第二線粒體源性胱氨酸酶激活因子及其類似物與腫瘤的相關性研究進展

魏娟，張全安

(東南大學附屬第二醫院腫瘤科，江蘇 南京 210003)

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第二線粒體源性胱氨酸酶激活因子及其類似物與腫瘤的相關性研究進展

魏娟，張全安

(東南大學附屬第二醫院腫瘤科，江蘇 南京 210003)

第二線粒體源性胱氨酸酶激活因子(Smac)是一種存在線粒體中并具有促凋亡作用的蛋白，Smac主要通過參與細胞凋亡的線粒體途徑和死亡受體途徑的下游反應，特異性地與凋亡抑制因子(IAPs)結合，解除IAPs對Caspase的抑制效應從而促進細胞凋亡。在腫瘤細胞中，Smac的過表達可以抑制或延緩腫瘤的發生發展過程，提高細胞漿Smac含量可增強細胞對放化療的敏感性。人工合成的Smac類似物可通過級聯放大效應提高腫瘤細胞對放化療的敏感性，具有高效、低毒、高通透性等優點，為腫瘤的治療提供了新的方法和思路，具有重要的臨床意義。該研究就Smac、Smac類似物與腫瘤的相關性研究進展做一綜述。

Smac；Smac類似物；細胞凋亡；腫瘤

人類第二線粒體源性胱氨酸酶激活因子(Smac),也稱為低等電點(PI)的凋亡蛋白抑制劑(IAP)家族直接結合蛋白(DIABLO)，是2000年Du[1]和Verhagen[2]同時發現的來源于線粒體的促凋亡蛋白，主要通過抑制IAPs的活性而發揮促凋亡作用。本研究就Smac的結構、促凋亡的機制及其與Smac類似物在腫瘤發生發展、治療、預后過程中的影響作一綜述。

1 Smac的結構

Smac主要通過參與細胞凋亡的線粒體途徑和死亡受體途徑的下游反應，特異性地與IAPs結合，解除IAPs對半胱氨酸蛋白酶(caspase)的抑制效應從而促進細胞的凋亡。Smac由7個外顯子組成，位于12號染色體長臂。全長為1.5 kb的Smac cDNA編碼分子量約為27 kDa的239個氨基酸的前體蛋白。其末端的55個氨基酸殘基構成了線粒體靶序列(MTS)。Smac進入線粒體后剪切脫離線粒體靶序列，成為成熟的Smac。成熟的Smac才具有促凋亡活性。Smac蛋白在空間上有二聚體和單體兩種形態。二聚體Smac蛋白位于線粒體膜間隙內，當釋放入胞質時發揮促凋亡的活性[3]，單體形態的Smac則無促凋亡功能。Smac蛋白的高表達可促進細胞對凋亡的敏感性及對化療藥誘導凋亡的敏感性，而低表達則提高細胞凋亡的閾值[4]。

2 Smac的促凋亡機制

2.1 線粒體途徑 線粒體途徑也稱為內源性途徑，當受到如抗癌藥物、缺氧、DNA破壞、射線照射以及化學信號等的外界因素作用時，激活線粒體外膜滲透效應使Smac從線粒體釋放到細胞質。Smac一方面可以直接與細胞色素C(cytochrome-C )、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9前體(procaspase-9)、三磷酸脫氧腺苷(dATP)、凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)作用，形成凋亡體激活caspase-9，進而激活效應因子caspase-3，caspase-6，caspase-7。另一方面通過與IAPs作用，拮抗IAPs對caspases活性的抑制作用，誘導細胞凋亡。Smac發揮功能的分子基礎是其N端的一段保守序列Ala-Val-Pro-Ile (AVPI)，通過這4個疏水氨基酸殘基同IAPs的BIR2，BIR3結構域結合，發揮抑制IAPs的功能[6-7]。

2.2 死亡受體途徑 死亡受體途徑也稱為外源性途徑，死亡受體主要包括凋亡相關蛋白FAS、腫瘤壞死因子受體(TNFR)、腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體受體(TRAILR)等。腫瘤壞死因子(TNF)與相應TNFR特異性結合發生寡聚化，促進TNFR胞漿部分與接頭蛋白Fas相關死亡結構域(FADD)和procaspase-8結合，形成DISC，激活procaspase-8自身切割后形成有活性的caspase-8，再通過TRAIL啟動caspase-8-tBid-bax的級聯反應，促進成熟的Smac蛋白迅速釋放到細胞質中，與IAPs特異性結合并解除對caspase-3的抑制作用，并使得caspase-8激活caspase-3，啟動caspase級聯激活反應從而導致靶細胞凋亡[8-9]。

2.3 Smac調控因素 Smac受調控的因素很多且過程復雜，Bcl-2家族(tBid、Bax、Bim)、Puma、JNK、caspases、cytochrome-C激發Smac從線粒體釋放到細胞質中，而Bcl-2、Bcl-xL、Survivin、XIAP、Apollon、Erk1/2 和c-Myc 阻止其釋放過程。XIAP、c-IAP1、IAP2 和Livin促進Smac在細胞質中的降解和泛素化，而Survivin 和NADE 阻止Smac降解過程[10-12]。

3 Smac在腫瘤中的表達

Smac在腫瘤中廣泛表達，在不同腫瘤組織中的表達情況有差異，Yoo等[13]用免疫組織化學方法分析結果表明在胃癌、結腸癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等中Smac表達率為62%，在惡性神經鞘病、橫紋肌肉瘤、惡性皮膚纖維瘤、平滑肌肉瘤、尤文肉瘤等中Smac表達率為22%，而血管肉瘤和脂肪肉瘤中無表達。隨后，相關研究結果證實[14-16]，Smac在直腸癌、肝癌、睪丸癌等腫瘤中較正常組織呈低表達或缺失狀態，并且Smac低表達可能有抑制細胞凋亡效應。而在宮頸癌和胃癌中恰恰相反，Smac呈高表達狀態，Shibata等[17]認為造成表達差異的原因是由于XAF1表達量減少：XAF1是xIAP的直接抑制因子，它的降低可能增加了腫瘤細胞的凋亡閾值，從而促進Smac的合成與釋放。而對于Smac在肺癌中的表達程度存有爭議。Sekimura等[18]發現肺癌組織中Smac mRNA的表達明顯低于正常肺組織；Hofmann等[19]證明在非小細胞肺癌(NSCLC)中Smac的低表達提高了細胞凋亡的閾值。而Zhao等[20]證明Smac mRNA在肺癌組織中的表達陽性率高于相應的正常肺組織。Evzen等[21]亦得出Smac mRNA在NSCLC中的表達高于正常肺組織的結論，Evzen認為其研究結果相反原因在于選擇的內參不同。Yang等[22]發現Smac蛋白在NSCLC中的表達明顯高于正常組織，作者認為該結果與Smac蛋白的促凋亡效應并不矛盾：因為Smac在NSCLC中高表達可增強促凋亡效應，而腫瘤細胞增殖速度增快，細胞凋亡率并不減少。但導致同一腫瘤中表達差異的具體機制究竟是怎樣的,有何意義？現尚未明確，還有待進一步深入探討。

4 Smac與腫瘤的發生發展及預后

IAPs通過抗凋亡作用參與腫瘤的發生發展過程，Smac作為IAPs的抑制劑可促進細胞凋亡，它的高表達可以延緩或抑制腫瘤的發生發展，低表達可能預示著腫瘤侵襲力更強和預后更差。Yan等[23]認為xIAP和Smac之間的平衡狀態在腫瘤發生發展過程中發揮著重要作用。在肝癌中[15]，Smac mRNA和蛋白水平較正常肝組織低，IAPs、survivin表達量的增高與肝癌進展呈正比，說明Smac與肝癌的發生發展相關。Jia等[24]發現將Smac轉染至白血病細胞株中，Smac可有效地將腫瘤細胞阻滯于細胞周期的G0/G1期，說明Smac可能通過抑制細胞增殖從而延緩白血病的發生發展過程。而Espinosa等[25]發現宮頸癌組織有Smac mRNA的表達，正常組織中無Smac mRNA的表達，且Smac mRNA的表達與TNM分期、組織類型及病程無關。腎癌中近期兩項研究表明Smac mRNA和蛋白水平與腎癌的分期、分級無相關性[23-26]。但Mizutani等[27]用Western blot方法檢測腎癌組織的Smac蛋白表達，發現82%的腎細胞癌組織Smac表達量低于正常腎組織，且與腎癌的臨床分期及預后具有顯著的相關性。Sekimura等[18]發現與正常肺組織相比，肺癌組織中Smac mRNA的表達量明顯降低，T2～T4期肺癌組織的Smac mRNA表達量明顯較T1期低，Smac mRNA表達量越低的病人預后越差。Chen等[28]研究證明Smac高表達預示患者無病生存期和總生存期相對延長。Zhao等[20]則證明Smac mRNA 在肺癌組織中的陽性率高于相應的正常肺組織，Smac 蛋白在Ⅱ期NSCLC患者組織中的表達明顯高于Ⅰ期患者。且他們認為Smac蛋白表達與Ⅰ～Ⅱ期NSCLC患者性別、年齡、血型、病理類型及生存無相關性，而與淋巴結有無轉移有關，在無淋巴結轉移者組織中明顯低于有淋巴結轉移者。

5 Smac/Smac類似物與腫瘤的治療關系

目前，腫瘤的治療強調的是以手術、放化療、生物治療及分子靶向治療等多種方法相結合的綜合治療。Smac作為IAPs的拮抗劑，發揮促細胞凋亡的這一活性，為Smac可以應用于腫瘤治療提供了可靠的理論依據。提高胞漿Smac含量不僅可增強細胞對化療藥的敏感性，并且增強機體免疫系統對腫瘤細胞的殺傷和清除作用[29]。提高Smac含量的方法包括：一是將編碼Smac的表達載體轉染腫瘤細胞中，轉染Smac的腫瘤細胞在受到化療藥或放療作用時，促凋亡效應較未轉染的細胞顯著增強。二是將由Smac蛋白衍生的含AVPI的小分子多肽與載體蛋白結合，轉染細胞，增加化療藥對腫瘤細胞的促凋亡作用。但人工切割的小分子多肽存在生物利用度差、細胞膜通透性差、生物體內代謝穩定性差等缺點。目前通過應用熒光標記已開發出一種高通量的藥物篩選方法，已經成功合成比自然存在的Smac多肽促凋亡功能強20倍的Smac肽類的模擬物，優點是高效、低毒、細胞膜通透性好等。但因需要高濃度及直接注射到腫瘤部位等缺點，暫無法應用于臨床。進而，研究人員合成了非肽類Smac類似物，通過模擬靶向蛋白-蛋白相互作用，激活腫瘤細胞的凋亡途徑，目的在于增強結合能力、細胞膜通透性、體內穩定性和生物利用度。Smac類似物可以二價結合IAP的BIR2和BIR3域，通過TNF-α環路發揮促凋亡活性。在TNF-α環路中，Smac類似物激活E3泛素酶活性，導致cIAPs的自身泛素化及蛋白酶體降解，從而導致NIK(NF-κB-inducing kinase)激活，最終導致NF-κB向細胞核內轉位指導目的基因的表達，包括作用于TNFR1的TNFA，促使了RIP1從TNFR1釋放，去泛素化RIP1與TNFR1、caspase-8、銜接蛋白TRADD、FADD形成復合體II，從而促進細胞凋亡。Smac類似物在腫瘤中被單獨應用或者與化、放療聯合應用探索抗腫瘤效應[30-31]。相關文獻報告中，Huerta等[32]體內外實驗證明小分子Smac類似物(Smac-JP1201)可增加直腸癌細胞對放療的敏感性，并驗證其是通過降低xIAP水平及破壞DNA修復機制誘導凋亡的；最近相關研究也表明Smac類似物(Smac-BV6)可通過抑制DNA修復作用而提高結直腸癌的放療敏感性[33]；Yang等[34]應用小分子Smac類似物(SM-164)作用于頭頸部腫瘤，結果表明SM-164是通過誘導cIAP1降解，激活NF-κB同時促進TNF-α產生，下傳凋亡信號，激活caspase導致細胞凋亡并增加細胞對放療的敏感性，隨后Yang等[35]研究人員又將SM-164作用于乳腺癌，結果提示SM-164可通過同樣機制提高乳腺癌細胞對放療的敏感性；Greer等[36]報告Smac 類似物JP1201 能使非小細胞肺癌細胞對多種化療藥物誘導的凋亡敏感性增高。最新研究表明Smac類似物可提高兒童急性淋巴細胞白血病的化療敏感性[37]。近期一項藥物實驗[38]將納米顆粒與Smac多肽結合，借助納米顆粒體積小體表面積大的特點，在耦合Smac多肽后可以與形成多個結合面與IAPs家族結合，從而發揮更大的抗腫瘤活性。腫瘤細胞對放化療抵抗是腫瘤治療過程中的主要難題，逆轉放化療抵抗、增加放化療敏感性的靶向治療一直是腫瘤學界的研究熱點，Smac/Smac類似物既可促進腫瘤細胞凋亡，同時也能發揮放化療增敏作用，由此可見，Smac及Smac類似物作為新型的靶向藥物應用于腫瘤治療指日可待。

6 展望

近年來，Smac的促凋亡功能已得到廣泛而深入的研究和闡明，IAPs在腫瘤中的廣泛表達也為Smac提供了作用靶點。通過調節細胞漿Smac的含量可以有效地提高腫瘤細胞對放化療敏感性，而且通過Smac功能與結構的研究發現AVPI功能序列也為開發以肽類和非肽類的Smac類似物奠定了基礎，將為腫瘤治療方面提供新的思路和好的應用前景。但是應用于臨床目前仍存在一系列問題尚待解決：如同一類腫瘤中Smac表達情況尚不統一,Smac的過表達對正常細胞是否有不好的影響,Smac/Smac類似物最佳治療濃度的選擇,敏感、有效的腫瘤細胞類型和化療藥物如何篩選,Smac在不同腫瘤中發揮生物學作用的具體機制,Smac類似物在人體中的毒副反應及療效尚不明確。因此，Smac及Smac類似物在臨床的真正廣泛應用，還需要更深入的研究，這也將為腫瘤的診斷、個體化治療開辟新的方向和途徑。

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Advances in the research of the relationship between Smac,Smac mimetic and tumor

WEI Juan,ZHANG Quanan

(DepartmentofOncology,TheSecondAffiliatedHospital,SoutheastUniversity,Nanjing,Jiangsu210003,China)

Smac is a newly found protein promoting apoptosis of mitochondria,which can promote cell apoptosis and was initially discovered independently by two groups in 2000.Smac has a pro-apoptotic effect that is mediated by its interaction with IAPs and the release of caspases from them.Overexpression of Smac in cancer cells can promote its cells apoptosis and postpone its development．Improving content of Smac in the cytoplasm can sensitize these cells to chemotherapy and radiotherapy.Smac mimetics is a potent enhancer of chemotherapy and radiotherapy,which can overcome the resistance of several cancers to anti-cancer therapies and have the advantages of high efficiency,low toxicity and high permeability.It is clear that Smas has great therapeutic potential for the treatment of cancer and has important clinical significance.In this article,we reviewed the recent advances in the study of the correlation among Smac，Smac mimetic and cancer.

Smac;Smac mimetics;Cell apoptosis;Cancer

張全安，男，主任醫師，研究方向：消化道腫瘤的診治，E-mail:13905152166@139.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.10.003

2016-02-15，

2016-07-06)