一種纖維素酶產生菌的篩選方法

徐 艷，劉玉玲，嚴漢彬，伍德政

(1.河源職業技術學院機電工程學院，廣東河源 517000；2.汕頭大學理學院，廣東汕頭 515063；3.河源市環境保護技術中心，廣東河源 517000)

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一種纖維素酶產生菌的篩選方法

徐 艷1，2，劉玉玲3，嚴漢彬1，伍德政1

(1.河源職業技術學院機電工程學院，廣東河源 517000；2.汕頭大學理學院，廣東汕頭 515063；3.河源市環境保護技術中心，廣東河源 517000)

摘要[目的]獲得一種簡單高效的纖維素酶產生菌的篩選方法。[方法]基于擴散原理，采用濾紙條擴散試驗篩選纖維素酶產生菌。[結果]獲得2株纖維素酶產生菌菌株X1和X2。經DNS法檢驗，菌株X1的FPA酶和CMC酶活力分別為12.3和8.3 U，菌株X2的FPA酶和CMC酶活力分別為8.8和7.8 U。[結論]濾紙條擴散試驗可作為一種便捷高效的篩選高質量纖維素酶產生菌的方法。

關鍵詞擴散；纖維素酶；篩選

纖維素是葡萄糖分子通過β-1，4-糖苷鍵連接而成的直鏈多糖類物質，是自然界含量最豐富的可再生資源[1-2]。纖維素酶是一類能夠將纖維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱，目前廣泛應用于畜牧業、食品工業、紡織工業以及能源工業，已成為酶工程研究的熱點[3-6]。

纖維素酶產生菌的篩選是纖維素酶工業應用的基礎。研究表明，纖維素酶工業生產的菌株一般是從環境中篩選，經基因工程改造后的重組菌株[6-10]。傳統的纖維素酶產生菌篩選一般需經過富集、初篩、復篩、純化等過程，篩選時間長，程序繁瑣，且工作量大。為此，筆者設計了一種濾紙條擴散試驗，可在富集、初篩的基礎上，初步得到單菌落，該方法簡單易行，極大地縮減了篩選工作量。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土壤。供試土壤來源于廣東省河源市筆架山周邊山地腐殖土。

1.1.2培養基。①改良牛肉膏蛋白胨培養基：CMC-Na 5.0 g/L，牛肉膏 3.0 g/L，蛋白胨 10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0。②改良高氏培養基：CMC-Na 5.0 g/L，可溶性淀粉 10.0 g/L，KNO31.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4· 7H2O 0.5 g/L，NaCl 0.5 g/L，FeSO4· 7H2O 0.01 g/L，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.6。③濾紙條培養基：(NH4)2SO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO41.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，MnSO4·H2O 2.5 mg/L，FeSO4·7H2O 7.5 mg/L，蒸餾水1 000 mL，pH自然。④羧甲基纖維素培養基：CMC-Na 5.0 g/L，(NH4)2SO44.0 g/L，KH2PO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，蛋白胨 1.0 g/L，瓊脂 15.0 g/L，蒸餾水 1 000 mL，pH自然。⑤纖維素剛果紅培養基：CMC-Na 2.0 g/L，(NH4)2SO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，K2HPO41.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，剛果紅 0.4 g/L，瓊脂 15.0 g/L，蒸餾水 1 000 mL，pH自然。

1.1.3試劑。蛋白胨(Oxoid)，羧甲基纖維素鈉(國藥集團化學試劑有限公司)，其他試劑均為國產分析純。

1.1.4溶液的配制。 葡萄糖標準溶液：葡萄糖經110 ℃烘干至恒重，準確稱量，配制0.1 mg/mL葡萄糖標準溶液。1%CMC-Na底物溶液：取0.51 g CMC-Na，加入2 mL pH 4.8，0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，混合定容至100 mL。

1.2方法

1.2.1濾紙條擴散分離。稱取0.5 g土樣加入100 mL生理鹽水中，充分振蕩10～20 min。取0.5 mL懸浮液接種于濾紙條培養基中，濾紙條1/3露出培養基液面以上。在30 ℃生化培養箱中培養，觀察濾紙上菌落生長和濾紙崩解情況。挑取濾紙條上帶有降解空洞的菌落進行剛果紅鑒定平板復篩，選擇透明圈較大者進行菌株保存，并進行后續試驗。

1.2.2濾紙酶(FPA)活力測定。 取0.5 mL上清酶液，加入1 mL pH 4.8，0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，再加入約50 mg濾紙(1 cm×5 cm)1條，于50 ℃水浴酶解10 min，然后加入3，5-二硝基水楊酸(DNS) 2 mL，沸水浴5 min，流水冷卻后于540 nm下測定吸光度。同時設置空白對照組(在試管中加入0.5 mL滅活上清酶液，計算時扣除本底)。酶活根據國際通用的酶活單位來表示，即1 mL粗酶液1 min產生1 mg/L還原糖定義為一個酶活單位(U)。

1.2.3羧甲基纖維素酶(CMC)活力測定。取0.5 mL上清酶液，加入1% CMC-Na底物溶液2 mL，50 ℃水浴酶解反應10 min，然后加入DNS 2 mL，沸水浴5 min，流水冷卻后于540 nm下測定吸光度，同時設置空白組(在試管中加入0.5 mL滅活上清酶液，計算時扣除本底)。酶活根據國際通用的酶活單位來表示，即1 mL粗酶液1 min產生1 mg/L還原糖定義為一個酶活單位(U)。

2結果與分析

2.1纖維素降解菌株的篩選土壤懸浮液接種于濾紙條培養基中，培養第2天，試管底部出現濾紙屑(圖1A)；5 d后，濾紙條出現斷裂降解現象(圖1B)，并開始在上端出現降解菌落(圖1C)，降解菌落周圍濾紙出現圓形降解空洞(圖1D)。挑取這些菌落進行剛果紅鑒定平板復篩，可得到有透明圈的菌落，選擇透明圈最大的菌株X1和X2為后續研究菌

株(圖2)。

2.2FPA酶和CMC酶活力采用DNS法測定不同pH下的酶活力，結果顯示，菌株X1的FPA酶活力最高達12.3 U，CMC酶活力最高達8.3 U。菌株X2的FPA酶活力最高達8.8 U，CMC酶活力最高達7.8 U(圖3)。

3結論與討論

該試驗依據自由擴散原理，設計濾紙條擴散試驗篩選纖維素降解菌株。由于細菌個體可隨培養液擴散至未浸沒的濾紙條，且在擴散時，培養液中的菌體因濾紙條中纖維素的阻礙作用而被分開，經培養可在濾紙條上生長形成能降解纖維素的單菌落，達到初篩分離的效果。該研究采用該方法一次性獲得2株降解能力較強的纖維素酶產生菌X1和X2，挑取單菌落進行剛果紅鑒定平板復篩培養，可得到有透明圈的菌落，經DNS法檢測酶活，顯示酶活力較強。

雖然纖維素酶的發現距今已有上百年的歷史，纖維素酶的研究與應用取得了很大進展，但纖維素酶是一種組成十分復雜的酶，其作用機理至今尚未明確。目前菌株所產的纖維素酶大部分都不同程度地存在酶系不完全、酶活不高、酶作用條件苛刻等問題。因此，選育優良的產纖維素酶菌株，提高降解天然纖維素的能力仍是當前和今后纖維素酶研究的

主要方向。

該研究通過建立操作簡單的濾紙條擴散分離篩選方法，成功地從土壤環境中篩選出具有較高酶活力的纖維素酶產生菌，這有利于更便捷地選育優良產纖維素酶菌株，為纖維素酶的進一步研究奠定基礎。

參考文獻

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A Screening Method for Cellulose-producing Strains

XU Yan1,2, LIU Yu-ling3, YAN Han-bin1et al

(1. College of Mechanic and Electronic Engineering, Heyuan Polytechnic, Heyuan, Guangdong 517000; 2. College of Science, Shantou University, Shantou, Guangdong 515063; 3. Heyuan Environment Protection Center, Heyuan, Guangdong 517000)

Key wordsDiffusion; Cellulose-producing strains; Screening

Abstract[Objective] To obtain a screening method for cellulose-producing strains, which was simple and effective. [Method] Based on the diffusion principle, filter paper diffusion experiment was used to screen the cellulose-producing strains. [Result] Two cellulose-producing strains (X1, X2) were obtained. DNS test showed that the activities of FPAase and CMCase of two strains were 12.3, 8.3；7.8, 8.8 U, respectively. [Conclusion] Results indicated that filter paper diffusion experiment could be used as a new efficient method to screen cellulose-producing strains.

基金項目廣東省科技項目(2015A040404014)；河源市科技項目(2013-139)；河源市科技項目(源科[2014]12號)。

作者簡介徐艷(1982- )，女，湖南常德人，講師，在讀博士，從事環境微生物研究。

收稿日期2016-02-08

中圖分類號S 188

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)07-122-02