miR-143、MMP-2 和TIMP-1在哈薩克族食管癌組織中的表達及其臨床病理意義

李秀梅郭 瓊王 崠陳 艷李 卉諶宏鳴*李惠武（. 新 疆醫科大學基礎醫學院新疆 烏魯木齊 8300；. 新疆武警總隊醫院新疆 烏魯木齊 8300）

?

miR-143、MMP-2 和TIMP-1在哈薩克族食管癌組織中的表達及其臨床病理意義

李秀梅1，郭 瓊1，王 崠2，陳 艷1，李 卉1，諶宏鳴1，*，李惠武1
（1. 新 疆醫科大學基礎醫學院，新疆 烏魯木齊 830011；2. 新疆武警總隊醫院，新疆 烏魯木齊 830011）

【摘要】目的： 探討在新疆哈薩克族食管癌組織中miR-143、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2) 和基質金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)的表達及其臨床意義。方法：根據前期芯片檢測結果，通過靶點預測軟件PicTar， TargetScan和miRanda預測miR-143可能與腫瘤相關的靶基因。并采用實時熒光定量PCR方法檢測30例哈薩克族食管癌組織及相應癌旁組織中miR-143、MMP-2和TIMP-1的表達水平，分析其與臨床病理特征的關系。結果：miR-143在哈薩克族食管癌組織中表達較遠端癌旁組織中明顯降低，差異有統計學意義(P=0.000)； miR-143低表達與分化程度、淋巴結轉移、臨床分期相關(P依次為0.042、0.039、0.007)；MMP-2、TIMP-1在哈薩克族食管癌組織中表達均較遠端癌旁組織中增高，差異均有統計學意義(P=0.026和P=0.021)；MMP-2高表達與淋巴結轉移正相關(r=0.367， P=0.037)；miR-143與MMP-2、TIMP-1的表達均呈負相關(r依次為-0.442、-0.410，P均<0.05)，MMP-2與TIMP-1的表達呈正相關(r=0.794，P=0.000)。結論：miR-143與MMP-2、TIMP-1表達失調共同參與哈薩克族食管癌的發生發展過程，MMP-2和TIMP-1可能是miR-143的靶基因。

【關鍵詞】食管癌；miR-143；基質金屬蛋白酶-2；基質金屬蛋白酶抑制劑-1

作者信息： 李秀梅，Tel：13899818077，E-mail：dr.lxm@163.com。*通信作者，諶宏鳴，E-mail：chenhongming5709@163.com

Expression and significance of miR-143, MMP-2 and TIMP-1 in esophageal
cancer in Kazaks

LI Xiumei1，GUO Qiong1，WANG Dong2，CHEN Yan1，LI Hui1，CHEN Hongming1，*，LI Huiwu1
(1. School of Basic Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011; 2. Xinjiang Armed Police Hospital, Urumqi 830011, Xinjiang, China)

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To study expressions of miR-143，matrix metalloproteinase-2(MMP-2) and tissue inhibitor of metalloproteinase-1(TIMP-1) in esophageal cancer tissue and normal tissue among Kazaks and to investigate the relationship between their expressions and clinical pathological features. METHODS： Using real time-PCR to detect the expression of miR-143，MMP-2 and TIMP-1 in 30 esophageal cancer specimens. RESULTS：The expression levels of miR-143 in cancer tissue were lower than those of normal tissues(P=0.000)．The lower expression of miR-143 was significantly related to the cellular differentiation， lymph node metastasis and clinical stage (P=0.042，0.039，0.007)．The expression levels of MMP-2，TIMP-1 in cancer tissue were higher than those of normal tissues(P=0.026，0.021)．Enhanced expression of MMP-2 was significantly related to lymph node metastasis(r=0.367，P=0.037)．The expression of miR-143 in the Kazak’s esophageal cancer was negatively related to the expressions of MMP-2 and TIMP-1 (r=-0.442，-0.410； P=0.001，0.003)．The expression of MMP-2 positively related to that of TIMP-1(r=0.794，P= 0.000)． CONCLUSION：The under-expression of miR-143 and over-expressions of MMP-2 and TIMP-1 may have important roles in carcinogenesis of esophageal cancer in Kazaks.

【KEY WORDS】esophageal cancer；miR-143；matrix m etalloproteinase-2；tissue i nhibitor o f m etalloproteinase-1

食管癌(esophageal cancer，EC)是世界上6大常見惡性腫瘤之一，食管癌患病率因地區變化而顯著不同，在新疆哈薩克族食管癌發病率最高(155.9/10萬)[1]。microRNA是一類具有組織特異性或發育階段特異性、非編碼調控的小RNA，近幾年的研究發現在腫瘤組織及外周血中microRNA的表達與腫瘤的發生和發展密切相關[2]。我們前期實驗采用芯片篩查出35個在哈薩克族食管癌組織中差異顯著的microRNA，提示哈薩克族食管癌組織microRNA表達譜發生了明顯改變，其中miR-143表達下調2倍。本文根據芯片的數據結果首先采用熒光定量PCR技術檢測30例新疆哈薩克族食管癌組織及其遠端癌旁組織中miR-143的表達情況，驗證芯片結果的準確性，然后通過軟件預測基質金屬蛋白酶-2 (matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和基質金屬蛋白酶抑制劑-1 ( tissue i nhibitor o f m etalloproteinase-1，TIMP-1)可能是miR-143的靶基因，結合前期試驗結果MMP-2、TIMP-1與哈薩克族食管癌侵襲轉移密切相關[3]。因此，本文中我們分析了miR-143與MMP-2、TIMP-1表達的相關性，旨在探討三者在哈薩克族食管癌發生發展中的作用及其臨床病理意義。

1 材料與方法

1.1 靶基因的預測

根據芯片檢測結果，通過靶點預測軟件PicTar，TargetScan和miRanda(委托北京博奧晶典生物技術有限公司檢測)預測miR-143可能與腫瘤相關的靶基因。

1.2 臨床資料

30例新疆哈薩克族食管癌組織及遠端癌旁對照正常組織(距離癌組織5 cm以上)均取自2008—2013年新疆醫科大學附屬腫瘤醫院手術切除標本，患者術前均未接受放化療，手術中取材后迅速將標本置于液氮中，置于-80 ℃ 冰箱保存。癌組織病理切片均診斷為鱗狀上皮細胞癌。男15例，女15例；年齡36~65歲，中位年齡54歲；腫瘤臨床分期按國際TNM分期(UICC，2 009年)，其中I期3例、Ⅱ期11例、Ⅲ期16例；有淋巴結轉移14例，無淋巴結轉移16例；低分化16例，高分化14例。

1.3 引物與主要試劑

miScript II RT Kit、miScript SYBR Green PCR Kit、引物，均購自Qiagen公司；RNA提取試劑Trizol購自Promega公司。引物序列如下：miR-143，上游5'-AT GCCCTTTCATCATTGC-3'，下游5'-GAGCTACAGTGCT TC-3'；U6，上游5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；MMP-2，上游5'-AGATCTTCTTCTTCAAGGACC-3'，下游5'-GGCTGG TCAGTGGCTTGGGG-3'；TIMP-1，上游5'-GATCCAG CGCCCAGAGAGACA-3'，下游5'-AGCTTCCACTCCGG GCAGGAT-3'。

1.4 組織總RNA提取、逆轉錄及實時熒光定量PCR

采用Trizol試劑一步法提取總RNA，紫外分光光度計測定其純度。以提取的總RNA為模板，按miScript II RT Kit說明書進行逆轉錄。以得到的cDNA為模板進行實時熒光定量PCR擴增。PCR擴增反應體積為25 μL，反應條件：94 ℃、2 min；94 ℃、20 s，61 ℃、30 s，72 ℃、30 s，40個循環；72 ℃、5 min。

1.5 統計學分析

應用SPSS 16.0軟件包，數據采用2-ΔΔCT法

進行分析，基因在哈薩克族食管癌組織和遠端癌旁組織中表達量的比較采用t檢驗，各基因與哈薩克族食管癌臨床病理因素的關系采用Spearman雙變量相關性分析，以α=0.05為檢驗水準。

2 結 果

2.1 miR-143靶基因預測結果

見表1。為了減少假陽性率，挑選至少出現在2個軟件中的基因作為其可能的靶基因。最終我們選擇了MMP-2和TIMP-1基因。

表1 miR-143腫瘤相關靶基因的預測

2.2 腫瘤組織中miR-143、MMP-2和TIMP-1 的表達

熒光定量PCR檢測結果顯示，30例哈薩克族食管癌組織及癌旁組織中，miR-143在腫瘤組織中的表達下調，與癌旁組織相比，其相對表達水平(0.23± 0.08)下調了近3倍，差異有統計學意義(P<0.05)。在腫瘤組織中MMP-2和TIMP-1的相對表達量(1.83±0.17、2.21±0.22)均明顯高于癌旁組織，差異具有統計學意義(P均<0.05)。見圖1。

圖1 腫瘤組織中miR-143、MMP-2、TIMP-1的表達

2.3 哈薩克族食管癌組織中miR-143、MMP-2、TIMP-1表達與病理因素的關系

結果顯示：miR-143的表達在低分化組顯著低于中、高分化組，淋巴結轉移組顯著低于無淋巴轉移組(P均<0.05)，臨床分期Ⅱb～Ⅲ期組miR-143表達顯著下調，差異均有統計學意義(P均<0.05)。且miR-143低表達與分化程度(r=-0.586，P=0.008)、淋巴結轉移(r= -0.378，P=0.013)和臨床分期均呈負相關(r=-0.524，P=0.003)。有淋巴結轉移的腫瘤組織中MMP-2的表達顯著高于淋巴結未轉移的腫瘤組織，MMP-2的高表達與淋巴結轉移呈正相關(r= 0.367，P=0.002)。TIMP-1的表達與分化程度、臨床分期及淋巴結轉移均無明顯相關關系。見表2。

2.4 基因相關性分析

Spearman相關分析顯示在哈薩克族食管癌組織中miR-143與MMP-2表達量負相關(r=-0.442， P= 0.001)，miR-143與TIMP-1表達量負相關(r=-0.410，P=0.003)，TIMP-1與MMP-2表達量呈正相關(r=0.794，P=0.000)。見表3。

表2 食管癌組織中miR-143、MMP-2和TIMP-1的表達與病理資料的關系

表3 miR-143與MMP-2和TIMP-1相關性的分析(CT值)

3 討 論

食管癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，在我國食管癌的發病率具有明顯的地域性，在新疆哈薩克族食管癌發病率最高，目前早發現、早治療是提高食管癌患者5年生存率的有效方法，因此，尋找食管癌早期診斷和預后標志物有重要意義。近年來microRNA的研究是分子腫瘤學研究的熱點之一，生物信息學數據表明，microRNA在細胞生長和發育過程中發揮重要作用，microRNA參與體內許多重要腫瘤相關基因的表達，調控著細胞分化、凋亡及增殖，microRNA表達失調與腫瘤發生密切相關[4-5]。我們前期microRNA芯片結果顯示在哈薩克族食管癌發生發展過程中miR-143表達發生了改變，因此我們隨機選用30 例哈薩克族食管癌組織及癌旁組織，采用熒光定量PCR檢測miR-143的表達以驗證microRNA芯片的準確性，并分析其臨床病理意義。

miR-143是人類細胞中存在較為廣泛的一種microRNA，目前報道在直腸癌、膀胱癌、宮頸癌[6-8]等人類眾多惡性腫瘤標本及腫瘤細胞系中miR-143低表達，其低表達可以促進腫瘤的發生。王勇等[9]研究發現在肝外膽管癌中miR-143呈低表達，miR-143質粒轉染膽管癌細胞株QBC939后發現膽管癌細胞阻滯于G1期、細胞凋亡增加、細胞生長受到抑制，提示miR-143可能與膽管癌發生相關。本研究結果與此基本相符，在哈薩克族食管癌組織中miR-143表達明顯下調，與遠端癌旁組織相比，其表達水平僅為癌旁組織水平的1/3，且其表達與分化程度、臨床分期、淋巴轉移相關，在低分化、有淋巴結轉移的腫瘤組織中miR-143表達顯著低于高分化、無淋巴轉移的癌組織，隨著臨床病程的進展，miR-143表達呈現下調趨勢，以上實驗結果提示miR-143表達下調參與了哈薩克族食管癌的分化及侵襲轉移的生物學進程。

MicroRNA通過對靶基因的表達調控而發揮作用，因此我們對顯著下調的miR-143進行靶點預測，以求進一步認識其與哈薩克族食管癌發生的關系。結果表明，miR-143的靶基因包括凋亡相關基因BCL-2、腫瘤轉移相關基因TIMP-1、MMP-2等。MMPs是一類結構具有同源性、活性依賴鋅離子的蛋白水解酶，由纖維母細胞、中性粒細胞、巨噬細胞及腫瘤細胞分泌，在腫瘤的發生發展過程中MMPs降解細胞外基質成分，調控腫瘤新生血管形成，影響細胞黏附分子的功能以及腫瘤細胞的生長[10-11]。基質金屬蛋白酶抑制因子(TIMPs)是一類多基因家族的編碼蛋白，是MMPs的天然抑制劑，目前已知的TIMPs主要有4種，分別為TIMP-1~TIMP-4[12-13]。在30例哈薩克族食管癌標本中我們檢測了MMP-2和TIMP-1的表達，結果顯示在腫瘤組織中MMP-2和TIMP-1的表達均顯著高于正常組織，而TIMP-1高表達與MMP-2表達正相關，差異有統計學意義(P<0.05)，提示MMP-2和TIMP-1表達上調共同參與了哈薩克族食管癌的發生發展過程。 在30例癌組織中，MMP-2 的表達與淋巴結轉移顯著相關(P< 0.05)，在有淋巴結轉移的腫瘤組織中MMP-2 的表達顯著高于淋巴結未轉移的腫瘤組織，提示MMP-2可能是哈薩克族食管癌發生侵襲、轉移的主導因素。MMP-2 過度表達有利于細胞外基質的分解，使腫瘤向深層浸潤并突破血管和淋巴管，促進血管生成，造成血行和淋巴轉移。在本試驗中TIMP-1在哈薩克族食管癌組織中表達上調，但TIMP-1表達與腫瘤分化、轉移及臨床分期均無明顯相關性，而TIMP-1高表達與MMP-2表達高度相關，推測在哈薩克族食管癌發病過程中，隨著MMPs表達失調，TIMP-I表達上調可能發揮保護作用即抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移。相關性分析顯示，在30例哈薩克族食管癌組織中miR-143與MMP-2、TIMP-I的表達負相關，提示miR-143表達下調與MMP-2和TIMP-1表達上調具有關聯，MMP-2和TIMP-1作為miR-143預測靶基因，其具體的調控機制有待于我們在今后的試驗中進一步探討。

綜上所述，在哈薩克族食管癌組織中miR-143表達下調，與前期芯片實驗結果相符。且miR-143低表達與MMP-2和TIMP-1高表達負相關，提示miR-143與MMP-2和TIMP-1表達失調共同發揮作用，參與食管癌發生發展過程。系統篩查micoRNA表達譜、鑒定micoRNA靶基因對探索micoRNA在腫瘤發生發展中所發揮的重要作用，揭示micoRNA在基因表達調控網絡中的功能具有重要意義。

參考文獻

[1] 張月明. 新疆食管癌的分布[J]. 新疆醫學院學報，1988，11(2)：139-144．

[2] Varnholt H. The role of microRNAs in primary liver cancer[J]. Ann Hepatol，2008，7(2)：104-113.

[3] 李秀梅，陳 艷，王洪江，等. 哈薩克族食管癌中MMP-1、MMP-2、MMP-7、TIMP-1和MTA1的表達及其臨床病理意義[J]. 癌 變·畸變·突變，2011，23(3)：190-198.

[4] Nehad MA，Michelle L，Emma I，et al. miR-218 suppresses nasopharyngeal cancer progression through down regulation of survivin and the SLIT2-ROBO1 pathway[J]. Cancer Res，2011，71(6)：381-2391.

[5] Ozen M，Creighton CJ，Ozdemir M. Wide spread deregulation of microRNA expression in human prostate cancer[J]．Oncogene，2008，27(12)：1788-1793.

[6] Chen X，Guo X，Zhang H. Role of miR-143 targeting KRAS in colorectal tumorigenesis[J]. Oncogene，2009，28(10)：1385-1392.

[7] 李鵬超，陶 俊，呂 強，等. MiR-143在膀胱移行細胞癌中的表達和功能[J]. 南京醫科大學學報：自然科學版，2010，30(9)：1235-1239.

[8] Takagi T，Iio A，Nakagawa Y. Decreased expression of microRNA-143 and-145 in human gastric cancers[J]. Oncology，2009，77(1)：12-21.

[9] 王 勇，孫躍明. microRNA143、microRNA145對膽管癌細胞株 QBC939生長周期及凋亡的影響[J]. 南京醫科大學學報，2010，30(5)：612-616.

[10] REN Ye，GUO Fengjing，CHEN Anmin，et al. Involvement of MMP-2 in adriamycin resistance dependent on ERK1/2 signal pathway in human osteosarcoma MG-63 cells[J]. J Huazhong U Sci-Med，2012，32(1)：82-86.

[11] 朱慧芳，左學軍，雷 鳴，等. MMP-2、TIMP-2和CD44V6基因蛋白在卵巢漿液性腫瘤中的表達及臨床意義[J]. 中國婦幼保健醫院，2011，2(22)：3470-3472.

[12] Jung YS，Liu XW，Chirco R，et al. TIMP-1 induces an EMT-like phenotypic conversion in MDCK cells independent of its MMP-inhibitory domain[J]. PLoS One，2012，7(6)：38773-38779.

[13] Wang Yunyan，Meng Junsong，Zhuang Haijun，et al. Expressions and clinical significances of MMP-2 and TIMP-2 mRNA in bladder transitional cell carcinomas[J]. Chin Germ J Clin Oncol，2011，10(5)：278-281.

基金項目：新疆維吾爾自治區科技廳地方病分子生物學實驗室開放課題(XJDX0208-2012-02)

收稿日期：2014-11-29；

修訂日期：2015-10-23

中圖分類號：R734.2

文獻標志碼：A

文章編號：1004-616X(2016)01-0032-05

doi:1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.01.007