基于中醫方證代謝組學的生脈散干預老年癡呆癥大鼠的藥效物質基礎研究＊

盧盛文，孔 玲，初 航，韓 瑩，韓金偉，劉志東，王喜軍

（黑龍江中醫藥大學國家中醫藥管理局中醫方證代謝組學研究中心/國家中醫藥管理局中藥血清藥物化學重點研究室/中美中醫方證代謝組學技術合作中心 哈爾濱 150040）

基于中醫方證代謝組學的生脈散干預老年癡呆癥大鼠的藥效物質基礎研究＊

盧盛文，孔 玲，初 航，韓 瑩，韓金偉，劉志東，王喜軍＊＊

（黑龍江中醫藥大學國家中醫藥管理局中醫方證代謝組學研究中心/國家中醫藥管理局中藥血清藥物化學重點研究室/中美中醫方證代謝組學技術合作中心 哈爾濱 150040）

目的：本實驗主要利用中醫方證代謝組學技術評價生脈散預防老年癡呆的藥效及發現其關鍵物質基礎。方法：首先采用灌胃三氯化鋁聯合腹腔注射D-半乳糖連續90天建立老年癡呆大鼠模型，并利用UPLC-HDMS技術采集和分析模型大鼠尿液代謝數據，共確定了42個老年癡呆癥的生物標記物；同時干預組在造模同時采用連續給與生脈散凍干粉溶液（5.3 g·kg-1）對模型大鼠進行治療。結果：通過Morris水迷宮、腦組織病理學檢測及Aβ免疫組化等方法評價了生脈散的干預作用，發現了生脈散具有抑制Aβ毒性、保護神經元和改善認知障礙的作用；在此基礎上利用代謝組學技術評價了干預組對42個老年癡呆生物標志物的調節作用，發現生脈散主要影響了色氨酸代謝和脂質代謝的多個靶點；同時采用血清藥物化學方法研究了生脈散的體內直接作用物質，找到30種成分并與生脈散明顯回調的生物標志物相關聯。結論：本實驗發現了五味子木質素類及人參皂苷類的多種成分與色氨酸代謝和脂質代謝極度相關，為生脈散預防老年癡呆的藥效物質基礎。

方證代謝組學 生脈散 老年癡呆癥 色氨酸代謝 脂質代謝

老年癡呆癥是一種神經退行性疾病，以記憶障礙作為典型癥狀。目前缺乏有效的治療藥物[1]。中醫理論認為老年癡呆癥屬于“善忘”和“健忘”的范疇，與臟腑功能、氣血運行和情志等多種因素有關[2,3]。其治則以調節臟腑功能，運行氣血為主。生脈散屬補益劑，補肺氣養心，《醫方論·卷三·清暑之劑》云：“肺主氣，心主血，生脈散養心肺之陰，使氣血得以榮養一身”。現代臨床使用生脈散治療老年癡呆癥也取得了一定的療效[4-6]。生脈散由人參、麥冬和五味子組成,含有多種活性成分[7-9]。但是這些成分中哪些是有效成分，它們又如何在體內相互配合發揮藥效目前尚不清楚。因此生脈散的藥效評價及發現藥效物質成為了科學闡明生脈散抗老年癡呆機制及新藥開發的前提。

生脈散作為方劑具有復雜的成分體系和體內的作用靶點，目前缺乏非導向性的多靶點藥物評價方法及藥物篩選方法。而中醫方證代謝組學的出現有望填補這個領域的空白[10]。該方法通過代謝組學技術系統評價證候的生物學特點，以特征性生物標記物建立中藥的藥效評價體系。本文通過“證候診斷-方劑效應評價-體內直接作用物質分析”研究思路建立證候與方劑之間的聯系[11,12]。根據這種方法本實驗在灌胃三氯化鋁聯合腹腔注射D-半乳糖成功建立老年癡呆癥大鼠模型基礎上[13]，首先利用代謝組學技術系統評價了老年癡呆癥大鼠模型的尿液代謝特點。以老年癡呆特征性的生物標志物建立生脈散的藥效評價體系；通過經典的行為學、腦組織病理學檢測及Aβ免疫組化等經典方法評價了生脈散的干預作用。在干預有效性的前提下分析了生脈散體內直接作用物質；并且將這些物質與生脈散明顯調節的老年癡呆癥生物標記物進行相關性分析，發現了生脈散預防老年癡呆癥的藥效物質基礎，為生脈散干預老年癡呆癥的作用機理及預防老年癡呆新藥開發提供依據。

1 材料

1.1 儀器

Morris 水迷宮（中國醫學科學院藥物研究所）；Histostar組織包埋機（德國Thermo Fisher Scientific公司）；HM 340E石蠟切片機（德國Thermo公司）；BX 60研究型顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；DP 72顯微攝像系統（日本OLYMPUS公司）；Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統；995 超低溫冰箱（美國Thermo Scientific公司）。美國Waters AcquityTMUPLC液相色譜儀（四元梯度泵-在線真空脫氣機-自動進樣器-二極管陣列檢測器-柱溫箱）；美國Waters SynaptTM G2-Si 質譜分析系統；MassLynx V4.1工作站；Sorvall ST 16R臺式離心機（美國Thermo Scientific公司）；KQ-500DB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Nichipet EX微量取樣器（100-1 000 μL、10-100 μL，日本NICHIRYO公司）；氮吹儀（美國Organomation公司）；Lab Dancer S25圓周試管振蕩器（德國IKA公司）；固相萃取柱SPE（Oasis HLB 3cc 60mg，美國Waters公司）；Thermo Scientific 995 超低溫冰箱（美國Thermo Scientific公司）。

1.2 藥品與試劑

全須生曬參Panax ginseng C. A. Mey.、麥冬Ophiopogon japonicas（Thunb.） Ker-Gawl.、五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill購于北京同仁堂藥店；無水氯化鋁（分析級，天津市光復精細化工研究所）；D-半乳糖（合肥Biosharp生物科技公司）。

乙腈（色譜級，德國Merck公司）；甲醇（色譜級，美國Fisher公司）；蒸餾水（中國廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；甲酸（色譜級，中國天津科密歐化學試劑有限公司）；亮氨酸腦啡肽（美國SIGMA公司）；戊巴比妥鈉粉末（上?；瘜W試劑采購供應站）；氯化鈉注射液（哈爾濱三聯藥業有限公司）；實驗所用其它試劑均為分析級。

1.3 給藥樣品的制備

1.3.1 生脈散溶液制備

根據生脈散最早用藥量記載：“生脈散：人參，五錢，麥門冬，三錢，五味子，一錢五分，白水煎，溫服”（明·汪機《醫學原理》），折合現代用藥劑量為：人參15.625 g、麥冬9.375 g、五味子4.688 g；根據國家中醫藥管理局《醫療機構中藥煎藥室管理規范》制定生脈散煎藥方法：按照原方劑量稱取3種藥材放入450 mL蒸餾水中浸泡1 h后，武火將混合液煮沸后調至文火保持微沸1 h，用紗布過濾并收集濾液；濾渣中再加入300 mL蒸餾水重復以上過程2次。將3次的濾液混合放置室溫后進行冷凍干燥制備凍干粉。將適量生脈散凍干粉溶于蒸餾水中，配制成生藥濃度為0.53 g·mL-1的生脈散灌胃溶液，大鼠灌胃劑量為5.3 g·kg-1。

1.3.2 氯化鋁溶液制備

稱取氯化鋁粉末（AlCl3）0.28 g置于100 mL容量瓶中，加入蒸餾水至刻度，充分混勻，配置成2.8 mg·mL-1的氯化鋁溶液。

1.3.3 D-半乳糖溶液制備

稱取D-半乳糖（D-galactose，D-gal）0.63 g置于100 mL容量瓶中，加入蒸餾水至刻度，充分混勻，配置成6.3 mg·mL-1的D-半乳糖溶液。

2 方法

2.1 實驗動物及分組

取Wistar大鼠，雄性，9周齡，體質量260±20 g共40只，由黑龍江中醫藥大學藥物安全性評價中心提供，動物許可證號：P00102004。室溫飼養，動物自由攝食飲水。適應環境一周后,先將動物進行Morris水迷宮初篩，去除潛伏期小于50 s和游泳姿勢不良者，將合格大鼠隨機分為空白對照組10只，AD模型組10只，生脈散干預組10只。

2.2 造模方法

大鼠灌胃給予AlCl328 mg·kg-1，同時腹腔注射D-半乳糖63 mg·kg-1，共90天復制老年癡呆癥大鼠模型。

2.3 樣品采集

AD模型組和干預組于每天下午2∶00復制老年癡呆癥大鼠模型，干預組每天上午8∶00按生藥量給予生脈散凍干粉溶液5.3 g·kg-1，空白對照組每天給予等量生理鹽水；實驗開始后，每天夜間將老年癡呆癥模型和給藥組及空白組大鼠于置于大鼠代謝籠中，次日早8∶00收集夜尿，共計90天?？瞻讓φ战M、老年癡呆癥模型組和生脈散干預組于實驗第85天進行持續6天的行為學評價（Morris水迷宮）；于實驗第91天采集各組腦組織樣本進行免疫組化和HE染色法分析，以及血清樣本進行體內成分分析。

2.4 免疫組化和蘇木精-伊紅染色檢測

按照HE染色和免疫組化方法步驟制備海馬病理組織切片，并在40和100倍鏡下采集照片。

收集得到的尿液樣品于-4℃，13 000 rpm離心15 min后取上層清液，蒸餾水稀釋一倍，混懸振蕩30 s后，0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液2 μL進UPLC-G2-Si。色譜條件：樣品分離采用超快速高效液相色譜系統，流動相A為0.1%甲酸乙腈，流動相B為0.1%甲酸水；柱溫預設：45℃；樣品倉溫度預設：4℃；流速：0.4 mL·min-1；色譜儀流出液不經分流直接注入質譜儀進行正負離子掃描分析；梯度洗脫程序見表1。質譜條件：電噴霧離子源（ESI）：采用SynaptTMG2-Si 質譜分析系統（高分辨四級桿串聯飛行時間質譜儀）；脫溶劑氣流量：800 L·h-1；脫溶劑氣溫度：450℃；錐孔反吹氣流量：50 L·h-1；離子源溫度：110℃；錐孔電壓：20 V；毛細管電壓：3.0 kV；鎖定質量溶液：采用美國Waters公司Lockspray校正系統進行在線質量校正，亮氨酸-腦啡肽（Leueine-Enkephalin，正離子模式：[M+H]+=556.277 1，負離子模式：[M-H]-=554.277 1），溶液濃度為1 ng·mL-1，流速為5 μL·min-1；質量掃描范圍：m/z 50-1 000 Da，掃描時間0.2 s；以centriod模式進行數據采集；工作站：MassLynx V4.1工作站。

表1 代謝組學分析色譜洗脫梯度表

表2 生脈散體內成分分析色譜洗脫梯度表

2.6 血中移行成分數據采集方法

取模型大鼠及藥物干預大鼠血清各2 mL，緩慢通過已活化的Waters OASIS固相萃取柱，先用純凈水6 mL洗柱，然后用甲醇6 mL洗脫，收集洗脫液氮氣流吹干，殘渣以100 μL乙腈定容，混懸震蕩60 s，離心（13 000 rpm，4℃，10 min）取上清液供UPLCHDMS分析。

色譜條件：流動相：A為0.1%甲酸水，B為0.1%甲酸乙腈；柱溫預設：45℃；樣品倉溫度預設：4℃；流速：0.5 mL·min-1；進樣體積：3 μL；色譜儀流出液不經分流直接注入質譜儀進行正負離子掃描分析。色譜條件見表2。質譜條件：電噴霧離子源（ESI）：采用SynaptTM G2-Si 質譜分析系統（高分辨四級桿串聯飛行時間質譜儀）；脫溶劑氣流量：750 L·h-1；脫溶劑氣溫度：350℃；錐孔反吹氣流量：50 L·h-1；離子源溫度：120℃；錐孔電壓：30 V；毛細管電壓： 2.8 kV（正離子），3.0 kV（負離子）；鎖定質量溶液：采用美國Waters公司Lockspray校正系統進行在線質量校正，亮氨酸-腦啡肽（Leueine-Enkephalin，[M+H]+=556.277 1），溶液濃度為1 ng·μL-1，流速為5 μL·min-1；質量掃描范圍：m/z 50-1 000 Da，掃描時間0.2 s；以centriod模式進行數據采集；工作站：MassLynx V4.1工作站。

2.7 數據處理方法

2.7.1 統計學分析

數據采用SPSS 17.0軟件處理，統計結果以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Bonferroni檢驗。P＜0.05認為有顯著的統計學差異。

2.7.2 代謝組學分析

本文提出了基于磁開關的近方波脈沖Marx發生器技術路線，摒棄了傳統發生器中的氣體開關與觸發系統，利用磁開關磁場的同步控制，保證各級開關同步導通。同時，基于多倍頻電壓脈沖的疊加原理，使得發生器具備輸出方波脈沖的能力。

將質譜采集到的空白對照組與老年癡呆癥模型組大鼠尿液數據標準化處理后進行監督模式的主成分分析（OPLSDA），計算出各個離子的能反映組內聚類和組間分離的貢獻度VIP值，同時對標準化后的數據進行t檢驗，篩選出組間差異P＜0.05的具有統計學意義的離子作為候選離子并進行元素匹配及二級鑒定。

2.7.3 血中移行成分鑒定

將質譜采集到的老年癡呆癥模型組和干預組兩組血液樣本數據通過有監督模式的OPLS-DA分析，對能夠引起組間差異的離子進行聚焦。選擇平均相對含量在老年癡呆癥模型組較低甚至沒有，而在干預組中含量較高的離子作為老年癡呆癥大鼠模型口服生脈散后的血中移行成分分析的研究對象，再進行二級質譜數據采集，結合網絡數據庫進行結構鑒定，最終獲得入血成分信息。

3 結果

3.1 生脈散對大鼠老年癡呆模型干預作用的行為學評價

在定位航行實驗過程中，與空白對照組大鼠相比，老年癡呆癥模型組大鼠逃避潛伏期時間顯著延長，差異具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；與老年癡呆癥模型組大鼠相比，生脈散干預組大鼠逃避潛伏期時間顯著縮短，差異具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），具體結果見圖1A。

圖1 生脈散對大鼠老年癡呆癥模型干預作用的宏觀評價

在空間搜索實驗中，與空白對照組大鼠相比，老年癡呆癥模型組大鼠穿越平臺次數顯著減少，差異具有統計學意義（P＜0.01）；與老年癡呆癥模型組大鼠相比，生脈散干預組大鼠穿越平臺次數顯著增加，差異具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），具體結果見圖1B。

3.2 生脈散對大鼠老年癡呆模型干預作用的病理學評價

腦組織HE染色結果顯示（如圖1C），模型復制第91天老年癡呆癥模型組與空白對照組相比，大鼠的海馬CA3區神經元排列松散，數量減少，神經元細胞核逐漸呈現固縮狀，胞漿深紫，核膜胞膜界限模糊，可見壞死神經元。干預組與老年癡呆癥模型組相比，大鼠腦組織皮層及海馬CA3區神經元細胞排列緊密整齊，層次清晰，數量較多，細胞體大而飽滿，核仁清楚。

腦組織Aβ1-40免疫組化結果顯示（如圖1D），模型復制第91天老年癡呆癥模型組與空白對照組相比，大鼠腦組織皮層及海馬CA3區出現明顯的Aβ1-40黃棕色陽性斑塊。陽性反應物多聚集在神經元胞體，未見較大的陽性斑塊積聚。生脈散干預組與老年癡呆癥模型組相比Aβ1-40黃棕色陽性斑塊面積明顯減少，通過對Aβ1-40蛋白的相對含量進行統計學分析發現，其減少程度具有統計學意義（如圖1E）。

3.3 生脈散對大鼠老年癡呆模型代謝輪廓及生物標記物的影響

通過對第90天模型與空白組大鼠尿液數據進行OPLSDA分析（圖2A），發現了42個具有顯著差異（P＜0.05）的離子并進行鑒定（見表3）。通過分類并按VIP貢獻值排布（圖2B），將這些差異代謝產物作為反映老年癡呆模型的潛在生物標志物；其次將空白對照組、老年癡呆癥模型組與干預組大鼠標準化處理后的尿液數據行非監督型主成分分析（PCA），得到了反映各組大鼠尿液代謝差異變化的Score plot圖（圖2C），從圖中可以看出，老年癡呆癥模型組與空白對照組完全分離，同時干預組具有一定的回調趨勢。在已鑒定的42個反映老年癡呆模型的潛在生物標志物的基礎上研究生脈散的干預作用，通過標志物在各組中的相對含量研究發現生脈散能夠回調25個異常代謝產物的水平，其中有2個具有顯著性差異，7個具有極顯著性差異（圖2D）。利用KEGG、HMDB等相關代謝產物數據庫將老年癡呆模型的潛在生物標志物建立代謝網絡，并以各標志物的VIP值來評價其貢獻度（圖3A），同時將生脈散能夠回調的標志物的VIP值乘以生脈散的相對含量回調率來評價生脈散的干預作用（圖3B），發現生脈散對氨基酸代謝、核酸代謝、脂類代謝、多巴胺代謝、碳水化合物代謝、能量代謝、有機酸代謝都有不同程度的調節作用。通過生脈散干預作用評價發現其最主要影響了色氨酸代謝和脂類代謝。

3.4 生脈散干預大鼠老年癡呆模型的血中移行成分與代謝標記物相關性研究

通過有監督模式的OPLS-DA分析（圖4A），得到了平均相對含量在老年癡呆癥模型組較低甚至沒有，而在干預組中含量較高的離子（圖4B），共鑒定30個生脈散血中移行成分。采用PCMS分析方法，分別計算這30個血中移行成分與生脈散能夠顯著回調的老年癡呆潛在生物標記物效應的Pearson相關系數；本次實驗設置0.9≤| r |≤1為極度正（負）相關。生脈散干預組的關聯性分析結果如圖4C，其中13個血中移行成分與9個尿液代謝產物極度相關。色氨酸代謝和脂質代謝是老年癡呆模型的關鍵異常代謝網絡，生脈散可以明顯調節色氨酸異常代謝的3個標志物。其中γ-五味子醇甲、五味子乙素和當歸酰戈米辛H（Angeloylgomisin H）與5-甲氧基色醇成極度負相關；五味子醇甲與3-甲基二氧吲哚成極度正相關；人參皂苷RK3和戈米辛D與順-4-癸烯酸成極度正相關。

4 討論

在由于老年癡呆癥的疾病機制和生脈散的藥物成分都十分復雜，在生脈散預防老年癡呆發生發展機制的研究中，常規的藥物活性成分篩選和作用機制研究方法多為多成分-單指標、單成分-單指標或單成分-多指標的研究模式。即使有多成分-多指標的研究過程，一般也是預先限定的多個目標成分或指定的檢測指標。這種非開放式的研究模式在早期探索階段意義重大，但是隨著藥物分析技術的不斷進步，人們需要利用這些新技術開發新的研究方法，更客觀、真實、全面地研究生脈散預防老年癡呆的多成分作用機制。因此本次實驗在利用經典的行為學和病理學驗證了生脈散干預老年癡呆作用的背景下，采用方證代謝組學研究模式深入研究生脈散多成分的作用機制。首先通過代謝組學技術開放式尋找機體的評價指標，客觀分析了老年癡呆模型組大鼠的尿液異常代謝產物，以此來評價生脈散的多靶點調節作用。發現生脈散對老年癡呆模型大鼠的42個生物標記物有不同程度的調節作用，其中色氨酸及脂質代謝異常具有明顯的調節作用。從代謝組學角度闡明了生脈散的多靶點作用機理；同時利用血清藥物化學技術分析了生脈散的體內入血成分，并將這些入血成分與生脈散明顯回調的生物標記物進行了相關性分析，發現五味子木質素類成分和人參皂苷類成分與色氨酸代謝和脂質代謝異常極度相關，其中γ-五味子醇甲、五味子乙素和當歸酰戈米辛H與5-甲氧基色醇成極度負相關；五味子醇甲與3-甲基二氧吲哚成極度正相關；人參皂苷RK3和戈米辛D與順-4-癸烯酸成極度正相關。這些相關性成分將作為生脈散干預老年癡呆的藥效物質基礎進行進一步驗證研究。

圖2 生脈散對大鼠老年癡呆癥尿液潛在代謝標記物的干預作用研究

圖3 生脈散干預老年癡呆尿液潛在生物標記物代謝網絡影響評價圖

表3 老年癡呆模型大鼠尿液潛在生物標記物的具體信息表

綜上所述，本次實驗首先宏觀評價了生脈散對老年癡呆大鼠模型干預作用。在明確藥效作用背景下，采用方證代謝組學技術，以老年癡呆癥的生物標記物為基礎，建立生脈散抗老年癡呆生物藥效評價體系對生脈散進行抗老年癡呆的多靶點評價。同時與生脈散的體內入血成分相關聯，發現了生脈散干預老年癡呆的藥效物質基礎。為中藥方劑生脈散的預防老年癡呆藥效評價，以及中藥成分抗老年癡呆新藥開發奠定基礎。

圖4 生脈散的入血成分與大鼠老年癡呆癥尿液潛在代謝標志物的相關性研究

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A Research for Evaluating the Effectiveness and Discovering the Pharmacodynamic Substances of Sheng Mai San (SMS) in the Treatment of Alzheimer’s Disease (AD)

Lu Shengwen, Kong Lin, Chu Hang, Han Ying, Han Jinwei, Liu Zhidong, Wang Xijun
(Research Center of Chinmedomics-State Administration of TCM-Laboratory of Metabolomics, National TCM Key Laboratory of Serum Pharmacochemistry, Sino-US Chinmedomics Technology Cooperation Center, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

The aim of this study was to evaluate the effectiveness and discover the pharmacodynamic substances of SMS in the treatment of AD. AD model rats were successfully established with the 90-day continuous intragastric administration of aluminium chloride and intraperitoneal injection of D-galactose. Morris water maze test, histopathological staining and immunohistochemical staining were adopted to evaluate the progress of AD in model rats and the efficacy of SMS. Metabolomic technology platform was used to reveal the potential biomarkers and the metabolic network of AD and the target spots of impacted metabolic pathways after the administration of SMS. As a result, it was found that SMS performed the regulatory effects on certain metabolic pathways, in which tryptophan and lipid metabolism were involved in the main metabolic pathways influenced by SMS. Serum pharmacochemical technologies of TCM were introduced to investigate the constituents absorbed into the blood after lavage administration of SMS. In conclusion, the constituents were associated with target spots of influenced metabolic pathways which elucidated the pharmacodynamic basis. The components of lignins and their metabolites and ginsenoside were the most relevant materials of AD associated with tryptophan and lipid metabolism, which may be the pharmacodynamic basis of AD playing therapeutic roles of SMS.

Chinmedomics, Sheng Mai San, Alzheimer's disease, tryptophan metabolism, lipid metabolism

10.11842/wst.2016.10.011

R285

A

（責任編輯：朱黎婷，責任譯審：朱黎婷）

2016-09-19

修回日期：2016-10-19

＊ 國家自然科學基金委重點項目（81430093）：中藥體內藥效物質基礎的系統分析方法學——中醫方證代謝組學研究，負責人：王喜軍；科學技術部“重大新藥創制”國家科技重大專項（2015ZX09101043-011）：中藥經典名方整合作用機制關鍵技術研究，負責人：王喜軍。

＊＊ 通訊作者：王喜軍，本刊編委，教授，博士生導師，主要研究方向：中藥血清藥物化學及中醫方證代謝組學研究。