牛奶中甲氧芐啶膠體金快速檢測裝置的研制

2016-03-18 16:36:38李曉娜李君秀楊星星李細清汪鳳林嚴義勇

安徽農業(yè)科學 2016年7期

李曉娜，李君秀，付輝，楊星星，李細清，汪鳳林，楊中，朱海，嚴義勇*

(1.深圳市易瑞生物技術有限公司，廣東深圳 518000；2.深圳市通量檢測科技有限公司，廣東深圳 518000)

牛奶中甲氧芐啶膠體金快速檢測裝置的研制

李曉娜1，2，李君秀1，付輝1，楊星星1，李細清1，汪鳳林1，楊中1，朱海1，嚴義勇1*

(1.深圳市易瑞生物技術有限公司，廣東深圳 518000；2.深圳市通量檢測科技有限公司，廣東深圳 518000)

摘要[目的]研究牛奶中甲氧芐啶的膠體金快速檢測裝置，快速篩查牛奶中甲氧芐啶添加物含量并評價牛奶品質。[方法]制備抗原，免疫得到抗體并摸索膠體金免疫層析裝置的樣品檢測性能。[結果]試驗所得裝置對牛奶中甲氧芐啶的肉眼可見檢測線為2 ng/L，假陽性率為0%，假陰性率為0%；與常見3種混合添加物無交叉反應，特異性高；不同批次間結果重復性高度一致；穩(wěn)定性好，易于保存，在37 ℃條件可存放35 d，50 ℃存放6 d對其質量無影響；兼容性好，適合6種不同種類奶基質；檢測時間短，僅需6 min。[結論]該研究的裝置檢測時間短，使用簡單，重復性好，產品穩(wěn)定性高，適用于牛奶中甲氧芐啶的現(xiàn)場快速篩查和檢測。

關鍵詞牛奶；甲氧芐啶；膠體金；快速檢測

甲氧芐啶是一種親脂弱堿性乙胺嘧啶類抑菌劑[1]，其抗菌譜和磺胺類藥物相似，但抗菌作用較磺胺類藥物強，對大腸桿菌、奇異變形桿菌、肺炎桿菌、腐生葡萄球菌、多種革蘭氏陽性和陰性細菌有效，但對綠膿桿菌感染無效，最低抑菌濃度常低于10 mg/L。甲氧芐啶單用易引起細菌耐藥性，故一般不單獨使用，主要與磺胺類藥組成復方制劑，因此它又被稱為磺胺增效劑，用于擴大抗菌譜，增強抗菌活性。臨床上用于治療尿路感染、腸道感染、呼吸道感染、菌痢、腸炎、傷寒、腦膜炎、中耳炎、流腦、敗血癥及軟組織感染等，可與長效磺胺類藥合用于耐藥惡性瘧的防治。隨著磺胺類藥物在獸醫(yī)臨床上不合理的使用甚至濫用，抗菌增效劑類藥物在動物源性食品中的殘留會不可避免地發(fā)生。人類長期食用含有甲氧芐啶殘留的動物源性食品及其制品，將有可能對健康產生危害。因此為了加強對動物源性食品中此類藥物的監(jiān)控，建立一種準確、快速、方便的甲氧芐啶殘留量檢測方法很有必要。

目前，國內外檢測甲氧芐啶的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)，液相色譜-質譜聯(lián)用(LC-MASS)法和酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法[2-4]。在食品安全檢測中，往往先用ELISA初篩后再對陽性樣本用HPLC或LC-MASS進行確證。上述方法中所用儀器設備復雜、成本高、對操作人員技術要求高且不能立即顯示結果，不適用于商檢、防疫、畜牧生產者對懷疑對象進行快速地在線檢測和監(jiān)控，因此筆者研制出一種能快速檢測牛奶中甲氧芐啶的裝置。

1材料與方法

1.1材料檢測用牛奶樣品購自當地超市。氯金酸、檸檬酸鈉、甲醇等化學試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司；卵清蛋白、牛血清蛋白購自生工集團；甲氧芐啶購自sigma公司；硝酸纖維素膜、吸水紙、樣品墊及反應杯購自上海必泰生物科技；所用純水為出自純化系統(tǒng)的電阻為18.2 mΩ的超純水。磁力加熱攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司；數控切條機、點模儀，杭州格倫坤科技有限公司；真空冷凍干燥機，上海比朗儀器制造有限公司。

1.2方法

1.2.1抗原制備。在100 mL的三頸瓶中依次加入2.5 g甲氧芐啶，30 mL 48%氫溴酸，100 ℃反應30 min，然后加入50%氫氧化鈉溶液6 mL淬滅。冷卻析出晶體后，將晶體溶解于20 mL沸水，隨后加入濃氨水調節(jié)pH至7，重結晶提純。

取上一步晶體0.5 g溶于10 mL DMF中，加入碳酸鉀0.5 g，及0.43 mL溴丙酸，40 ℃反應6 h。乙酸乙酯萃取過柱提純得甲氧芐啶半抗原。

1.2.2免疫抗原制備。利用甲氧芐啶半抗原制備免疫抗原。取甲氧芐啶半抗原 0.1 mmol 溶于2 mL DMF中，攪拌加入27.5 mg DCC和14.4 mg NHS。4 ℃下磁力攪拌反應過夜，離心后上清液為A液，稱取卵清蛋白(OVA)140 mg溶于10 mL濃度為0.1 mol/L的PBS(pH 8.0)中。加入DMF 1 mL，攪拌溶解制備B液，磁力攪拌下，A液逐漸滴入B液中，4 ℃下反應 12 h。離心后，取上清液，4 ℃下用生理鹽水透析3 d，每天更換3次透析液。得到的全抗原以1 mg/mL的濃度分裝于0.5 mL離心管中，凍存于 -20 ℃冰箱中。

1.2.3包被抗原的制備。利用甲氧芐啶半抗原制備包被抗原。取甲氧芐啶半抗原 0.1 mmol 溶于2 mL DMF中，攪拌加入27.5 mg DCC和14.4 mg NHS。4 ℃下磁力攪拌反應過夜，離心后上清液為A液，稱取牛血清蛋白(BSA)140 mg溶于10 mL濃度為0.1 mol/L的PBS(pH 8.0)中。加入DMF 1 mL，攪拌溶解制備B液，磁力攪拌下，A液逐漸滴入B液中，4 ℃下反應 12 h。離心后，取上清液，4 ℃下用生理鹽水透析3 d，每天更換3次透析液。得到的全抗原以1 mg/mL的濃度分裝于0.5 mL離心管中，凍存于 -20 ℃冰箱中。

1.2.4膠體金的制備。取純水100 mL，加入1 mL 1% (m/V)的氯金酸溶液，攪拌均勻并加熱至沸騰，迅速加入2.4 mL 1%(m/V)檸檬酸鈉水溶液，攪拌均勻并繼續(xù)加熱至沸騰，至液體變?yōu)榫萍t色停止加熱。冷卻至室溫，并補充水至100 mL，得到膠體金溶液。

1.2.5甲氧芐啶單克隆抗體的制備。利用甲氧芐啶免疫抗原制備單克隆抗體。使用甲氧芐啶免疫抗原并鑒定后免疫4只6周齡昆明小鼠，加強免疫3次后，采血測效價，待血清效價不再上升，用2倍劑量的抗原不加佐劑免疫小鼠，3 d后脫頸致死小鼠，在無菌條件下取脾臟制備脾細胞，與生長旺盛的小鼠骨髓瘤細胞按8∶1的比例混合于50 mL離心管，加入30 mL無血清IPMI1640培養(yǎng)基，1 100 r/min離心5 min后棄上清，將細胞團輕輕振松，置于37 ℃水浴中。將1 mL 50%PEG-4000緩緩加入細胞中，在1 min內滴完，同時輕輕攪動底部沉淀，靜置1 min后，前30 s沿管壁緩慢勻速加入無血清培養(yǎng)基 1 mL，后30 s加入2 mL，然后快速加入27 mL終止融合過程，1 100 r/min離心5 min，棄上清，用HAT選擇性培養(yǎng)基重懸后加到已鋪有飼養(yǎng)細胞的96 孔細胞培養(yǎng)板中，37 ℃、體積分數5%的CO2條件下培養(yǎng)。7 d后換成HT培養(yǎng)液，待孔內的雜交細胞數量達到300個以上時，用間接ELISA法篩選，選擇強陽性、抑制效果好、細胞生長旺盛的孔進行有限稀釋克隆化，經3次以上的克隆培養(yǎng)和檢測，均呈陽性的孔內細胞即為分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞，將雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)以備單克隆抗體的制備。

采用體內誘生腹水法生產抗甲氧芐啶單克隆抗體。選4只經產昆明小鼠，腹腔注射液體石蠟油 0.5 mL/只，7 d后腹腔注射雜交瘤細胞(3～5)×106/只，10 d后，待小鼠腹部明顯膨大時收集腹水。用正辛酸-硫酸銨沉淀法來純化腹水，經紫外測定抗甲氧芐啶單克隆抗體的含量。

1.2.6膠體金標記抗體。調節(jié)膠體金溶液pH至8.0，用恒速攪拌器均勻攪拌，同時逐滴加入甲氧芐啶的單克隆抗體，1 h后加入抗體量相當的PEG，充分反應30 min后加入抗體量相當的BSA，加完后，繼續(xù)攪拌30 min。在9 000 r/min下離心30 min獲得均一性金標抗體沉淀，再加PNPB重懸備用。

1.2.7膠體金快速檢測裝置的組裝。在底板上，沿同一方向依次將樣品墊、噴涂有甲氧芐啶-BSA(檢測線)和兔抗鼠IgG(質控線)的硝酸纖維素膜及吸水紙依次搭接粘連；反應杯內加入膠體金標記抗體，凍干。裝置結構如圖1所示。

1.2.8檢測方法。取200 μL奶樣品于微孔中混勻，(40±2)℃溫育3 min，插入試紙條，(40±2)℃溫育3 min后進行結果判讀。

1.2.9檢測裝置的性能測定。

1.2.9.1檢測限、假陽性率、假陰性率。取陰性牛奶樣本，添加甲氧芐啶標準品至濃度分別為0、1、2、3、4、5、10、15 ng/L，每個濃度重復5次，樣品處理后用檢測裝置檢測，判定檢測限、假陽性率及假陰性率。

1.2.9.2特異性。取陰性牛奶樣本，添加甲氧芐啶標準品至濃度為2 ng/L，其他藥物添加為20 ng/L，每個濃度重復5次，樣品處理后用檢測裝置檢測，判定其特異性。

1.2.9.3重復性。分別取3個不同批次的牛奶樣品，使用檢測裝置進行檢測，判斷其重復性。

1.2.9.4兼容性。分別取不同性質奶品，添加甲氧芐啶標準品濃度為0及2 ng/L，使用檢測裝置進行檢測，判斷其樣品適用性。

1.2.9.5穩(wěn)定性。將產品分別置于37及50 ℃環(huán)境，隔一定天數取出裝置進行檢測，判斷其穩(wěn)定性。

2結果與分析

2.1檢測限、假陽性率及假陰性率檢測裝置濃度設置如表1所示，試驗結果見圖2。當添加甲基芐胺濃度為0～1ng/L時，檢測線(T)顏色較對照線(C)深，結果為陰性；當添加量為2 ng/L時，T線顏色與C線相當，結果為弱陽性；當添加量為3～15 ng/L時，T線顏色遠弱于C線，此時為強陽性結果。因此，該試紙條的檢測限為3 ng/L，假陽性率及假陰性率均為0%。

注：“-”表示檢測結果為陰性，“+”表示檢測結果為陽性。