果蔬氨基酸成分測定方法的比較分析

胡家禹， 俞靜芬， 張志祥， 凌建剛*

(1.寧波市惠貞書院，浙江寧波 315016;2.寧波市農業(yè)科學研究院,浙江寧波 315040)

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果蔬氨基酸成分測定方法的比較分析

胡家禹1， 俞靜芬2， 張志祥1， 凌建剛2*

(1.寧波市惠貞書院，浙江寧波 315016;2.寧波市農業(yè)科學研究院,浙江寧波 315040)

果蔬中富含大量的氨基酸，且部分氨基酸是人類自身無法合成的。測定果蔬中的氨基酸含量，在植物營養(yǎng)分析研究中必不可少。由于測定方式存在差異，可通過比較分析多種常見蔬菜氨基酸含量測定方法，探討出更符合當前經(jīng)濟生產的營養(yǎng)測定方式，或是改進方案，促進果蔬生產的進一步發(fā)展。

果蔬；氨基酸成分；測定方法

氨基酸是蛋白質的基本結構單位，是動物體合成蛋白質的原料。植物蛋白作為蛋白質的一種，是由植物中提取的，其營養(yǎng)與動物蛋白相仿，且更易于消化[1-3]。大豆、花生和核桃等都富含豐富的植物蛋白，近年來研究發(fā)現(xiàn)，植物蛋白對人體的健康發(fā)揮著動物蛋白無法比擬的作用[4]。同時，果蔬可溶性蛋白質含量也是一個重要的生理生化指標，是果蔬品質和營養(yǎng)的重要評價指標之一。許多可溶性蛋白質是植物細胞的重要組成部分，對植物的酶活性、抗衰老性、抗病性等都具有不可替代的作用，對它的測定在植物營養(yǎng)分析研究中必不可少。因此，分析測定氨基酸的含量是果蔬營養(yǎng)成分研究中最重要的項目之一。

目前氨基酸成分測定主要有凱氏定氮法、氨基酸分析儀測定和液相色譜法等，在測定豆類、薯類和谷類植物的蛋白質含量等方面應用非常廣泛[5]。除此之外，甲醛滴定法、氣相色譜法、紙色譜法和電化學法等也有一定的應用。筆者比較分析了多種常見蔬菜氨基酸含量的測定方法，探討出更符合當前經(jīng)濟生產的測定方式。

1 化學法

利用化學方法測定氨基酸含量，一般是利用化學試劑與氨基酸發(fā)生顏色反應從而判斷被測物中氨基酸的含量，常用方法有凱式定氮法、雙縮脲反應法、茚三酮比色法、考馬斯亮藍法等。

1.1 凱氏定氮法 凱氏定氮法是通過測定樣品中總氮的含量，然后根據(jù)蛋白質和氨基酸中的氮含量，得知氨基酸、蛋白質總量。目前常用的凱氏定氮法有3種，分別是全量法、微量法、改良后的凱式定氮法[5-7]。為了比較其中微量法和改良后的凱式定氮法的準確度，史瑋等對同一份大豆樣品進行5組平行對照試驗，結果顯示，采用改良后的凱氏定氮法測定大豆蛋白質含量自動化程度高，標準偏差更小，重復性更好[8]。

向長萍等采用凱氏微量定氮法測定苦瓜的粗蛋白含量時，同樣發(fā)現(xiàn)測得的數(shù)據(jù)與其他測定法相比較而言，準確度更高[9]。但是凱氏微量定氮法操作步驟復雜、試劑耗量多、測定周期長，會為試驗者帶來許多困擾。賈麗艷等對自動凱氏定氮儀法進行了改良，分別測定了同一份綠豆粉樣本中氨基酸的含量，并收集了相應的回收率試驗數(shù)據(jù)[10]。研究顯示，改進的自動凱氏定氮儀法明顯縮短了消化裝置的時間，從而節(jié)省了人力，同時，從試驗后廢棄物排放含量中可以看出，改進后的測定方法明顯減少了污染氣體的排放。改進后的凱式定氮法在一定程度上提高了測定效率，值得大范圍推廣和使用。

1.2 茚三酮比色法 茚三酮比色法是利用氨基酸在一定pH范圍內能與茚三酮生成藍紫色化合物的原理，實現(xiàn)對氨基酸的鑒別。一般可以用比色法定量測定[11]。

王昂等[12]利用了茚三酮比色法測定谷氨酸含量，借此試驗對茚三酮比色法的優(yōu)劣進行了進一步的探究。研究顯示，溶液的濃度、反應溫度、時間等都會對試驗產生相應的干擾，如當谷氨酸濃度在80～140 μg/mL 時，只有在 90 ℃加熱20 min 以上才可完全反應。劉飛飛等[13]探究了不同條件對茚三酮比色法測定賴氨酸濃度的影響，主要從溶液pH和顯色劑用量2個方面深入探究，發(fā)現(xiàn)賴氨酸溶液在pH 6.0處有最大吸光度，顯色劑取1.0 mL時吸光度同樣達到飽和狀態(tài)，從而得出結論：最佳試驗條件需要滿足以上2點。這在一定程度上為茚三酮比色法測定氨基酸做出了巨大的貢獻。王文平[14]在測定豆芽氨基酸時對該方法進行了改進，向反應體系中增加了抗壞血酸濃度，減少了試驗中因氨基酸含量不足帶來的影響。茚三酮比色法在測定果蔬鮮樣的游離氨基酸時得到廣泛運用。

由此看來，利用茚三酮比色法測定氨基酸類型和濃度時，需要發(fā)揮其操作簡單、成本低、準確度高的優(yōu)點，同時要掌控好反應條件，使試驗精度更高。掌握好該方法可以較快地測得植物蛋白中氨基酸含量，減少檢測的時間和操作步驟，更快地達到試驗目的。

1.3 雙縮脲法 果蔬經(jīng)研磨后配成相應溶液，溶液中的pH、溫度、某些有機離子含量都有可能對氨基酸含量測定產生干擾。蛋白質能在堿性環(huán)境中與Cu2+發(fā)生反應，生成紫紅色產物，根據(jù)生成物質量計算出蛋白質濃度，故使用雙縮脲法可以有效規(guī)避這些因素的干擾[15-17]。此方法應用于蛋白質測定已有近百年歷史，它被認為是一種較為經(jīng)典的蛋白質測定方法。

劉鄰渭等[18]利用該法測定了蕎麥蛋白質含量，結果與標準溶液中蛋白質含量基本相等，說明雙縮脲法精確度較高。他們還發(fā)現(xiàn)這種方法不僅適用于蛋白質溶解度高的樣品的總蛋白質含量分析，還適用于只需要分析出樣品中高溶解度蛋白質的含量。陳寧清等[19]對比了在使用不同的儀器、校準物、檢測試劑情況下雙縮脲檢驗蛋白質的精度，發(fā)現(xiàn)儀器對結果偏倚不大，但是不同的校準物和檢測試劑對測試結果影響較大，因此有必要根據(jù)實驗室狀況篩選相應的試劑。

雙縮脲法具有簡便、快速等優(yōu)點，能有效應用到蔬菜氨基酸含量測定中。但是，在選取標準樣品、繪制標準曲線時，需考慮是否與待測樣品相同或相近，因此當待測樣品種類多樣時，不宜用該方法測蛋白質總量。

1.4 考馬斯亮藍法 考馬斯亮藍法是蛋白質研究領域中一種新建立的測定蛋白質含量的方法，該方法以考馬斯亮藍試劑為蛋白質染色，最后定量測得離子的量進而計算出蛋白質的量[20-22]。與傳統(tǒng)方法相比，該法具有易操作、更快、更敏捷、受干擾程度低等優(yōu)點。

經(jīng)大量的研究表明，在測定植物的可溶性蛋白質時，凱式定氮法、雙縮脲法等都存在著一定的缺陷。由于考馬斯亮藍試劑會與蛋白質結合，形成染料復合物，對不同物質起到分辨作用，因此能較好地排除糖類、甘氨酸、其他化合物干擾，其試驗結果同樣與蛋白質標準曲線近乎吻合[23-25]。

王文平等[26]對野木瓜多糖中蛋白質含量的測定和羅群[22]對菜籽粕中蛋白質含量的定量檢測均采用考馬斯亮藍法。這些研究得出，考馬斯亮藍法能有效測定可溶性蛋白質含量，這為植物氨基酸的檢測提供很好的保障。考馬斯亮藍法為化學法測定蛋白質打下了良好的基礎，該方法的使用，也為蛋白質工業(yè)做出了巨大的貢獻。通過這種方法，可以更進一步地去了解、探究生物蛋白質成分。由于這種方法較為簡單易行，成本較低，具有較廣闊的應用前景。

2 物理法

利用蛋白質的物理性質測定蛋白質含量，如密度、折射率、紫外吸收、熒光性等，常用的方法有液相色譜法、紫外分光光度法等。與其他方法相比，物理法測氨基酸含量所需要的精確度更高，但在先進儀器的幫助下，也能使得測定結果更為準確[27]。

2.1 液相色譜法 液相色譜法分離機理是利用待分離的物質在兩相中的分配系數(shù)和吸附能力等親和力的不同進行分離的。通過一系列復雜的物化反應，最后實現(xiàn)對混合物各組分分離和檢測。經(jīng)典液相色譜在測定上存在耗時長、效率低的缺點，而高效色譜法比起前者實現(xiàn)了自動化操作，同時提高了效率[28-31]。

高效凝膠過濾液相色譜法的使用是液相色譜法在蛋白質測定上的又一次突破，王梅等[32]就以此方法對玉米蛋白酶解產物進行了測定，并較為準確地得出其蛋白酶含量和蛋白酶解產物寡肽的分子量。唐玲玲等[33]為了進一步了解高效液相色譜法的優(yōu)點，歸納、比較了多種蛋白質的分離檢測方法，從而總結出：高效液相色譜法可以較好地弄清楚蛋白質的生理特性，并且該方法具有分離效率高、分析速度快、樣品用量少、靈敏度高、分離和測定一次完成等優(yōu)點。

在測定棉籽蛋白中總棉酚與游離棉酚含量試驗中，唐輝等[34]用高效液相色譜法測量了2種蛋白粉含量，發(fā)現(xiàn)回收率為95.3%～101.7%。因此，試驗認為高效液相色譜法測定既準確，又可靠。液相色譜法能普遍運用，正是因為這種方法較為快速、方便，因此科學家們不斷更新、提升液相色譜儀的性能，以推動蛋白質化學的發(fā)展。

2.2 紫外分光光度法 紫外分光光度法是利用一定波長下蛋白質溶液的光吸收值與蛋白質濃度的正比關系，進行蛋白質含量的測定[35-37]。

花生中含有多種人體必需的氨基酸，如亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸等，而紫外分光光度法能夠精確地測定這些氨基酸的含量。徐瀾等利用紫外分光光度法測定色氨酸和酪氨酸，意在檢驗紫外分光光度法是否適用該類氨基酸的檢測。經(jīng)多次測定，徐瀾等發(fā)現(xiàn)，在有18種不同氨基酸的混合液中，以0.1 mol/L的NaOH為溶媒情況下，在280～310 nm波長中只有色氨酸和酪氨酸能顯示，通過該方案可以有效測定色氨酸和酪氨酸的含量。試驗還得出，當該方法運用于復方氨基酸注射液測定時，效果也極其顯著[38]。

董欣等[39]為了提高紫外分光光度法的準確度，又對17種不同的氨基酸進行了紫外光譜的再測定，利用不同的溶媒，尋找不同氨基酸的最適波長。這為氨基酸的研究測定提供了更可靠的技術支持。

3 結語

對于果蔬而言，不同種類的氨基酸是其生長發(fā)育中必不可少的成分[40]。如果能夠更加高效、準確地測定果蔬中各種氨基酸的含量，或許能為消費者提供更多選擇。然而在實際檢測果蔬氨基酸含量時，不同的測定方法各有利弊。總體來說，需要根據(jù)相關情況來尋求一個適合的測定方法。但這并不意味著按圖索驥進行測量，許多研究者分析比較多種測定方法，探索、制定出新式測定方案，為該種營養(yǎng)物質的測定提供了優(yōu)良的條件。

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Comparison Analysis of Determination Ways for Amino Acid Composition of Fruits and Vegetables

HU Jia-yu1, YU Jing-fen2, ZHANG Zhi-xiang1, LING Jian-gang2*

(1. Ningbo Huizhen Academy, Ningbo, Zhejiang 315016; 2. Ningbo Academy of Agricultural Sciences, Ningbo, Zhejiang 315040)

Fruits and vegetables are rich in amino acid, but some of them can't be synthesized. Determining fruits and vegetables’ amino acid content is essential in plant nutrition analysis. By analyzing and comparing determination ways for amino acid content in several common fruits and vegetables, eventually figured out that there are many new approaches fit to the modern economic production, which promotes the development of production of seasonal fruits and vegetables.

Fruits and vegetables; Amino acid composition; Determination way

寧波市科技新苗培養(yǎng)計劃項目；寧波市農業(yè)重大重點項目(2013C11007)。

胡家禹(1998- )，男，浙江寧波人，高中生。*通訊作者，副研究員，從事蔬菜保鮮、運輸研究。

2016-09-02

TS 207.3

A

0517-6611(2016)31-0042-03