陽虛質膝骨性關節炎軟骨組織Sox9、Col2al基因表達的研究*

李盛華，周明旺，潘 文，王曉萍，敬平福，喬 斌，陳 威，陳 嫻

1 甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050；2 甘肅省中醫藥研究院

陽虛質膝骨性關節炎軟骨組織Sox9、Col2al基因表達的研究*

李盛華1，周明旺1，潘 文2，王曉萍1，敬平福1，喬 斌1，陳 威1，陳 嫻1

1 甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050；2 甘肅省中醫藥研究院

目的：通過檢測關節軟骨Sox9、Col2al基因在陽虛質與平和質兩者之間的表達水平，探討膝骨性關節炎中Sox9、Col2al與中醫體質的內在聯系和規律。方法：2012年10月20日至2014年12月27日，對甘肅省中醫院關節骨科門診及住院部確診為膝骨性關節炎的患者進行中醫體質問卷調查，同時調查、收集非膝骨性關節炎正常人群的一般資料。在顯微鏡下觀察不同體質KOA患者軟骨的病理改變，采取免疫組化及Real-Time RT-PCR的方法檢測Sox9基因、Col2al在陽虛質膝骨性關節炎患者膝關節軟骨細胞mRNA及蛋白水平中的表達。結果：在對實驗結果進行分析后發現在不同體質的KOA患者中，陽虛質KOA患者中軟骨內細胞排列紊亂，細胞聚集成團或者局部退化消失，Sox9在軟骨細胞核中表達，Col2al在細胞外基質中表達，在陽虛質KOA、陽虛質非KOA患者軟骨細胞內呈現高表達狀態，在平和質KOA相對陽虛體質表達比較低，兩者的表達比較差異均有統計學意義（P＜0.05)。結論：膝骨性關節炎發病的體質危險因素主要為陽虛質。在分子表達水平Sox9及Col2al均呈現高表達，其與中醫體質存在一定的內在相關性，說明體質因素是誘發膝骨性關節炎的高危因素，因人的體質是相對恒定的，某一疾病的誘發是具有時間性的，故陽虛質是膝骨性關節炎中誘導Sox9及Col2al高表達的主要因素之一。

膝骨性關節炎；Sox9；Col2al；中醫體質；陽虛質

1 資料與方法

1.1 臨床資料 標本來源于2013年10月至

2014年10月在甘肅省中醫院行人工膝關節全膝置換術患者，共采集65例軟骨組織，將所獲得標本分成4份(分別用于mRNA、蛋白表達檢測、HE染色及免疫組化)。標本在無菌條件下采集后迅速置于小型隨身液氮瓶中，30分鐘內轉入-80℃冰箱備用。在實驗中，隨機選取陽虛質、平和質、非膝骨性關節炎患者標本各10例。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫診斷標準 符合KOA診斷標準［2］者。具體如下：患者除有膝關節疼痛，還伴有下列7項中的3項者：1)年齡≥45歲；2)晨僵＜30分鐘；3)關節活動時有骨響聲；4)膝部檢查示骨性肥大；5)有骨壓痛；6)無明顯皮溫升高；7)放射學檢查有關節間隙明顯變窄及骨贅形成。

1.2.2 中醫診斷標準 符合《中藥新藥臨床研究指導原則》中的關于膝關節骨性關節炎的診斷標準。具體標準如下：1)初起膝關節隱隱作痛，屈伸不利，輕微活動稍緩解，氣候變化加重，反復纏綿不愈；2)起病隱襲，發病緩慢，多常見中老年人；3)膝部可輕度腫脹，活動時關節常有喀嚓聲和磨擦聲；4)X線檢查可見骨質疏松，關節間隙變窄，軟骨下骨質硬化，邊緣唇樣改變，骨贅形成。

1.3 納入標準 納入：1)符合中西醫診斷標準的KOA患者(包括接受手術或中醫藥對癥治療者)；2)不伴有其他嚴重的心、腦、腎等原發性疾病者；3)愿意接受本次科研調查者。

1.4 排除標準 排除：1)診斷為創傷性KOA者；2)妊娠或哺乳期婦女；3)過敏體質者或不能接受本調查者；4)類風濕性關節炎、強直性脊柱炎及患有嚴重膝關節疾病者；5)合并有嚴重的內臟病變者或其他嚴重代謝異常疾病及骨腫瘤者；6)精神病患者、智力障礙者；7)正在參加其他臨床實驗者。

1.5 病例剔除和脫落標準 剔除和脫落：1)依從性差，未能按要求填寫者；2)采集項目不完整，缺項多于20%者；3)體質分型判定為兼夾體質者。

1.6 中醫體質分類及判定標準 采用中華中醫藥學會于2009年4月9日頒布的《中醫體質分類與判定》標準，判定陽虛質KOA的中醫體質類型。

1.7 指標檢測

1.7.1 HE染色觀察關節軟骨 將手術臺上切取的關節軟骨標本，修剪成約1.5 cm×1 cm×0.2 cm大小，迅速置于10%中性甲醛溶液內固定48小時，流水沖洗2～3小時，脫水，透明，石蠟包埋。冷凍切片，采用HE染色法觀察軟骨退變情況。

1.7.2 免疫組化法檢測關節軟骨中Sox9、Col2al蛋白表達 關節軟骨標本處理方法同“1.7.1”項，免疫組化法檢測Sox9及Col2al表達水平。

1.7.3 RT-PCR法檢測關節軟骨中Sox9、Col2al基因表達 1)軟骨標本RNA提取，-80℃冰箱保存；2)合成cDNA第一鏈；3)RT-PCR擴增反應：采用二步法PCR擴增反應，反應結束后確認Real Time PCR的擴增曲線和溶解曲線。

采用2-ΔΔCt法進行數據分析，Ct值是指每個反應孔內熒光強度達到設定的閾值時所經歷的循環數。ΔCt=目的基因Ct值-管家基因GAPDH Ct值，ΔΔCt=(目的基因Ct-GAPDH Ct)病例組-(目的基因Ct-GAPDH Ct)對照組。相對基因表達RGE(relative gene expression)=2-ΔΔCt，2-ΔΔCt表示的是實驗組目的基因的表達相對于對照組基因的變化倍數。

1.8 統計學方法 數據運用SPSS 21.0軟件進行分析，定量資料用表示，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色結果 陽虛質KOA組Sox9陽性染色率為20%(2/10)，其中陰性8例，弱陽性(+)1例，中度陽性(++)1 例。平和質KOA組Sox9 染色陽性率為 40%(4/10)，其中陰性(-)6 例，弱陽性(+)2 例，中度陽性(++)1例，強陽性(+++)1例。陽虛質非KOA組Sox9染色陽性率為80%(8/10)，其中陰性(-)2例，弱陽性(+)2例，中度陽性(++)3例，強陽性(+++)3例。3組間染色陽性率比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 3組Sox9染色陽性率對比分析

陽虛質KOA患者關節軟骨，Sox9表達相對較高，核仁明顯，呈棕黃色，軟骨組織基質有不規則排列的稀疏的膠原纖維網狀結構組成；平和質KOA患者關節軟骨，可見軟骨組織內膠原纖維增多，軟骨細胞明顯減少，偶可見空泡征；陽虛質非KOA患者關節軟骨HE染色鏡下表現，軟骨基質內膠原纖維增多，細胞染色變淺，大量細胞核仁消失，細胞呈現空泡征。見圖1。

圖1 不同體質KOA患者軟骨組織HE染色形態圖(×200)

2.2 免疫組化染色結果 退變關節軟骨中Sox9及Col2al均有不同程度的表達，但是程度不一樣，Sox9定位于細胞核中，Col2al定位于細胞外基質中，在不同的組別均有不同表達。陽虛質KOA組中Sox9及Col2al呈現低表達，平和質KOA組相對陽虛質呈現高表達，但是相對于陽虛質非KOA中變達略低，且Sox9與Col2al的表達呈正相關表達一致。平和質KOA患者Sox9位于胞核內，表達強度+2；Col2al蛋白陽性表達相對較多，表達強度+4。平和質KOA患者，Sox9蛋白產物陽性表達較少，表達強度+1，弱陽性；Col2al位于胞核基質內，表達強度+2。陽虛質非KOA患者，Sox9蛋白陽性表達相對較多，表達強度+3；Col2al蛋白產物陽性表達較少，表達強度+1，弱陽性。見圖2—3。

圖2 Sox9在不同體質KOA患者軟骨中的表達(×200)

圖3 Col2al在不同體質KOA患者軟骨中的表達(×200)

2.3 Sox9、Col2al和內參基因GAPDH在膝關節軟骨內的表達 陽虛質、平和質和陽虛質非KOA3組之間CT值均數及線性比較見圖4—5。

圖4 CT值均數比較

圖5 CT值線性比較

3 討論

KOA是一種老年性、慢性退行性骨關節病［3-4］。前期研究結果表明，陽虛質體質仍是KOA的最常見體質［5］。目前軟骨退變的分子機理仍不完全清楚，但軟骨調控相關基因表達異常可能與退行性改變相關［6］，從而證明Sox9是調控軟骨形成的重要基因。本研究結果表明，陽虛質KOA患者關節軟骨中Sox9表達下降，表明體質變化也是其中的一個不容忽視的因素。Ⅱ型膠原(Col2al)是關節軟骨構成的主要成分，是軟骨的空間構架［7］，在軟骨的應力和應變中，Col2al和蛋白多糖(PG)共同完成。在KOA病變過程中，Col2al的缺失、退變，影響膝關節的正常生理活動。大量實驗研究表明，Sox9基因是一個轉錄因子，與人類性別基因SPY緊密相連，參與軟骨細胞中Col2al的細胞特異性激活作用，控制Col2al在軟骨細胞中的表達，在Sox5和Sox6的協助下，其作用進一步加強［8］，在KOA患者病變處，炎性因子抑制Sox9的軟骨生成作用，間接導致Col2al的表達降低，軟骨細胞再生和修復能力減弱，成為KOA患者疾病難愈的重要原因［9］。本研究中，Sox9基因與Col2al蛋白基因均處于低表達狀態，而Sox9與Col2al的正相關表達，說明二者可能處于同一信號通路。位于細胞核的Sox9直接結合Col2al的增強子、或與其他蛋白結合形成轉錄復合體調控Col2al的表達［10-12］與本次實驗的研究結果一致。本研究結果表明，陽虛質KOA組Col2al的表達隨Sox9的表達的減少而減少，說明二者有正比關系，在平和質KOA組Sox9和Col2al的含量總體小于陽虛質非KOA組，相對于陽虛質非KOA組，因其關節軟骨未發生病理性的退化、改變，Sox9和Col2al的表達均高于前2組。本研究將中醫體質與現代分子生物學實驗技術相結合，探討陽虛質KOA與Sox9、Col2al的相關性，從而為中醫藥利用體質辨識、調體干預并防治KOA提供理論依據及治療靶點。

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Study on Expression of Sox9 and Col2al Genes in Cartilage Tissue of Knee Osteoarthritis with Yang Deficiency Constitution

Li Shenghua1,Zhou Mingwang1,Pan Wen2,Wang Xiaoping1,Jing Pingfu1,Qiao Bin1,Chen Wei1,Chen Xian11 Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730050,China; 2 Gansu Provincial Academy of Chinese Medicine

Objective: To discuss the internal relations and rules of Sox9, Col2al and traditional Chinese medicine constitutions in knee osteoarthritis through detecting the expression level of Sox9 and Col2al genes in the patients of Yang deficiency and constitution. Methods: From October 20th, 2012 to December 27th, 2014, the TCM constitution questionnaire for patients in outpatient and inpatient in joint department of orthopedics of Gansu Provincial Hospital of traditional Chinese medicine with diagnosis of knee osteoarthritis was conducted, at the same time, the general information of non knee osteoarthritis and normal people were investigated and collected. The cartilaginous pathological changes of KOA patients in different constitutions under the microscope was observed, and the expressions of Sox9 gene and Col2al in mRNA of knee cartilage cells and the protein of Yang deficiency patients with osteoarthritis were detected with the methods of immunohistochemistry and Real-Time RT-PCR. Results: After the analysis of the experimental results, it was found that in the KOA patients with different physical constitutions, the arrangement of the chondrocytes were disordered in KOA patients with Yang deficiency, and the cells were aggregated into clusters or local degeneration and disappearance. Sox9 was expressed in the nucleus of cartilage while Col2al was expressed in the extracellular matrix. They were highly expressed within the cartilage cells in KOA patients with Yang deficiency and non KOA patients with Yang deficiency, and the expression of KOA patients with normal constitution was relatively lower than that of KOA patients with Yang deficiency. There was a significant difference between the two expressions (P＜0.05). Conclusion: The main risk factors of the morbidity of knee osteoarthritis is Yang deficiency constitution. At the molecular expression level, Sox9 and Col2al are both highly expressed, and there is a certain intrinsic correlation with TCM constitution. This shows that the constitution factors are the high risk factors which can induce knee osteoarthritis. People's constitution is relatively constant, the induction of a disease is a matter of time. Therefore, Yang deficiency constitution is one of the main factors which induce Sox9 and Col2al high expression in knee osteoarthritis.

knee osteoarthritis; Sox9; Col2al; constitution of traditional Chinese medicine; Yang deficiency constitution骨關節炎(Osteoarthritis，OA)高發于中老年人，臨床主要以關節晨起僵硬、疼痛并活動時加劇，導致活動受限，在日常活動中可聞及關節“咔咔”摩擦聲。近年來，國內骨關節炎患病率逐年上升，高達9.56%，60歲以上可高達78.5%［1］。膝關節骨性關節炎(Knee Osteoarthritis，KOA)病因復雜，病程相對較長，許多患者病程可長達20年，近年來大量臨床研究顯示，關節軟骨變性或損傷后出現皸裂、退變等，是引起患者身心受損、關節疼痛的主要原因之一。

R684.3

A

1004-6852(2016)12-0001-04

2016-06-24

國家自然科學基金項目(編號81260546)；甘肅省自然科學基金項目(編號1208RJYA041)；甘肅省中醫藥管理局科研項目(編號GZK-2015-10)。

李盛華(1959—)，男，教授，主任醫師，博士研究生導師，享受國務院特殊津貼專家，衛生部突出貢獻中青年專家，甘肅省優秀專家，甘肅省名中醫，甘肅省領軍人才第一層次，甘肅省“555”創新人才，甘肅省“333”科技人才，甘肅省衛生廳跨世紀學術技術帶頭人，甘肅省中醫院首席主任醫師，國家級重點學(專)科——骨科學科帶頭人，中華中醫藥學會理事，中華中醫藥學會骨傷分會副主任委員，中國中西醫結合學會骨科微創專業委員會主任委員，中國中西醫結合學會脊柱醫學專業委員會常務理事，甘肅省中醫藥學會副會長，甘肅省中西醫結合學會副會長，甘肅省康復學會副會長，甘肅省中醫藥學會骨傷專業委員會主任委員，甘肅省中西醫結合學會骨傷科專業委員會主任委員，《中國中醫骨傷科》雜志副主編，《西部中醫藥》雜志編委會副主任，《中國骨傷》《中醫正骨》雜志編委。隴中正骨學術流派傳承工作室負責人。研究方向：骨與關節疾病的中西醫結合治療。