GPX1過表達對肺癌BERP35T1細胞DNA氧化損傷和惡性表型的影響

邵　 帥，魏志權，張　 偉，佟　 鵬，王春燕，齊雪松，茍 巧*（中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫學所，輻射防護與核應急重點實驗室，北京 100088）

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GPX1過表達對肺癌BERP35T1細胞DNA氧化損傷和惡性表型的影響

邵 帥，魏志權，張 偉，佟 鵬，王春燕，齊雪松，茍 巧*
（中國疾病預防控制中心輻射防護與核安全醫學所，輻射防護與核應急重點實驗室，北京 100088）

【摘要】目的： 探討谷胱甘肽過氧化物酶1(GPX1)過表達對α粒子輻射致肺癌BERP35T1細胞DNA氧化損傷和惡性表型的影響。方法：構建pEGFP-GPX1真核表達載體，經PCR、雙酶切和測序鑒定后，采用脂質體法將重組質粒及其對照空載體分別轉染至BERP35T1細胞中，篩選出具有G418抗性的細胞株，經Western blot法測定GPX1蛋白在細胞株中的表達情況；通過免疫細胞化學法、四甲基噻唑藍(MTT)法、劃痕愈合試驗和錨著獨立生長試驗分別檢測GPX1過表達對BERP35T1細胞內DNA氧化損傷產物8-羥化脫氧鳥苷(8-OHdG)水平，細胞增殖、遷移以及錨著獨立生長能力的影響。結果：pEGFP-GPX1經PCR、雙酶切鑒定和DNA測序證實，GPX1片段的序列完全正確；并獲得GPX1穩定表達BERP35T1細胞株BERP35T1-GPX1-6，其GPX1蛋白水平是對照空載體轉染細胞的4.01倍(P<0.05)；與BERP35T1細胞和對照空載體轉染細胞相比，BERP35T1-GPX1-6細胞內8-OHdG水平降低，細胞的增殖、遷移和錨著獨立生長能力均減弱(P<0.05)。結論：過表達GPX1可能通過清除細胞內活性氧降低DNA氧化損傷水平，從而抑制BERP35T1細胞增殖、遷移和錨著獨立生長能力等惡性表型。

【關鍵詞】谷胱甘肽過氧化物酶1；α粒子；肺癌；氧化損傷

作者信息： 邵 帥，Tel：010-62389938，E-mail：shaoshuai_0829@126.com。*通信作者，茍 巧，Tel：010-62389616，E-mail：xiaogou824@ 163.com

Effects of glutathione peroxidase 1 overexpression on DNA oxidative damage and phenotype of malignant BERP35T1 cells

SHAO Shuai，WEI Zhiquan，ZHANG Wei，TONG Peng，WANG Chunyan，QI Xuesong，GOU Qiao*
(Key Laboratory of Radiological Protection and Nuclear Emergency, National Institute for Radiological Protection, China CDC, Beijing 100088, China)

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To study the effects of glutathione peroxidase 1(GPX1) overexpression on DNA oxidative damage level and phenotype of malignant BERP35T1 cells exposed upon α-particles. METHODS：The eukaryotic expression vector pEGFP-GPX1 was constructed. After PCR，enzyme digestion analysis and sequencing， pEGFP-GPX1 and control vector were transfected into BERP35T1 cells with lipofectamine 2000 and G418 screening was used to obtain resistant cell lines. The expression of GPX1 was measured by Western blot. MTT，scratching healing test and anchorage independence growth test were used to analyze the effects of GPX1 overexpression on growth rate，migration and colony forming efficiency of BERP35T1 cells. RESULTS：pEGFP-GPX1 was confirmed by PCR，enzyme digestion analysis and sequencing. The sequence of the target gene GPX1 was entirely correct. The protein expression level of GPX1 in pEGFP-GPX1 transfected group BERP35T1-GPX1-6 was 4.01 times higher than in BERP35T1-pEGFP cells(P<0.05). Compared with BERP35T1 and BERP35T1-pEGFP，the level of growth rate，migration and colony forming efficiency in BERP35T1-GPX1-6 decreased significantly(P<0.05). CONCLUSION：GPX1 overexpression may inhibit the proliferation and metastasis of malignant BERP35T1 cells exposed to α-particles through reducing the level of DNA oxidative damage.

【KEY WORDS】glutathione p eroxidase 1 ；α-particle；lung cancer；oxidative stress

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，氡及其短壽命子體的輻射照射是非吸煙者罹患肺癌的主要原因[1]。氡的主要危害是衰變時不斷發射出的高能α粒子(5.49~7.69 MeV)，吸入后這些α粒子會滯留在人體的呼吸道表面，對支氣管和肺細胞產生照射，從而誘發肺癌[1-3]。前期研究表明，在α粒子輻射誘發永生化人支氣管上皮細胞BEP2D惡性轉化中，過氧化物分解酶谷胱甘肽過氧化物酶1(glutathione peroxidase 1，GPX1)蛋白表達量和活性降低，活性氧簇(reactive o xygen s pecies，ROS)、脂質過氧化和DNA氧化損傷水平增高[4-7]。因此，推測在人支氣管上皮細胞輻射致癌模型BERP35T1(以238PuO沉積源α粒子1.5 Gy劑量照射BEP2D細胞，連

2續傳35代后接種裸鼠，從成瘤細胞中克隆出來，具有明確的惡性表型)中使GPX1過量表達，可能通過清除ROS降低DNA 氧化損傷，從而抑制細胞的惡性表型。本研究構建了攜帶人GPX1 cDNA的真核表達載體pEGFP-GPX1，并使其在BERP35T1細胞中過表達，初步探討GPX1過表達對BERP35T1細胞內DNA氧化損傷水平和細胞增殖、遷移以及錨著獨立生長能力等惡性表型的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞系和菌株

BEP2D(經HPV-18永生化的人支氣管上皮細胞)和BERP35T1細胞由軍事醫學科學院二所四室周平坤和胡迎春老師惠贈。用無血清培養液(美國LONZA公司)于37 ℃，CO2體積分數為5%條件下培養。每3 d換1次培養基，每周傳代1次。感受態E. coli DH5α工程菌(北京天根生化科技有限公司)。

1.2 主要試劑和儀器

磷酸鹽緩沖液(PBS，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)；pEGFP-N1載體[綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表達載體，中國質粒載體菌株細胞株基因保藏中心]；卡那霉素(北京天根生化科技公司)；pEGM-T Easy載體連接試劑盒、逆轉錄試劑盒(美國Promega公司)；限制性內切酶BglⅡ和KpnⅠ(日本TaKaRa公司)；氨芐青霉素(北京天根生化科技公司)；質粒小量提取試劑盒(德國Qiagen公司)；脂質體轉染試劑(LipofectamineTM2000)、總RNA提取液Trizol、引物合成測序(美國Invitrogen公司)；遺傳霉素重硫酸鹽(G418，德國Merck公司)；PCR產物回收試劑盒(美國Bio Teke公司)；瓊脂糖(美國Promega公司)；二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(MTT，美國Sigma公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔和山羊抗小鼠抗體(北京中杉金橋公司)；兔抗人GPX1抗體(美國Cell Signaling公司)；小鼠抗人β-actin抗體(美國Abcam公司)；小鼠抗8-羥化脫氧鳥苷(8-oxo-deoxyguanosine，8-OHdG)單克隆抗體(美國Cell Signaling公司)；即用型SABC免疫組化染色試劑盒、DAB顯色液(武漢博士德生物工程公司)；Kodak膠片(美國柯達公司)。

PCR擴增儀(德國Eppendorf公司)；電泳儀(北京六一儀器廠)；全波長酶標儀(美國Thermo公司)；光學顯微鏡、熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；Image J公共圖像處理軟件(美國國立衛生研究院)；Image Pro-Plus 6.0專業圖像軟件(美國Media Cybernetics公司)。

1.3 引物設計

根據GenBank中GPX1 mRNA全序列信息(登錄號NM_000581.2)設計特異性引物，見表1。

表1 用于擴增及構建pEGFP-GPX1載體的引物序列

1.4 GPX1基因的擴增及pEGFP-GPX1載體的構建

從BEP2D細胞提取總RNA，用逆轉錄試劑盒合成cDNA，采用逆轉錄PCR擴增GPX1基因。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min后，94 ℃、30 s，63 ℃、30 s，72 ℃、90 s，共35個循環，最后72 ℃延伸10 min。其產物用pEGM-T Easy載體連接試劑盒連接過夜，轉化高感受態DH5α工程菌。于含有氨芐青霉素的瓊脂培養板中于37 ℃培養12 h后挑取陽性克隆擴增，按質粒小量提取試劑盒提取重組質粒DNA，PCR鑒定并進行測序分析。測序結果與GenBank 內GPX1序列比較無差異。再進行pEGFP-GPX1載體的構建：以克隆有GPX1編碼區全長pEGFP-T Easy質粒為模板，分別用帶有Bgl II、Kpn I酶切位點的引物進行PCR擴增(退火溫度71.6 ℃，其余PCR反應條件同前)。酶切回收目的片段并克隆入pEGFP-N1載體，經PCR、酶切和測序鑒定成功后用于后續試驗研究。

1.5 質粒提取及轉染

1.5.1 質粒提取 用質粒提取試劑盒從含有pEGFPGPX1質粒的菌液中提取高純度質粒。操作嚴格按照試劑盒說明書進行，獲得的質粒-20 ℃ 保存。

1.5.2 穩定轉染及穩定表達GPX1的細胞株的建立 將指數生長期的BERP35T1細胞以5×105個接種至35 mm培養皿中。用LipofectamineTM2000分別將pEGFPGPX1質粒及pEGFP-N1空載體轉染至BERP35T1細胞。6 h后更換含有60 mg/L G418的培養液。16 d后挑選生長狀態良好的細胞克隆，以含有30 mg/L G418的培養液分別進行擴大培養。

1.5.3 熒光顯微鏡檢測綠色熒光蛋白表達 經G418篩選，pEGFP-N1和pEGFP-GPX1組分別獲得1個(命名為BERP35T1-pEGFP)和6個(按獲得順序分別命名為BERP35T1-GPX1-1~6)抗G418的細胞克隆。擴大培養后用PBS洗滌2次，置于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達，并選取綠色熒光蛋白顯著表達的BERP35T1-GPX1細胞株進行后續實驗。

1.6 Western blot檢測GPX1蛋白表達

將BERP35T1、BERP35T1-pEGFP、BERP35T1-GPX1-6細胞擴大培養后，提取總蛋白，取20 μg上樣進行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳及轉膜。一抗采用兔抗人GPX1單克隆抗體(1∶1 000稀釋)常溫孵育2 h，二抗采用HRP標記山羊抗兔抗體(1∶2 000稀釋)常溫孵育1 h。用小鼠抗人β-actin抗體進行雜交作內參照。經化學發光顯影后，使用Image J軟件進行條帶灰度分析。實驗重復兩次。

1.7 免疫細胞化學法檢測GPX1過表達對BERP35T1細胞內8-OHdG水平的影響

制備BERP35T1、BERP35T1-pEGFP、BERP35T1-GPX1-6細胞爬片。4%多聚甲醛固定爬片后，PBS洗2次，置于0.3% Triton X-100中室溫孵育30 min以透膜，按照即用型SABC免疫組化染色試劑盒說明書操作。其中，小鼠抗8-OHdG單克隆抗體(一抗)按1∶200稀釋。經DAB顯色，蘇木素復染，光鏡下觀察、拍照(每組細胞于任意視野拍7張)。細胞呈棕黃色為陽性標記，用Image Pro-Plus 6.0軟件分析每張照片陽性細胞的平均吸光度值。

1.8 MTT檢測GPX1過表達對BERP35T1細胞增殖的影響

將對數生長期的BERP35T1、BERP35T1-pEGFP 以及BERP35T1-GPX1-6細胞接種于96孔板中，每孔1×104個，每種細胞設6個復孔。用含有10%(m/V)的5 g/L MTT的無血清培養基100 μL于37 ℃孵育細胞4 h后，棄培養基。每孔加入150 μL DMSO，室溫下振蕩孵育10 min，用酶標儀測定各孔吸光度D(490)值，按下式計算細胞存活率。

細胞存活率(%)=檢測組D(490)值/對照BERP35T1-pEGFP 組D(490)值×100%

1.9 細胞劃痕愈合實驗檢測GPX1過表達對BERP35T1細胞遷移能力的影響

收集對數期BERP35T1、BERP35T1-pEGFP和BERP35T1-GPX1-6細胞，以每孔5×105個接種于6孔板，每種細胞設3個復孔。融合度達90%時，用200 μL無菌吸頭在孔底劃痕，用PBS洗凈被刮下的細胞。培養48 h后，于普通光學顯微鏡低倍鏡下(×100) 觀察細胞劃痕愈合情況并隨機選取6個不重疊視野拍照，采用美國Image Pro-Plus 6.0軟件測量劃痕兩側細胞間距離(μm)的變化。用遷移距離反映遷移速度，即細胞遷移距離=遷移前劃痕寬度-遷移后劃痕寬度，距離越大，遷移速度越快。

1.10 錨著獨立性生長實驗檢測GPX1過表達對BERP35T1 細胞錨著獨立生長能力的影響

在直徑6 cm的培養皿中鋪制濃度為0.7%的底層瓊脂，將分別含有2×104個BERP35T1、BERP35T1-pEGFP、BERP35T1-GPX1-6細胞的瓊脂(濃度為0.35%)鋪于底層瓊脂上。待上層瓊脂凝固后，表面加無血清培養基，于37 ℃、CO2體積分數為5%條件見下培養，3 d換液一次，連續培養4周。細胞數超過50個計為1個克隆，按下式計算克隆形成率。

克隆形成率=克隆數/接種細胞數×1 0 00‰

1.11 統計學處理

實驗數據均為計量資料，以x-±s表示。用SPSS 17.0軟件進行分析。多組間均數的比較采用單因素方差分析，均數間兩兩比較采用Bonferroni法。檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 重組質粒的PCR、酶切和測序鑒定

使用設計的GPX1基因編碼區引物，以重組質粒pEGFP-GPX1為模板，擴增出長約620 bp的片段，見圖1A。將重組質粒pEGFP-GPX1用限制性內切酶Bgl II和Kpn I雙酶切，瓊脂糖電泳結果顯示出兩條大小不等的帶，一條大于2 000 bp為載體片段，一條約620 bp為連入的GPX1片段，見圖1B。使用設計的GPX1基因編碼區引物以重組質粒pEGFP-GPX1為模板進行雙向PCR，序列分析結果顯示，擴增出的片段已與pEGFP-N1連接，該片段確定為GPX1基因編碼區。

A：PCR鑒定電泳圖，泳道1~4為以pEGFP-GPX1質粒為模板PCR擴增出的GPX1片段；B：雙酶切鑒定電泳圖，泳道1~4為BglⅡ和KpnⅠ雙酶切pEGFP-GPX1質粒產物；泳道M：DL2000 DNA分子量標準.圖1 重組質粒pEGFP-GPX1的PCR鑒定和雙酶切鑒定電泳圖

2.2 GFP融合的GPX1在細胞中的表達

BERP35T1細胞經轉染后，由G418篩選，空白對照BERP35T1細胞內因無G418抗性載體而全部死亡，而pEGFP-N1和pEGFP-GPX1組分別獲得1個和6個抗G418的克隆。擴大培養后熒光顯微鏡下觀察，BERP35T1-pEGFP細胞內見明顯綠色熒光；6株BERP35T1-pEGFP細胞內僅BERP35T1-GPX1-6細胞內可見明顯綠色熒光，說明GPX1基因在這株細胞內表達，見圖2。故后續實驗均選用BERP35T1-GPX1-6細胞為研究對象。

A：BERP35T1；B：BERP35T1-pEGFP；C：BERP35T1-GPX1-6.圖2 GPF在細胞內的表達情況(×200)

2.3 細胞中GPX1蛋白的表達

Western b lot檢測結果表明，BERP35T1、BERP35T1-pEGFP和BERP35T1-GPX1-6細胞內GPX1蛋白相對表達水平分別為(0.97±0.11)、(1.00±0.00)和(4.01± 0.99)。BERP35T1和BERP35T1-pEGFP細胞比較差異無統計學意義(P>0.05)；BERP35T1-GPX1-6細胞內GPX1 蛋白表達水平是BERP35T1-pEGFP細胞的4.01倍(P< 0.01)，見圖3。說明GPX1蛋白在BERP35T1-GPX1-6細胞內過表達。

1：BERP35T1；2：BERP35T1-pEGFP；3：BERP35T1-GPX1-6.圖3 細胞內GPX1蛋白表達情況

2.4 GPX1過表達對BERP35T1細胞內8-OHdG水平的影響

對細胞中的DNA氧化損傷產物8-OHdG進行免疫細胞化學染色后(見圖4)，用圖像分析軟件對細胞染色強度進行定量分析顯示：BERP35T1-pEGFP與BERP35T1細胞內8-OHdG的水平無明顯差異(分別為1.60×10-2和1.65×10-2，P>0.05)，與BERP35T1-pEGFP和BERP35T1細胞相比，BERP35T1-GPX1-6細胞內8-OHdG水平(9.75×1 0-3)顯著降低，差異具有統計學意義(P均<0.01)。

2.5 GPX1過表達對BERP35T1細胞增殖的影響

MTT法檢測結果顯示：BERP35T1-pEGFP與BERP35T1細胞的存活率差異無統計學意義(分別為96.84%±3.16%和93.61%±5.38%，P>0.05)。與BERP35T1細胞和BERP35T1-pEGFP細胞相比，BERP35T1-GPX1-6 細胞的存活率(80.86%±3.14%)顯著降低，差異具有統計學意義(P< 0.01)。

A：BERP35T1；B：BERP35T1-pEGFP；C：BERP35T1-GPX1-6.圖4 BERP35T1、BERP35T1-pEGFP和BERP35T1-GPX1-6細胞內8-OHdG的表達(×200)

2.6 GPX1過表達對BERP35T1細胞遷移能力的影響

劃痕愈合試驗結果顯示：劃痕后48 h，BERP35T1-pEGFP細胞遷移距離(115.02±30.73) μm與 BERP35T1細胞(150.68±9.98) μm 比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與BERP35T1和BERP35T1-pEGFP細胞相比，BERP35T1-GPX1-6細胞的遷移距離(78.58± 9.57) μ m明顯減小(P<0.01)，見圖5。

圖5 細胞遷移能力(×100)

2.7 GPX1過表達對BERP35T1細胞錨著獨立生長能力的影響

細胞在瓊脂中的集落形成率是細胞惡性程度高低的重要標志。錨著獨立生長試驗結果顯示：BERP35T1 和BERP35T1-pEGFP形成的50個細胞以上的克隆較多，BERP35T1-GPX1-6形成50個細胞以上的克隆很少，多為4~5個細胞形成的細胞團。BERP35T1與BERP35T1-pEGFP細胞相比，克隆形成率差異無統計學意義(分別為2.50‰ ±0.02‰和2.10‰±0.02‰，P> 0.05)；與BERP35T1和BERP35T1-pEGFP細胞相比，BERP35T1-GPX1-6細胞的克隆形成率(0.50‰±0.03‰)顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖6。

3 討 論

GPX1是機體內廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，可使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，從而保護細胞和遺傳物質，使其免受過氧化物的干擾及損害。在GPX1基因敲除的小鼠體內，ROS及DNA氧化損傷水平均顯著增加[8]。GPX1表達水平降低與腫瘤的發生、發展關系密切。與正常結腸組織比較，GPX1在結腸癌組織中的表達量降低2倍[9]。本實驗室前期研究也發現，與BEP2D細胞相比，人支氣管上皮細胞輻射致癌模型BERP35T1細胞內抗氧化蛋白GPX1表達下調[6]。α粒子電離輻射可導致細胞內ROS水平急劇升高，使細胞處于高氧化應激狀態。如果細胞內抗氧化系統的代償功能無法適應這種應激狀態，細胞內則會積聚大量的ROS，引起脂質和DNA等大分子的氧化損傷，誘發細胞惡性轉化。因此，抗氧化酶GPX1 表達下調，引起細胞抗氧化功能減弱可能是α粒子誘發BEP2D細胞惡性轉化的重要機制之一[5-7，10]。反之，提高細胞內GPX1蛋白的表達量則可能抑制α粒子誘發的BEP2D細胞惡性轉化、逆轉或部分逆轉已經惡性轉化的BEP2D細胞的惡性表型。本研究首先成功構建了攜帶人GPX1 cDNA的真核表達載體pEGFPGPX1，并使其在BERP35T1細胞中過表達。進一步研究發現，與BERP35T1細胞和BERP35T1-pEGFP細胞相比，過量表達GPX1蛋白的BERP35T1-GPX1-6細胞的增殖活力、遷移能力以及錨著獨立生長能力均顯著減低(P<0.05)。這表明GPX1過量表達可以抑制BERP35T1細胞的惡性表型，遏制α粒子電離輻射所致肺癌細胞的生長和轉移。

A：BERP35T1；B：BERP35T1-pEGFP；C：BERP35T1-GPX1-6.圖6 接種4周后軟瓊脂中形成的細胞克隆(×100)

DNA氧化損傷在腫瘤的發生、發展過程中起著重要作用。DNA雙螺旋外側的鳥嘌呤極易被ROS氧化為8-OHdG，DNA鏈上的8-OHdG可以與胞嘧啶以外的其他堿基配對形成點突變[11]。因此，8-OHdG既是一種敏感的DNA氧化損傷標志物，也是一種潛在的致癌標志物。ROS誘導的持續性DNA氧化損傷能逐漸形成具有新特征的細胞亞群。最后，細胞凋亡減少，基因組不穩定性及異型性增加，進展為突變細胞，導致腫瘤發生[12]。本實驗室前期研究發現，在α粒子輻射誘發BEP2D細胞惡性轉化過程中，細胞內ROS和8-OHdG水平增高[6-7]。周平坤等[13]發現，與BEP2D細胞相比，BERP35T1細胞中染色體極不穩定，表現為染色體斷裂水平增高，13號染色體和Y染色體丟失、2號染色體和12號染色體的長臂增加等。這些研究結果提示，α粒子輻射誘發BEP2D細胞惡性轉化過程中，GPX1表達下調引起細胞內ROS積聚，誘發DNA氧化損傷，由此引起基因突變和基因組不穩定性等，從而促進細胞惡性轉化。本研究使GPX1蛋白在α粒子輻射致肺癌細胞模型BERP35T1中過表達后，采用免疫細胞化學方法對細胞內8-OHdG水平進行檢測，發現與BERP35T1和BERP35T1-pEGFP細胞相比，BERP35T1-GPX1-6細胞內8-OHdG水平降低了40%(P<0.01)。這表明細胞內過量表達的抗氧化酶GPX1可能通過抑制ROS對DNA的氧化損傷，促進基因組穩定性，抑制BERP35T1細胞的惡性表型。

綜上所述，在α粒子輻射致肺癌細胞模型BERP35T1細胞中過量表達GPX1，可通過將細胞內有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，緩解細胞內DNA氧化損傷，促進基因組穩定性，抑制癌細胞的惡性表型，發揮腫瘤抑制作用。但為了證實該結論，還需開展動物水平及相關信號通路等多方面的實驗研究。

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基金項目：國家自然科學基金資助項目(81000862)

收稿日期：2015-05-04；

修訂日期：2015-10-28

中圖分類號：R994.6

文獻標志碼：A

文章編號：1004-616X(2016)01-0008-07

doi:1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.01.002