南重樓中4種重樓皂苷超聲提取工藝

劉 江，段志剛，段寶忠，夏從龍　(大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000)

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南重樓中4種重樓皂苷超聲提取工藝

劉 江，段志剛，段寶忠，夏從龍*(大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理 671000)

摘要[目的]優(yōu)化南重樓中4種重樓皂苷提取的最佳工藝。[方法]采用L9(34)正交試驗(yàn)，對(duì)提取溶劑的單次料液比、單次提取時(shí)間、初始提取溫度、提取次數(shù)4因素進(jìn)行優(yōu)化考察，HPLC法測(cè)定4種重樓皂苷含量并作為考察指標(biāo)。[結(jié)果]最佳提取工藝單次料液比為15倍的甲醇，每次提取20 min，初始提取溫度為40 ℃，提取次數(shù)為3次。[結(jié)論]該提取工藝操作簡(jiǎn)單、合理、可行、重復(fù)性好、穩(wěn)定可靠，可用于南重樓中4種重樓皂苷的提取。

關(guān)鍵詞南重樓；重樓皂苷；HPLC法；提取工藝；正交試驗(yàn)

南重樓Parisvietnamensis(Takht.)H.Li 為百合科重樓屬植物，主要分布于貴州，廣西西南部、西部，以及云南的東南部、南部和西部，越南北部也有少量分布[1-2]，其以根莖入藥，具有清熱解毒、散瘀消腫、祛痰、平喘和止血的功能[3]。查閱相關(guān)文獻(xiàn)表明，重樓皂苷提取方法有超聲提取法、微波提取法、酶解法、浸漬法和回流提取法等[4-6]，不同的方法具有各自的優(yōu)點(diǎn)，超聲提取具有方便、能明顯縮短提取時(shí)間、降低提取溫度等優(yōu)點(diǎn)，因此在重樓提取工藝中應(yīng)用較多。基于超聲提取的這些優(yōu)點(diǎn)，該試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)對(duì)提取溶劑的單次料液比、單次提取時(shí)間、初始提取溫度、提取次數(shù)4因素進(jìn)行優(yōu)化考察，HPLC法測(cè)定4種重樓皂苷含量并作為考察指標(biāo)，對(duì)南重樓中4種重樓皂苷超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，以獲取最佳提取工藝。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器。Agilent 1290高效液相色譜儀(G4204A Quat Pump，G4226A Sampler，G1316C TCC，G4212B DAD)；EL204十萬(wàn)分之一電子天秤[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；SB25-120型超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；艾柯DZG-303A超純水機(jī)[(臺(tái)灣艾柯)成都康寧實(shí)驗(yàn)專用純水設(shè)備廠]。

1.1.2試藥。重樓皂苷I、II、VI、VII對(duì)照品(貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司，批號(hào)分別為GZDD-0605、GZDD-0606、GZDD-0608、GZDD-0609，純度均達(dá)98%以上)，流動(dòng)相所用乙腈、甲醇均為HPLC級(jí)色譜純。其余試劑為分析純，水為超純水。

1.1.3試材。樣品于2014年9月18日采自云南省文山壯族苗族自治州，經(jīng)大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院生藥教研室夏從龍教授鑒定為南重樓(Parisvietnamensis)。

1.2方法

1.2.1正交試驗(yàn)。選取甲醇單次料液比(A)、單次提取時(shí)間(B)、初始提取溫度(C)、提取次數(shù)(D)為考察因素，以4種重樓皂苷含量為指標(biāo)，采用L9(34)正交表(表1)安排試驗(yàn)。

1.2.2對(duì)照品溶液的制備。準(zhǔn)確稱取重樓皂苷I、II、VI、VII這4種對(duì)照品，溶于甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.64、0.46、0.26、0.23 mg/mL的對(duì)照品溶液，按1∶1∶1∶1混合，過(guò)濾，備用。

1.2.3正交試驗(yàn)供試品溶液的制備。根據(jù)L9(34)正交設(shè)計(jì)因素水平表，精密稱定南重樓粉末(過(guò)40目篩)采用對(duì)應(yīng)提取方式，得到不同提取條件下的提取溶液，過(guò)濾，備用。

1.2.4方法學(xué)考察。

1.2.4.1色譜條件及系統(tǒng)適用性。根據(jù)藥典方法[7]進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，色譜柱為AgilentC-18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，柱溫25 ℃；流動(dòng)相乙腈(A)—水(B)梯度洗脫(0～14 min，30%～40%A；14～40 min，40%A；40～70 min，40%～60%A)，流速為0.9 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。

1.2.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別精密吸取混合對(duì)照品溶液1、2、5、10、15、20 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。

1.2.4.3精密度試驗(yàn)。精密吸取對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定重樓皂苷I、II、VI、VII的峰面積，計(jì)算RSD值。

1.2.4.4穩(wěn)定性考察。取供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定峰面積，計(jì)算重樓皂苷I、II、VI、VII峰面積的RSD值。

1.2.4.5重復(fù)性試驗(yàn)。取樣品5份，按最優(yōu)工藝制備供試品溶液，測(cè)定重樓皂苷I、II、VI、VII的含量并計(jì)算其RSD。

1.2.4.6加樣回收率試驗(yàn)。精密稱定樣品5份，加入各對(duì)照品適量，按選定的最優(yōu)工藝制備供試品溶液。按“1.2.4.1”色譜條件測(cè)定重樓皂苷I、II、VI、VII的含量并計(jì)算其RSD。

1.2.5樣品含量測(cè)定。吸取供試品溶液和混合對(duì)照品溶液，按“1.2.4.1”色譜條件測(cè)定各色譜峰的峰面積，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。

1.2.6驗(yàn)證試驗(yàn)。精密稱定樣品5份，以選定最優(yōu)工藝提取，按“1.2.4.1 ”色譜條件測(cè)定重樓皂苷I、II、VI、VII的含量以考察最優(yōu)工藝的穩(wěn)定性。

2結(jié)果與分析

2.1方法學(xué)考察

2.1.1系統(tǒng)適用性。圖1表明，在“1.2.4.1”條件下，樣品所測(cè)主峰旁無(wú)明顯雜質(zhì)峰，經(jīng)計(jì)算樣品峰與其他峰的分離度>1.5，理論塔板數(shù)按重樓皂苷I、II、VI、VII計(jì)算均不低于10 000，符合含量測(cè)定要求。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。按“1.2.4.2”測(cè)定，以進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)得出重樓皂苷I、II、VI、VII的線性回歸方程分別為YI=366.44XI+3.07(r=0.999 9)、YII=377.60XII+2.42(r=0.999 9)、YVI=340.35XVI+1.63(r=0.999 9)、YVII=344.22XVII+0.37(r=0.999 9)，表明重樓皂苷I、II、VI、VII分別在0.64～12.80、0.46～9.20、0.26～5.20、0.23～4.60 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3精密度試驗(yàn)。連續(xù)進(jìn)樣5次，重樓皂苷I、II、VI、VII峰面積的RSD分別為2.34%、2.06%、2.17%、2.10%，表明該方法精密度良好。

2.1.4穩(wěn)定性考察。按“1.2.4.4”操作，重樓皂苷I、II、VI、VII峰面積的RSD分別為2.02%、2.71%、2.72%、2.98%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5重復(fù)性試驗(yàn)。平行樣5份，測(cè)定重樓皂苷I、II、VI、VII的含量，其含量的RSD分別為0.54%、2.15%、1.91%、2.78%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.6加樣回收率試驗(yàn)。按“1.2.4.6”操作，測(cè)定重樓皂苷I、II、VI、VII的平均回收率分別為101.04%、101.73%、98.69%、101.17%，RSD分別為1.33%、2.34%、1.64%、2.17%。

2.2樣品含量測(cè)定按L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明(表2)，南重樓中重樓皂苷的最佳提取工藝為A3B2C2D3組合，即15倍的溶媒，每次提取20 min，初始提取溫度為40 ℃，提取3次，極差R順序?yàn)镈>C>A>B，即所考察因素中提取次數(shù)對(duì)重樓皂苷的提取率影響最大，其次為初始提取溫度、甲醇單次料液比、單次提取時(shí)間。

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)由表3可知，通過(guò)選定的最優(yōu)工藝提取的樣品，其總含量的平均值為13.349 mg/g，RSD=0.84%，表明該工藝達(dá)到了優(yōu)化目的且穩(wěn)定性良好。

3討論與結(jié)論

近年來(lái)已有很多研究通過(guò)正交試驗(yàn)來(lái)優(yōu)化重樓皂苷的提取工藝[8-12]，盧偉等[9]采用正交試驗(yàn)優(yōu)選出重樓甾體皂苷最佳提取工藝為90%的乙醇溶液加熱回流提取，料液比為1∶12，提取3次，每次1 h；馮旋等[11]采用正交試驗(yàn)優(yōu)選出提取重樓甾體皂苷的最佳工藝為4倍于生藥量的70%乙醇回流提取3次，每次2 h；郭莉萍等[13]基于均勻設(shè)計(jì)優(yōu)化出重樓皂苷提取的最佳工藝為加熱回流時(shí)間20 min、浸泡時(shí)間29.02 h、提取液乙醇濃度39.68%、加熱回流次數(shù)8次，但各提取工藝不盡相同，且總皂苷的含量也各不相同。而該試驗(yàn)綜合以上試驗(yàn)全面地考察了南重樓中4種重樓皂苷的提取工藝，試驗(yàn)采用HPLC法測(cè)定4種重樓皂苷含量并作為考察指標(biāo)，以L9(34)正交試驗(yàn)考察了超聲提取4種重樓皂苷中不同因素對(duì)提取率的影響，結(jié)果表明，對(duì)重樓皂苷提取率影響最大的因素為提取次數(shù)，其次為初始提取溫度和甲醇單次料液比，影響最小的為單次提取時(shí)間；得出最佳工藝為甲醇單次料液比1∶15、每次提取20 min、初始提取溫度為40 ℃、提取3次，最優(yōu)工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明該方法可行、重復(fù)性好、穩(wěn)定可靠，可用于南重樓中4種重樓皂苷的提取，通過(guò)該試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化南重樓中4種重樓皂苷的提取工藝，為南重樓中4種重樓皂苷的提取提供理論依據(jù)。

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Ultrasonic Extraction Technology of Four Kinds of Polyphyllin inParisvietnamensis

LIU Jiang, DUAN Zhi-gang, DUAN Bao-zhong, XIA Cong-long*

(College of Pharmacy and Chemistry, Dali University, Dali, Yunnan 671000)

Key wordsParisvietnamensis; Polyphyllin; HPLC method; Extraction technology; Orthogonal design

Abstract[Objective] To select the optimal extraction procedure of polyphyllin from four kinds ofParisvietnamensis. [Method] L9(34) orthogonal test was adopted to investigate the four factors of solid-liquid ratio, extraction time, initial extraction temperature and extraction times. Polyphyllin contents in four kinds ofP.vietnamensiswere detected by HPLC method. [Result] The optimal extraction condition was as follows: 15 times of methanol, 20 min extraction time, 40 ℃ extraction temperature, and three extraction times. [Conclusion] This extraction technology is simple, stable, reliable, reasonable and feasible, and can be used for the extraction of polyphyllin from four kinds ofP.vietnamensis.

基金項(xiàng)目云南省科技廳面上項(xiàng)目(2013FB059)。

作者簡(jiǎn)介劉江(1991- )，男，云南曲靖人，碩士研究生，研究方向：藥用植物的藥效學(xué)。*通訊作者，教授，碩士，碩士生導(dǎo)師，從事天然藥物資源調(diào)查與品質(zhì)評(píng)價(jià)研究。

收稿日期2016-01-22

中圖分類號(hào)S 567.23+9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)07-158-03