極少含有芳香族氨基酸等特點，其提取和檢測方法比較復雜，使MT生物標志物的推廣和應用受到了一定的影響。重金屬對MT的誘導作用首先發生在轉錄水平，因此可以直接把MT mRNA作為生物標志物應用于監測環境中重金屬的污染狀況[20-21]。由于檢測MT mRNA的方法比檢測MT蛋白的方法簡便可行，因此前者已經被廣泛應用。目前用于檢測MT mRNA表達方法主要有核酸印跡法(Northern blot)、半定量聚合酶鏈式反應(semi-quantitative polymerase chain reaction)和實時定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)，其中qPCR被公認為是一種最靈敏又可靠的分析方法[15]。魚類MT mRNA作為生物標志物已經越來越多地應用于水環境中重金屬污染效應狀況的監測[22-23]。然而重金屬脅迫下魚肝臟MT mRNA表達是否具有性別差異性特征，目前尚無相關的報道。

黑點青鳉(Oryzias melastigma)是海洋生態毒理學研究中理想的模式魚類[24-26]，具有如下優點：溫度和鹽度適應范圍廣；體型小，世代周期短，雌雄個體形態上差異明顯等，易于水族廳繁殖、飼養和試驗。近年來，黑點青鳉在生態毒理學等研究中的應用越來越多[27-28]。

本研究首先克隆了黑點青鳉MT cDNA全長序列，然后以環境濃度的鎘分別對雌、雄性黑點青鳉進行水體暴露實驗，旨在比較不同性別的黑點青鳉肝臟MT mRNA表達差異性，為應用黑點青鳉肝臟MT mRNA作為生物標志物監測海洋環境重金屬污染生物效應狀況提供科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

1.1.1 黑點青鳉

黑點青鳉最初受贈于香港城市大學生化系Dr. Doris W T Au，已經在我國家海洋局第三海洋研究所海洋生物與生態研究室青鳉養殖中心穩定繁殖6代以上。養殖過程嚴格按照黑點青鳉養殖標準操作流程：室溫控制在(28±1)℃；光照周期為光∶暗=14 h∶10 h，光照強度100～500 lux；溶氧量DO≥6 mg·L-1；養殖用的海水為人工配制，鹽度為30‰；配備一套水質在線實時監測系統，監測水中溶氧量、pH和電導等參數；每天2次固定時間分別投喂新孵化的活體豐年蟲，投餌量約為魚體重2%。

本研究中所用到的雌、雄性黑點青鳉來自國家海洋局第三海洋研究所青鳉養殖中心人工孵化的同一批魚卵，實驗時年齡為8個月，雄魚平均體長(3.00±0.18) cm，平均體重(0.27±0.04) g；雌魚平均體長(2.76±0.22) cm，平均體重(0.22±0.04) g。

1.1.2 CdCl2母液配制

CdCl2(AR)購自美國Sigma-Aldrich公司。實驗前用Milli-Q水配制為一系列濃度梯度的CdCl2母液備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑點青鳉MT cDNA全長序列克隆與生物信息學分析

使用TRIzol法提取黑點青鳉肝臟總RNA，根據已報道的黑點青鳉MT基因部分核苷酸序列(GenBank：HM137170)設計引物進行MT cDNA全長擴增。3'-RACE和5'-RACE的引物分別為：5'-CTGCGACTGCTCCAAAACTG-3'和5'-TGTCGCAGGTCTTCCCTTTG-3'，利用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit (TaKaRa)進行MT基因cDNA第一鏈合成、5'-RACE和3'-RACE擴增；然后將目的條帶切膠回收，與pMD19-T載體鏈接，轉化DH5α感受態細胞，經平板培養和菌落PCR鑒定后進行測序。

利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)同源序列相似性在線搜索比對工具BLAST進行黑點青鳉MT基因序列相似性搜索比對分析；使用GeneTool 1.0 Lite拼接基因序列；使用DNAssist 2.0軟件預測開放閱讀框(ORF)，翻譯編碼的氨基酸序列，預測蛋白質分子量以及計算理論等電點；使用Clustalx 1.83軟件進行各物種間氨基酸序列比對；利用MEGA 4.0軟件，構建黑點青鳉MT基因的系統進化樹。

1.2.2 鎘水體暴露實驗

參考現行的“GB3097—1997中華人民共和國海水水質標準”(一類海水鎘≤ 1 μg·L-1，二類海水鎘≤ 5 μg·L-1，三、四類海水鎘≤ 10 μg·L-1)[29]，在劑量效應實驗中，鎘水體暴露濃度設計為0.8、4.0和8.0 μg·L-1共3個濃度組，同時設置一個空白對照組。各濃度設置2個平行組，每個平行組暴露體積10 L，隨機放入黑點青鳉成魚18條，每天更換一次含有相應鎘濃度的海水。雄性和雌性黑點青鳉暴露實驗分別同時進行，盡量保證整個實驗過程條件完全一致。暴露后的1、3、5和7 d這4個時間點分別取樣，每次取樣時從各濃度組的2個平行組分別隨機取4條，即每個濃度取8條魚(n=8)，解剖獲得的肝臟樣品立即放入液氮中速凍，然后轉移至-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于后續的分析。

采用無火焰原子吸收分光光度法[29]，使用德國耶拿Zeenit 600原子吸收分光光度計測定空白對照組和3個不同鎘濃度暴露組海水鎘離子的實際濃度。

1.2.3 黑點青鳉MT mRNA表達定量分析

黑點青鳉肝臟MT mRNA表達水平利用qPCR方法進行檢測，該基因擴增引物序列同上述RACE實驗所用的引物一致；內參基因為18S，qPCR實驗步驟同文獻[26]中的方法。所用儀器為Rotor-Gene Q(德國Qiagen)，MT mRNA相對表達量分析方法基于2-ΔΔCT原理[30]進行。

1.2.4 數據處理

所有數據均以平均值±標準誤差(M±S.E.)表示，應用IBM SPSS 19.0軟件中的單因素方差分析進行統計學分析。結果中“*”表示統計學上具有顯著性差異(P < 0.05)。各個時間點處理組MT mRNA表達數據均與其相應的對照組進行統計學分析。

2 結果(Results)

2.1 黑點青鳉MT cDNA序列分析

測序拼接后黑點青鳉MT cDNA全長及推導的氨基酸序列如圖1所示：全長385 bp，開放閱讀框為180 bp，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，編碼60個氨基酸，預測編碼多肽的分子量為5 990 Da，理論pI為8.38；含有典型的多腺苷酸化信號序列(AATAAA)。BLAST在線比對結果顯示，該基因編碼的氨基酸序列與已經報道的其他魚類MT基因的氨基酸序列一致性范圍為82%～98%，確認該序列為黑點青鳉MT基因。

圖1 黑點青鳉MT全長cDNA序列及推導的氨基酸序列注：圖中灰色部分為預測編碼的氨基酸序列；終止密碼子用“*”表示。Fig. 1 Complementary DNA and predicted amino acid sequences of MT from O. melastigmaNote: The grey part indicates the predicted code of MT from O. melastigma. The stop code is indicated with an asterisk ‘*’.

圖2 黑點青鳉MT基因與其他魚類相同基因氨基酸序列比對注：‘*’表示具有完全一致的氨基酸的位置；‘:’和‘.’表示具有相似性質的氨基酸的位置。Fig. 2 Multiple sequence alignment of MT among O. melastigma and other fish speciesNote:‘*’ indicates positions which have a single, fully conserved residue; ‘:’ indicates that one of the strong groups is fully conserved; ‘.’ indicates that one of the weaker groups is fully conserved.

圖3 黑點青鳉MT基因與其他魚類相同基因氨基酸序列系統進化樹分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of deduced amino acid sequences of MT cDNA from O. melastigma and other fish species

黑點青鳉MT基因編碼的氨基酸與其他魚類相同基因氨基酸序列比對結果如圖2所示。推導的黑點青鳉MT含20個半胱氨酸(Cys)殘基，占總氨基酸數目的三分之一，它們與鄰近的氨基酸組成了MT的保守性結構，具有MT特征性序列結構cys-x-cys、cys-x-x-cys和cys-x-cys-cys，與其他魚類的MT在Cys的排列方式上顯示出高度的保守性。黑點青鳉MT基因與其他魚類相同基因氨基酸序列系統進化樹分析結果如圖3所示：黑點青鳉與鱖魚(Siniperca chuatsi)和吻鱗肩孔南極魚(Trematomus lepidorhinus)在進化上距離較近，而與鮭科如大馬哈魚(Oncorhynchus keta)、銀鮭(Oncorhynchus kisutch)和北極紅點鮭(Salvelinus alpinus)等距離較遠，分屬于兩個不同分支。

2.2 海水鎘離子濃度測定

測定結果顯示，空白對照組海水鎘離子濃度為0.196 μg·L-1，3個暴露組(0.8、4.0和8.0 μg·L-1)海水鎘離子實際濃度分別為0.965、4.182和8.194 μg·L-1。

2.3 水體鎘暴露對雄性黑點青鳉肝臟MT mRNA表達的影響

雄性黑點青鳉經鎘暴露不同時間，肝臟中MT mRNA表達結果如圖4所示。暴露1 d后，0.8、4.0和8.0 μg·L-1濃度組MT mRNA相對表達量與對照組相比均顯示出快速且顯著性的升高，各濃度組表達水平為對照組的3.5～4.1倍。暴露3 d后，3個濃度組魚肝臟MT mRNA均被顯著性誘導，分別為對照組的9.6、9.0和7.5倍。暴露5 d后，0.8 μg·L-1和4.0 μg·L-1濃度組魚肝臟MT mRNA相對表達水平開始下降，但與對照組相比仍具有顯著性差異；而最高濃度的8.0 μg·L-1組MT mRNA表達水平仍不斷升高，達到對照組的10.6倍。暴露7 d后，各組的表達量水平總體上繼續呈下降趨勢，0.8、4.0和8.0 μg·L-1濃度組分別為對照組的1.5、3.3和5.3倍。除最低劑量組之外，4.0和8.0 μg·L-1濃度組MT mRNA表達量與對照組相比仍然具有顯著性差異。

圖4 水體鎘暴露對雄性黑點青鳉肝臟MT mRNA表達的影響Fig. 4 Hepatic MT mRNA expression pattern of male O. melastigma exposed to Cd

圖5 水體鎘暴露對雌性黑點青鳉肝臟MT mRNA表達的影響Fig. 5 Hepatic MT mRNA expression pattern of female O. melastigma exposed to Cd

2.4 水體鎘暴露對雌性黑點青鳉MT mRNA表達的影響

雌性黑點青鳉經不同劑量和不同時間的鎘暴露后，肝臟MT mRNA表達結果如圖5所示。暴露1 d后，只有4.0 μg·L-1濃度組MT mRNA被顯著性誘導表達；暴露3 d后，各濃度組(0.8、4.0 和8.0 μg·L-1)的表達量呈現升高的趨勢，均達到最大值，分別為對照組的6.8、8.7和2.9倍。然而，隨著暴露時間延長到5～7 d后，MT mRNA表達量均下降到本底水平。

3 討論(Discussion)

魚類的肝臟是解除重金屬毒性的主要器官，在重金屬離子脅迫下，魚類肝臟中金屬硫蛋白及其mRNA表達通常呈現一種典型的“先誘導后抑制”模式。在一定濃度的環境重金屬誘導下，MT表達量先隨著暴露時間延長不斷升高；隨后當MT含量達到閾值時又會對自身的轉錄機制產生負反饋調節，抑制其表達；同時MT也會由于相關酶的作用而被降解[31-33]。以魚類肝臟MT和MT mRNA為生物標志物的實驗結果大多數符合這種誘導模式[34-36]。Zhang等[37]將鯰魚(Ictalurus punctatus)暴露于100.0 μg·L-1的CdCl2中1～4 d，魚肝臟MT mRNA表達水平在1 d時呈上升趨勢，2 d時達到最高，并呈現顯著性差異，隨后降低到對照組水平。Choi等[38]對金魚(Carassius auratus)進行0.1 μg·g-1CdCl2體內注射，實驗開始6 h后肝臟MT mRNA相對表達量已經顯著升高，12 h后達到最高值，約為對照組的6倍，之后開始降低。在本研究中，鎘的時間效應實驗結果表明，暴露1～3 d期間，雌、雄性黑點青鳉肝臟MT mRNA表達均呈現上升趨勢，并且在3 d時達到最高水平；暴露5～7 d后，總體上表現出下降趨勢，而且雄性的表達更加顯著，這與上述報道的其他魚類重金屬暴露后MT mRNA表達呈現先誘導后抑制的結果相一致。

重金屬暴露后機體相關組織細胞中MT被誘導表達是生物重要防護機制之一。生物體內具有一種或多種金屬效應轉錄因子，能夠與相應的金屬離子結合發生結構的轉化，進而與金屬效應元件(metal response elements, MREs)結合，調控效應基因，啟動MT基因轉錄。Cd2+可使轉錄因子從非活性狀態(非DNA結合型)轉化為活性狀態(DNA結合型)，在Cd2+作用下，DNA結合型金屬調控蛋白識別MREs，成為正調控因子，促進MT基因轉錄，這可能是經過鎘暴露后肝臟MT mRNA顯著升高的主要原因[39-40]。生物體中MT的誘導表達參與了體內金屬的內穩和脫毒過程，利用人類胚胎腎細胞系進行研究發現，蛋白磷酸酶2A通過金屬轉錄因子-1(metal transcription factor-1, MTF-1)的去磷酸化而調控MT的表達[41]。然而，在魚類中MT的調控機制是否和哺乳動物中一致，目前尚不清楚。

Smaoui-Damak等[42]通過研究溝紋蛤仔(Ruditapes decussatus)不同季節消化腺和鰓中MT含量與性別的關系發現，MT含量的性別差異與蛤仔的生殖周期有關。Hamza-Chaffai等[43]的研究結果顯示，另一種蛤類(Ruditapes decussates)消化腺中MT含量在雌性體內更高。除貝類外，鉤蝦(Gammarus locusta)的研究結果同樣顯示，MT含量與性別具有相關性[44]。在本實驗中，黑點青鳉肝臟MT mRNA的表達同樣具有明顯的性別差異性。因此，推測MT mRNA性別差異性表達特征可能在不同水生動物中具有普遍性。在一些免疫刺激物或環境污染物脅迫下，黑點青鳉相關分子在轉錄水平的性別差異性表達已有報道。脂多糖刺激后，黑點青鳉抗菌肽hepcidin基因在肝和脾中雄性比雌性誘導水平更高[26]；經多溴聯苯醚-47暴露后，黑點青鳉轉錄組表達譜和補體系統重要基因表現出雄性比雌性更敏感的性別差異特征[45-46]。本實驗中，暴露1～7 d期間，雄性黑點青鳉肝臟MT mRNA，除了暴露7 d時的最低劑量組外，其余各劑量組均被顯著性誘導；而雌性暴露組，只有暴露3 d時，各劑量組均呈現顯著性升高，其余各組MT mRNA表達水平與對照組比較，總體上無顯著性差異。此外，與雌性比較，在整個暴露期間，雄性肝臟MT mRNA受鎘的誘導一直處于較高水平。由此可見，鎘暴露后，雄性黑點青鳉肝臟MT mRNA表現出誘導持續時間比較長和誘導倍數比較高的特征。因此，在海洋環境重金屬污染效應研究與監測中，選擇比較敏感的雄性黑點青鳉肝臟MT mRNA表達為指標更合適。

綜上，本文首次克隆了黑點青鳉MT基因全長cDNA序列，在環境濃度鎘暴露條件下，雄性黑點青鳉肝臟MT mRNA的表達比雌性更敏感。以黑點青鳉肝臟MT mRNA作為生物標志物監測海洋環境重金屬鎘的污染是可行的，但應充分考慮不同性別對重金屬脅迫響應的差異性。我們的研究結果提示，利用生物標志物監測水環境污染物生物效應時，監測動物的性別差異是一個應當考慮的重要因素。

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Study on Gender Difference of Hepatic Metallothionein mRNA Expression ofOryziasmelastigmaExposed to Cadmium

Xie Qing, Bo Jun, Zheng Ronghui, Hong Fukun, Zhang Yusheng*

Third Institute of Oceanography, State Oceanic Administration, Xiamen 361005, China

Received 28 February 2016 accepted 21 April 2016

Although fish metallothionein (MT) mRNA as a biomarker has been widely used for monitoring heavy metal pollution in aquatic environment, there were no reports on the gender difference from fish hepatic MT mRNA expression under heavy metal exposure. In present study the full-length cDNA sequence of MT gene was isolated for the first time from medaka (Oryzias melastigma), a marine model fish, and MT gene and amino acid sequences were characterized. Then the gender difference of hepatic MT mRNA expression was studied between male and female medaka after exposure to environmentally relevant concentrations of Cd (0.8, 4.0 and 8.0 μg·L-1). The results indicate that hepatic MT cDNA of the medaka contains 385 bp, coding 60 amino acids with a predicted molecular weight 5 990 Da and containing the specific sequences of MT gene in vertebrates such as cys-x-cys, cys-x-x-cys and cys-x-cys-cys. After exposure to different concentrations of Cd for 1-7 d, hepatic MT mRNA expressions of all male medaka were almost significantly increased when compared with the control group, while the hepatic MT mRNA expressions of female medaka were significantly induced only by higher Cd concentrations with longer exposure time, and the induced levels were much lower than that of the male. By comparison of the gender difference of hepatic MT mRNA expression in the present study it is clear that male medaka is much more sensitive than the female, thus it is better to select the male medaka as a sentinel fish. The results indicate that gender difference is an important factor to be considered when using biomarkers for monitoring the biological effects of aquatic pollutants.

cadmium; Oryzias melastigma; metallothionein (MT) mRNA; gender difference

海洋公益性行業科研專項經費資助項目(201005016)；國家海洋局第三海洋研究所基本科研業務費資助項目(海三科2012019)；國家海洋局近岸海域生態環境重點實驗室開放基金(201204)

謝晴(1991-)，男，在讀碩士研究生，研究方向為海洋生態毒理學，E-mail: xieqing@tio.org.cn；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: zhangyusheng@tio.org.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160228001謝晴, 薄軍, 鄭榕輝, 等. 鎘脅迫下黑點青鳉(Oryzias melastigma)肝臟金屬硫蛋白mRNA性別差異性表達研究[J]. 生態毒理學報，2016, 11(6): 93-101

2016-02-28 錄用日期：2016-04-21

1673-5897(2016)6-093-09

X171.5

A

張玉生(1956-)，男，二級研究員，主要研究方向為海洋污染生物效應及其生物標志物監測技術。

Xie Q, Bo J, Zheng R H, et al. Study on gender difference of hepatic metallothionein mRNA expression of Oryzias melastigma exposed to cadmium [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(6): 93-101 (in Chinese)