基于中醫方證代謝組學技術的六味地黃丸干預腦癱大鼠模型研究＊

李秋菊，王 萍，王美佳，康舒宇，張 也，張愛華，王喜軍

（黑龍江中醫藥大學國家中醫藥管理局中醫方證代謝組學研究中心/國家中醫藥管理局中藥血清藥物化學重點研究室/中美中醫方證代謝組學技術合作中心 哈爾濱 150040）

基于中醫方證代謝組學技術的六味地黃丸干預腦癱大鼠模型研究＊

李秋菊，王 萍，王美佳，康舒宇，張 也，張愛華，王喜軍＊＊

（黑龍江中醫藥大學國家中醫藥管理局中醫方證代謝組學研究中心/國家中醫藥管理局中藥血清藥物化學重點研究室/中美中醫方證代謝組學技術合作中心 哈爾濱 150040）

目的：本研究基于中醫方證代謝組學理論和技術平臺，研究六味地黃丸（LW）對腦癱大鼠模型的干預作用。方法：研究采用延遲剖宮產手術方法復制缺氧缺血腦癱（HICP）大鼠模型，利用經典行為學方法對HICP模型和LW的干預作用進行評價；最后借助中醫方證代謝組學技術揭示了HICP模型大鼠尿液的潛在生物標記物與LW干預HICP模型體內顯效成分的相關性。結果：研究表明LW通過調節HICP模型大鼠機體的糖類代謝、氨基酸代謝、核苷酸代謝和甾體激素類生物合成四大類代謝途徑，進而有效改善HICP模型大鼠的運動能力，并確定LW的入血成分中6-O-甲基梓醇、莫諾苷、丹皮酚原苷、毛蕊花苷、獐牙菜苷脫水的代謝產物為干預HICP大鼠模型的潛在藥效物質基礎。本證實了中醫方證代謝組學技術可以成為闡明中藥藥效物質基礎的有力手段。

中醫方證代謝組學 缺氧缺血腦癱 六味地黃丸 藥效物質基礎 代謝物 中醫藥 中藥血清藥物化學 代謝組學

2012年，本團隊將中藥血清藥物化學與代謝組學有機整合，提出并建立中醫方證代謝組學（Chinmedomics）研究策略[1]，為全面揭示中藥藥效物質基礎提供了新的思路與方法[2,3]。滋陰補腎的經典名方六味地黃丸（Liu Wei Di Huang Wan，LW），于《小兒藥證直訣》中首創，最初是用于治療小兒的“五遲、五軟”證[4]。小兒因先天腎精虧虛導致的發育遲緩癥被稱為“五遲、五軟”證,表現為立遲、行遲、語遲、齒遲、發遲以及手軟、足軟、肌肉軟、口軟、頭項軟[5]。現代醫學研究表明，小兒腦癱歸屬于“五遲、五軟”證的范疇[6]。然而目前LW對“五遲、五軟”證起到干預作用的化學成分以及這些成分對機體代謝網絡的調節作用仍尚不清楚，所以本研究以LW治療小兒“五遲、五軟”證的經典療效為切入點，在缺氧缺血腦癱（Hypoxic-Ischemic Cerebral Palsy，HICP）大鼠模型的基礎上，進行LW的中醫方證代謝組研究。

1 材料

1.1 儀器

電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；美國Waters AcquityTMUPLC液相色譜儀（四元梯度泵-在線真空脫氣機-自動進樣器-二極管陣列檢測器-柱溫箱）；美國Waters SynaptTMHDMS 質譜分析系統；MassLynx V4.1工作站；氮吹儀（美國Organomation公司）。

1.2 藥品與試劑

熟地黃、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉、牡丹皮，六味中藥材購于北京同仁堂哈爾濱藥店。

乙腈（色譜級，德國Merck公司）；甲醇（色譜級，美國Fisher公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；甲酸（色譜級，天津科密歐化學試劑有限公司）；亮氨酸腦啡肽（美國Sigma公司）；乙醚（天津市富宇精細化工有限公司）。

1.3 藥液的制備

1.3.1 六味地黃丸給藥樣品的制備

依據2015版《中國藥典》，同時為了全面地檢出中藥血清移行成分，引導后續實驗開展，并按照大鼠劑量和人體劑量的折算關系，將成人口服LW的一日劑量折合成本實驗中大鼠的LW低劑量，將成人口服LW一日劑量的5倍折合成本實驗中大鼠的LW中劑量，將成人口服LW一日劑量的10倍折合成本實驗中大鼠的LW高劑量。根據上述依據，按比例取六味中藥材并充分混合，10倍量甲醇中浸泡30 min后，超聲提取40 min，重復3次，合并濾液，減壓濃縮，得到LW提取液濃膏。向濃膏中加入事先配制好的0.5%的CMC-Na溶液充分混懸，制備成含生藥量0.81 g·mL-1混懸液，即為LW高劑量，并逐級稀釋成0.405 g·mL-1，即為LW中劑量，以及0.081 g·mL-1，LW低劑量，配置好的藥液4℃保存備用。

1.3.2 六味地黃丸供試品溶液的制備

按比例稱取6味中藥材，共計12.5 g，加入10倍量甲醇125 mL，超聲30 min，于4℃、13 000 rpm離心10 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液備用，供進樣分析。

1.4 實驗動物

本實驗已明確預產期的妊娠SD雌性大鼠25只，體質量250±20 g，購置于黑龍江中醫藥大學動物安全性評價中心，許可證號P00102004。

2 方法

2.1 模型復制

本實驗采用瑞典學者Bjelke[7]在1991年首次提出的延遲剖宮產手術法，結合李星兒等[8]對該模型的改良方法，復制本研究的先天性HICP模型大鼠。取12只臨產的大鼠打開腹腔后用4個止血鉗分別夾閉雙側子宮角血管，夾閉10 min時，立即從子宮取出新生大鼠，用棉簽對新生大鼠進行術后搶救，最終成活100只；另取3只臨產的大鼠僅進行剖宮產手術，不用止血鉗夾閉子宮角血管進行延遲，最終得到27只成活的新生大鼠；剩余10只臨產大鼠需至少提前1天自然分娩。

2.2 動物分組與給藥

共分為5組，即僅行剖宮產手術得到的仔鼠隨機選取20只作為假手術對照組（Control，C）；行延遲剖宮產手術得到的新生大鼠隨機選取80只并平均分成4組即模型組（Modle，M），LW低劑量給藥組（LWL）、LW中劑量給藥組（LWM）、LW高劑量給藥組（LWH），（保證雌雄比例1：1）。各給藥組大鼠每天給予相應劑量LW提取液灌胃，對照組與模型組給予蒸餾水灌胃。由于前期預實驗結果發現采用延遲剖宮產手術復制的HICP模型大鼠在49日齡內處于研究設計需要的病理狀態，所以最終的給藥時間為從大鼠21日齡離乳到大鼠49日齡，共計28天，給藥量為10 mL·kg-1。

2.3 術后飼養

研究選取自然分娩的10只母鼠作為代乳鼠，先將其取出置于另一鼠籠中，并將其所產仔鼠全部丟棄，然后將上述五組新生大鼠標記好組別每窩10只分別埋入每只代乳鼠籠里的墊料中，充分接觸，待20 min后將代乳鼠放回原籠中即可。

2.4 生物樣品的收集與制備

從新生大鼠21日齡開始，尿液樣本每隔七天收集一次，采集后于4℃，13 000 rpm，離心10 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液供UPLCHDMS分析；血液樣本于最后一次給藥后1 h內進行采集，并于4℃，3 500 rpm離心10 min分離血清，并采用甲醇沉淀法即用6倍量甲醇進行蛋白沉淀。

2.5 行為學方法檢測

依照李曉捷等[9]給出的腦癱動物的神經行為學標準，并結合本實驗中的HICP模型大鼠的自身情況分別選取懸吊實驗、斜坡實驗、曠場實驗和拒俘反應實驗對各組大鼠成長階段的行為能力進行考察。

2.6 尿液代謝組學測試方法

色譜柱：Waters ACQUITY UPLCTMHSS T3（2.1 mm ×100 mm，1.8 μm）；流動相：A為0.1%甲酸乙腈，B為0.1%甲酸水；梯度洗脫程序為0-2.5 min，1%-11%A，2.5-4.5 min，11%-25% A，4.5-8 min，25%-60%A，8-8.5 min，60%-99%A。質譜條件：正離子模式下毛細管電壓2.6 kV，樣品錐孔電壓30 V，提取錐孔電壓3.0 V，脫溶劑氣溫度300℃，脫溶劑氣流量600 L·h-1；負離子模式下毛細管電壓2.0 kV，樣品錐孔電壓35 V，提取錐孔電壓3.5 V，脫溶劑氣溫度200℃，脫溶劑氣流量600 L·h-1。

2.7 六味地黃丸體內外成分檢測方法

為避免分析結果的無效重疊，本次正負離子模式以及體內外樣品均采用一套分析條件，即色譜柱：Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相：A為0.1%甲酸乙腈，B為0.1%甲酸水；梯度洗脫程序為0-2 min，10%-35%A，2-3 min，35%-60%A，3-6 min，60%-80%A，6-8.5 min，80%-99%A。質譜條件：毛細管電壓：2.8 kV；錐孔采樣電壓：35 V；錐孔提取電壓：3.2 V；去溶劑氣溫度：300℃；去溶劑氣流量：600 L·h-1；離子源溫度：110℃。質譜數據在Continuum全掃描方式下應用MS E模式進行采集。

2.8 數據處理

2.8.1 統計學分析

測得數據采用SPSS 18.0軟件進行兩因素方差（two-way ANOVA）分析，多組間比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05認為差異具有統計學意義。

圖1 各組大鼠行為學分析

2.8.2 生物標記物分析

將所得尿液代謝組學數據導入Waters Progenesis QI軟件，結合Ezinfo 2.0軟件對大鼠尿液代謝輪廓進行分析，再應用QI軟件中Identify Compounds鑒定成分模塊，對HICP模型大鼠尿液潛在生物標記物在Human Metabolome Database＊（HMDB）數據庫進行相關檢索，最終利用Masslynx 4.1軟件Massfragment模塊對圈定的生物標記物進行二級結構驗證。

2.8.3 血中移行成分分析

分別采用UNIFI軟件對LW體內外成分進行直觀比較以及Masslynx 4.1軟件中的Metabolynx模塊對LW干預HICP模型大鼠有效狀態下的血中移行成分進行分析。

2.8.4 相關性分析

運用血清化學成分與代謝標記物相關性分析法（Plotting of Correlation between Marker Metabolites and Serum Constituents，PCMS），對LW入血成分譜與效應標記物進行關聯分析，將LW入血成分群與潛在生物標記物含量變化矩陣導入PCMS軟件，設定相關系數（r）1和2均為0.7，運算后導出相關分析結果Heatmap圖，以0.7≤r≤1作為潛在藥效物質基礎篩選標準，經過進一步篩選圈定干預HICP模型的潛在藥效物質基礎。

3 結果

3.1 行為學檢測結果

各組大鼠行為學檢測結果（見圖1），與假手術對照組相比，HICP模型組大鼠表現為在玻璃棒上懸吊的時間較短，在斜坡上完成調轉頭向上的時間較長，30 s內的活動較少，且很容易被抓取，且通過兩因素方差分析發現，HICP模型組大鼠在斜坡、曠場和拒俘實驗中表現出顯著性差異，說明延遲剖宮產手術能夠影響新生大鼠整體行為能力；但隨著LW給藥時間的延長，HICP模型大鼠的各項行為能力都有所改善，與模型組相比，3個給藥組大鼠在斜坡和拒俘實驗中顯示出了顯著性差異，說明口服LW能夠一定程度上提高HICP模型大鼠的整體行為能力。

3.2 代謝組學分析結果

在給藥第0天即大鼠21日齡時，對假手術對照組與模型組代謝輪廓進行分析，得到相應的得分圖（圖2-1）和S&VIP-plot圖（圖2-2），最終表征了HICP模型大鼠尿液中20個潛在生物標記物（見表1和2），并進一步分析發現這些標記物主要通過影響腦神經中樞和腎臟功能兩方面進一步擾動糖類代謝、氨基酸代謝、核苷酸代謝、煙酸和煙酰胺代謝、甾體激素類生物合成五大代謝途徑。

對LW給藥第28天時5組大鼠代謝輪廓進行PCA及PLS-DA分析，得到相關尿液代謝輪廓得分圖（見3-1和圖3-2），結果表明口服LW使得HICP模型大鼠尿液代謝譜發生明顯變化，顯示LW各給藥組的代謝輪廓較模型組更加接近假手術對照組，且LW給藥組能夠通過調節的代謝經路包括糖類代謝、氨基酸代謝、核苷酸代謝和甾體激素類生物合成四大類代謝途徑回調HICP模型大鼠尿液20個潛在生物標記物中的13個，具體含量變化圖（見圖4）。

圖2 LW給藥第0天即新生大鼠21日齡時假手術對照組與模型組大鼠尿液代謝物S&VIP-plot圖

3.3 六味地黃丸血中移行成分分析

利用UPLC-HDMS技術對LW干預HICP有效狀態下的血中移行成分進行分析，共發現了20個血中顯效成分；包括14個LW體外原型成分及6個代謝產物，詳細信息見表3和表4。

3.4 潛在藥效物質基礎研究

采用PCMS分析方法計算20個色譜峰與HICP模型大鼠尿液潛在生物標記物的相關系數，結果見分析熱圖（見圖5）。進一步對PCMS處理得到的結果進行總體歸納，顯效成分在不同劑量組中與生物標記物高度相關的個數達到9個及以上，認為該顯效成分為與HICP生物標記物高度相關成分。最終圈定了5個成分，分別為：6-O-甲基梓醇、莫諾苷、丹皮酚原苷、毛蕊花苷、獐牙菜苷脫水的代謝產物，均為LW干預HICP模型的潛在藥效物質基礎。

表1 正離子模型下HICP模型大鼠尿液中潛在生物標記物的具體信息表

表2 負離子模型下HICP模型大鼠尿液中潛在生物標記物的具體信息表

圖3 LW不同劑量干預HICP模型大鼠尿液代謝輪廓Score plot圖

圖4 LW干預HICP模型大鼠尿液中潛在生物標記物的含量變化圖

表3 基于直觀比較法LW的血中移行成分鑒定結果（即原型入血成分）

表4 基于Metabolynx數據處理方法的血中移行成分鑒定結果（藥物代謝物入血成分）

圖5 LW血中移行成分與HICP模型尿液潛在生物標記物相關性分析熱圖

4 討論

中醫理論中，腎和腦從屬于一個系統，兩者在生理上相互滋補，在病理上相互影響[10]，而小兒稚陽純氣，無須益火，所以宋代太醫丞錢乙首創了滋補腎陰的名方六味地黃丸用于治療小兒的“五遲、五軟”證。依據此理論，本研究選擇現代醫學中臨床表現與“五遲、五軟”證相近的小兒腦癱動物模型作為研究對象。相關文獻中記載缺氧缺血腦癱模型是最常用的小兒腦癱模型，然而延遲剖宮產手術法較頸動脈結扎法不僅操作簡單，可一次性獲得大量模型大鼠，最重要的是能夠高度模擬人類新生兒因宮內窘迫而致缺氧缺血腦癱的病理進程以及符合“五遲、五軟”證的中醫病機。因此，最終我們采用延遲剖宮產手術法復制HICP模型。

續圖5 LW血中移行成分與HICP模型尿液潛在生物標記物相關性分析熱圖

目前臨床上診斷小兒腦癱，主要依靠其特征性的臨床表現，故經典的神經行為學檢驗是評價腦癱動物模型的重要手段，本研究分別從肌力、身體協調性、空間適應能力和情感行為能力4個方面對LW給藥前后大鼠的行為進行綜合評價。又由于每個時間點每組大鼠在每個行為學實驗中表現參差不齊，所以本實驗又采用行為學總分的方法更直觀的對5組大鼠的整體行為能力進行評價。行為學結果表明了延遲剖宮產手術成功地復制了大鼠缺氧缺血腦癱模型，同時說明了LW能夠在一定程度上改善HICP模型大鼠的整體行為能力。

本研究借助代謝組學技術平臺，從分子水平描述了HICP模型的病理狀態，以及LW通過滋陰補腎的作用調節HICP模型大鼠的腎臟功能，進而改善大腦神經中樞以及身體各方面機能的作用機制，涉及四大類代謝途徑包括：糖類代謝通路、氨基酸代謝通路、核苷酸代謝通路、甾體激素類合成。其中，糖類代謝通路又包括能量代謝和氨基糖苷類代謝，而氨基糖苷類代謝異常，N-乙酰神經氨酸經腎臟消除減少則會造成唾液酸堆積[11,12]，從而引起小兒腦癱癥的發生。結果顯示HICP模型大鼠給予LW后，體內過量的N-乙酰神經氨酸減少，表明LW可能通過提高腎臟對N-乙酰神經氨酸的消除作用從而有效改善小兒腦癱的癥狀。

續圖5 LW血中移行成分與HICP模型尿液潛在生物標記物相關性分析熱圖

氨基酸代謝又包括酪氨酸、色氨酸以及精氨酸和脯氨酸代謝。其中MHPG-SO4是腦中去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE）硫酸化的代謝物。NE是中樞神經系統內重要的神經介質，它對體內許多生理活動具有調節作用[13]。前期研究表明，精神抑郁癥患者血清中MHPG-SO4的表達水平明顯低于健康群體[14]，這可能是造成本研究中HICP模型組較假手術對照組在曠場實驗和拒俘反應實驗中的表現較差的原因，而HICP模型大鼠給予LW后MHPG-SO4相對含量增加，空間適應能力和情感行為能力有所增強，表明LW可能通過調節HICP模型大鼠體內MHPG-SO4的含量，從而有效改善HICP模型大鼠的行為能力。

核苷酸代謝中包括嘌呤核苷酸代謝和嘧啶核苷酸代謝，其中嘌呤核苷酸體內的終產物尿酸是臨床上用于診斷腎臟功能的重要指標[15]。同時，尿酸的甲基衍生物，3-甲基尿酸和1,3-二甲基尿嘧啶可以作為嘌呤核苷酸代謝異常以及泌尿系統結石的標志[16,17]。本研究結果中HICP模型大鼠尿液中尿酸、黃嘌呤核苷酸、3-甲基尿酸和1,3-二甲基尿嘧啶的含量明顯高于假手術對照組，而LW各給藥組大鼠尿液中以上各項指標含量明顯低于HICP模型組，提示LW可能通過增強體內嘌呤核苷酸分解代謝能力以及某些腎臟功能從而緩解HICP模型大鼠的病理狀態。

甾體激素類合成代謝中雄烯二酮減低會導致男性發育遲緩造成侏儒癥[18,19]。研究結果中HICP模型大鼠尿液中雄甾烯二酮的含量較假手術組偏低，這可能是造成模型組大鼠較對照組發育遲緩的原因。而LW正是通過改善大鼠體內的甾體激素類合成從而促進HICP模型大鼠的生長發育。

通過行為學和代謝組學結果闡明了LW對HICP模型干預作用的基礎上，利用中藥血清藥學化學的理論和方法，對LW干預HICP模型有效狀態下的體內直接作用成分進行分析，最終發現了20個入血成分，又通過PCMS軟件，建立LW體內直接作用成分“譜”對生物標記物“效”的關系，即提取與內源性生物標記物高度相關的外源性中藥成分，并最終篩選出6-O-甲基梓醇、莫諾苷、丹皮酚原苷、毛蕊花苷、獐牙菜苷脫水的代謝產物為LW干預HICP模型潛在藥效物質基礎。

綜上所述，本研究借助中醫方證代謝組學理論和技術，表明六味地黃通過調節機體的糖類代謝、氨基酸代謝、核苷酸代謝和甾體激素類生物合成四大類代謝途徑，有效改善缺氧缺血的病理狀態，從而干預小兒腦癱發生發展的病理過程。并通過PCMS軟件篩選出LW干預HICP模型潛在藥效物質基礎即6-O-甲基梓醇、莫諾苷、丹皮酚原苷、毛蕊花苷、獐牙菜苷脫水的代謝產物。中醫方證代謝組學理論是揭示中藥的藥效物質基礎的有力手段。

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Impacts of Liu Wei Di Huang Wan (LW) on a Rat Model of Cerebral Palsy Based on Chinmedomics

Li Qiuju, Wang Ping, Wang Meijia, Kang Shuyu, Zhang Ye, Zhang Aihua, Wang Xijun
(Research Center of Chinmedomics-State Administration of TCM-Laboratory of Metabolomics / National TCM Key Laboratory of Serum Pharmacochemistry / Sino-US Chinmedomics Technology Cooperation Center, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

This study aimed to explore the pharmacodynamic material basis of Liu Wei Di Huang Wan (LW) in the rat model of cerebral palsy and its mechanism based on the theory and technological platform of Chinmedomics. The delayed cesarean operation was performed to establish the rat model of hypoxic-ischemic cerebral palsy (HICP) and ensued the evaluation of the model with classical behavior and the administration of LW. At last, the correlation between the potential biomarkers of HICP was computed and the markedly component of LW in vivo was explored by the technologies of chinmedomics. It was found that four categories of metabolic pathways of HICP rats were regulate within the administration of LW, involving carbohydrate metabolism, amino acid metabolism, nucleotide metabolism and steroid hormone synthesis biological metabolic, to promote motor ability of HICP rats. It was determined that 6-O-methylcatalpol, morroniside, verbascose, paeonolide, and the dehydrated metabolite of Sweroside were the potential pharmacodynamic materials of LW in its treatment of HICP. It was concluded that chinmedomics was a powerful method of clarifing the pharmacodynamic materials of Chinese materia medica.

Chinmedomics, hypoxic-ischemic cerebral palsy, Liu Wei Di Huang Wan, pharmacodynamic materials, metabolites, traditional Chinese medicine, serum pharmacochemistry of Chinese materia medica, metabolomics

10.11842/wst.2016.10.008

R285

A

（責任編輯：朱黎婷，責任譯審：朱黎婷）

2016-09-19

修回日期：2016-10-17

＊ 國家自然科學基金委重點項目（81430093）：中藥體內藥效物質基礎的系統分析方法學——中醫方證代謝組學研究，負責人：王喜軍；科學技術部“重大新藥創制”國家科技重大專項（2015ZX09101043-011）：課題名稱：中藥經典名方整合作用機制關鍵技術研究，負責人：王喜軍；國家自然科學基金委面上項目（81473584）：基于新生大鼠腦癱模型的六味地黃丸治療“五遲”、“五軟”證的作用機理及藥效物質基礎研究，負責人：王萍。

＊＊ 通訊作者：王喜軍，本刊編委，教授，博士生導師，主要研究方向：中藥血清藥物化學及中醫方證代謝組學研究。