南重樓中4種重樓皂苷超聲提取工藝

劉 江，段志剛，段寶忠，夏從龍　(大理大學藥學與化學學院，云南大理 671000)

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南重樓中4種重樓皂苷超聲提取工藝

劉 江，段志剛，段寶忠，夏從龍*(大理大學藥學與化學學院，云南大理 671000)

摘要[目的]優化南重樓中4種重樓皂苷提取的最佳工藝。[方法]采用L9(34)正交試驗，對提取溶劑的單次料液比、單次提取時間、初始提取溫度、提取次數4因素進行優化考察，HPLC法測定4種重樓皂苷含量并作為考察指標。[結果]最佳提取工藝單次料液比為15倍的甲醇，每次提取20 min，初始提取溫度為40 ℃，提取次數為3次。[結論]該提取工藝操作簡單、合理、可行、重復性好、穩定可靠，可用于南重樓中4種重樓皂苷的提取。

關鍵詞南重樓；重樓皂苷；HPLC法；提取工藝；正交試驗

南重樓Parisvietnamensis(Takht.)H.Li 為百合科重樓屬植物，主要分布于貴州，廣西西南部、西部，以及云南的東南部、南部和西部，越南北部也有少量分布[1-2]，其以根莖入藥，具有清熱解毒、散瘀消腫、祛痰、平喘和止血的功能[3]。查閱相關文獻表明，重樓皂苷提取方法有超聲提取法、微波提取法、酶解法、浸漬法和回流提取法等[4-6]，不同的方法具有各自的優點，超聲提取具有方便、能明顯縮短提取時間、降低提取溫度等優點，因此在重樓提取工藝中應用較多。基于超聲提取的這些優點，該試驗采用正交試驗對提取溶劑的單次料液比、單次提取時間、初始提取溫度、提取次數4因素進行優化考察，HPLC法測定4種重樓皂苷含量并作為考察指標，對南重樓中4種重樓皂苷超聲提取工藝進行優選，以獲取最佳提取工藝。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器。Agilent 1290高效液相色譜儀(G4204A Quat Pump，G4226A Sampler，G1316C TCC，G4212B DAD)；EL204十萬分之一電子天秤[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；SB25-120型超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；艾柯DZG-303A超純水機[(臺灣艾柯)成都康寧實驗專用純水設備廠]。

1.1.2試藥。重樓皂苷I、II、VI、VII對照品(貴州迪大生物科技有限責任公司，批號分別為GZDD-0605、GZDD-0606、GZDD-0608、GZDD-0609，純度均達98%以上)，流動相所用乙腈、甲醇均為HPLC級色譜純。其余試劑為分析純，水為超純水。

1.1.3試材。樣品于2014年9月18日采自云南省文山壯族苗族自治州，經大理大學藥學與化學學院生藥教研室夏從龍教授鑒定為南重樓(Parisvietnamensis)。

1.2方法

1.2.1正交試驗。選取甲醇單次料液比(A)、單次提取時間(B)、初始提取溫度(C)、提取次數(D)為考察因素，以4種重樓皂苷含量為指標，采用L9(34)正交表(表1)安排試驗。

1.2.2對照品溶液的制備。準確稱取重樓皂苷I、II、VI、VII這4種對照品，溶于甲醇配制成質量濃度分別為0.64、0.46、0.26、0.23 mg/mL的對照品溶液，按1∶1∶1∶1混合，過濾，備用。

1.2.3正交試驗供試品溶液的制備。根據L9(34)正交設計因素水平表，精密稱定南重樓粉末(過40目篩)采用對應提取方式，得到不同提取條件下的提取溶液，過濾，備用。

1.2.4方法學考察。

1.2.4.1色譜條件及系統適用性。根據藥典方法[7]進行適當的調整，色譜柱為AgilentC-18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，檢測波長為203 nm，柱溫25 ℃；流動相乙腈(A)—水(B)梯度洗脫(0～14 min，30%～40%A；14～40 min，40%A；40～70 min，40%～60%A)，流速為0.9 mL/min，進樣量5 μL。

1.2.4.2標準曲線的繪制。分別精密吸取混合對照品溶液1、2、5、10、15、20 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，測定峰面積。以進樣量X(μg)為橫坐標、峰面積Y為縱坐標進行線性回歸。

1.2.4.3精密度試驗。精密吸取對照品溶液連續進樣5次，測定重樓皂苷I、II、VI、VII的峰面積，計算RSD值。

1.2.4.4穩定性考察。取供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣測定峰面積，計算重樓皂苷I、II、VI、VII峰面積的RSD值。

1.2.4.5重復性試驗。取樣品5份，按最優工藝制備供試品溶液，測定重樓皂苷I、II、VI、VII的含量并計算其RSD。

1.2.4.6加樣回收率試驗。精密稱定樣品5份，加入各對照品適量，按選定的最優工藝制備供試品溶液。按“1.2.4.1”色譜條件測定重樓皂苷I、II、VI、VII的含量并計算其RSD。

1.2.5樣品含量測定。吸取供試品溶液和混合對照品溶液，按“1.2.4.1”色譜條件測定各色譜峰的峰面積，利用標準曲線法計算含量。

1.2.6驗證試驗。精密稱定樣品5份，以選定最優工藝提取，按“1.2.4.1 ”色譜條件測定重樓皂苷I、II、VI、VII的含量以考察最優工藝的穩定性。

2結果與分析

2.1方法學考察

2.1.1系統適用性。圖1表明，在“1.2.4.1”條件下，樣品所測主峰旁無明顯雜質峰，經計算樣品峰與其他峰的分離度>1.5，理論塔板數按重樓皂苷I、II、VI、VII計算均不低于10 000，符合含量測定要求。

2.1.2標準曲線的繪制。按“1.2.4.2”測定，以進樣量X(μg)為橫坐標、峰面積Y為縱坐標得出重樓皂苷I、II、VI、VII的線性回歸方程分別為YI=366.44XI+3.07(r=0.999 9)、YII=377.60XII+2.42(r=0.999 9)、YVI=340.35XVI+1.63(r=0.999 9)、YVII=344.22XVII+0.37(r=0.999 9)，表明重樓皂苷I、II、VI、VII分別在0.64～12.80、0.46～9.20、0.26～5.20、0.23～4.60 μg范圍內線性關系良好。

2.1.3精密度試驗。連續進樣5次，重樓皂苷I、II、VI、VII峰面積的RSD分別為2.34%、2.06%、2.17%、2.10%，表明該方法精密度良好。

2.1.4穩定性考察。按“1.2.4.4”操作，重樓皂苷I、II、VI、VII峰面積的RSD分別為2.02%、2.71%、2.72%、2.98%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.1.5重復性試驗。平行樣5份，測定重樓皂苷I、II、VI、VII的含量，其含量的RSD分別為0.54%、2.15%、1.91%、2.78%，表明方法重復性良好。

2.1.6加樣回收率試驗。按“1.2.4.6”操作，測定重樓皂苷I、II、VI、VII的平均回收率分別為101.04%、101.73%、98.69%、101.17%，RSD分別為1.33%、2.34%、1.64%、2.17%。

2.2樣品含量測定按L9(34)正交表進行試驗，結果表明(表2)，南重樓中重樓皂苷的最佳提取工藝為A3B2C2D3組合，即15倍的溶媒，每次提取20 min，初始提取溫度為40 ℃，提取3次，極差R順序為D>C>A>B，即所考察因素中提取次數對重樓皂苷的提取率影響最大，其次為初始提取溫度、甲醇單次料液比、單次提取時間。

2.3驗證試驗由表3可知，通過選定的最優工藝提取的樣品，其總含量的平均值為13.349 mg/g，RSD=0.84%，表明該工藝達到了優化目的且穩定性良好。

3討論與結論

近年來已有很多研究通過正交試驗來優化重樓皂苷的提取工藝[8-12]，盧偉等[9]采用正交試驗優選出重樓甾體皂苷最佳提取工藝為90%的乙醇溶液加熱回流提取，料液比為1∶12，提取3次，每次1 h；馮旋等[11]采用正交試驗優選出提取重樓甾體皂苷的最佳工藝為4倍于生藥量的70%乙醇回流提取3次，每次2 h；郭莉萍等[13]基于均勻設計優化出重樓皂苷提取的最佳工藝為加熱回流時間20 min、浸泡時間29.02 h、提取液乙醇濃度39.68%、加熱回流次數8次，但各提取工藝不盡相同，且總皂苷的含量也各不相同。而該試驗綜合以上試驗全面地考察了南重樓中4種重樓皂苷的提取工藝，試驗采用HPLC法測定4種重樓皂苷含量并作為考察指標，以L9(34)正交試驗考察了超聲提取4種重樓皂苷中不同因素對提取率的影響，結果表明，對重樓皂苷提取率影響最大的因素為提取次數，其次為初始提取溫度和甲醇單次料液比，影響最小的為單次提取時間；得出最佳工藝為甲醇單次料液比1∶15、每次提取20 min、初始提取溫度為40 ℃、提取3次，最優工藝驗證試驗結果表明該方法可行、重復性好、穩定可靠，可用于南重樓中4種重樓皂苷的提取，通過該試驗進一步優化南重樓中4種重樓皂苷的提取工藝，為南重樓中4種重樓皂苷的提取提供理論依據。

參考文獻

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Ultrasonic Extraction Technology of Four Kinds of Polyphyllin inParisvietnamensis

LIU Jiang, DUAN Zhi-gang, DUAN Bao-zhong, XIA Cong-long*

(College of Pharmacy and Chemistry, Dali University, Dali, Yunnan 671000)

Key wordsParisvietnamensis; Polyphyllin; HPLC method; Extraction technology; Orthogonal design

Abstract[Objective] To select the optimal extraction procedure of polyphyllin from four kinds ofParisvietnamensis. [Method] L9(34) orthogonal test was adopted to investigate the four factors of solid-liquid ratio, extraction time, initial extraction temperature and extraction times. Polyphyllin contents in four kinds ofP.vietnamensiswere detected by HPLC method. [Result] The optimal extraction condition was as follows: 15 times of methanol, 20 min extraction time, 40 ℃ extraction temperature, and three extraction times. [Conclusion] This extraction technology is simple, stable, reliable, reasonable and feasible, and can be used for the extraction of polyphyllin from four kinds ofP.vietnamensis.

基金項目云南省科技廳面上項目(2013FB059)。

作者簡介劉江(1991- )，男，云南曲靖人，碩士研究生，研究方向：藥用植物的藥效學。*通訊作者，教授，碩士，碩士生導師，從事天然藥物資源調查與品質評價研究。

收稿日期2016-01-22

中圖分類號S 567.23+9

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)07-158-03