山柰酚對2型糖尿病小鼠骨骼肌PI3K-AKTGLUT4信號通路的影響＊

張 茁，孫 文，劉銅華，郭 璇，候 丹，許光遠，吳麗麗，秦靈靈，侯 毅，張 露，張程斐

（1.陜西中醫藥大學第一臨床醫學院 咸陽 712000；2.北京中醫藥大學教育部中醫養生學重點實驗室 北京 100029； 3.北京中醫藥大學研究生院 北京 100029；

4.北京中醫藥大學東方醫院 北京 100029；5. 北京中醫藥大學科技處 北京 100029）

山柰酚對2型糖尿病小鼠骨骼肌PI3K-AKTGLUT4信號通路的影響＊

張 茁1，孫 文2，劉銅華3＊＊，郭 璇4，候 丹1，許光遠4，吳麗麗2，秦靈靈5，侯 毅4，張 露4，張程斐4

（1.陜西中醫藥大學第一臨床醫學院 咸陽 712000；2.北京中醫藥大學教育部中醫養生學重點實驗室 北京 100029； 3.北京中醫藥大學研究生院 北京 100029；

4.北京中醫藥大學東方醫院 北京 100029；5. 北京中醫藥大學科技處 北京 100029）

目的：探討山柰酚對KKAy小鼠骨骼肌PI3K/AKT/GLUT4信號通路的影響。方法：以自發型2型糖尿病KKAy小鼠為動物模型，通過對糖尿病小鼠進行為期6周的山柰酚灌胃給藥治療，利用生化、免疫組織化學及免疫印跡法等檢驗方法，檢測PI3K-AKT-GLUT4信號通路重要靶點的表達，探討山柰酚改善糖尿病KKAy小鼠骨骼肌胰島素敏感性及對胰島素信號轉導通路PI3K-AKT-GLUT4的影響。結果：山柰酚具有顯著降低KKAy小鼠體重、空腹血糖、隨機血糖的作用，ITT實驗結果說明：山柰酚能夠顯著降低胰島素注射30 min時的血糖，顯著降低ITT曲線下面積，改善胰島素抵抗。此外，山柰酚能夠顯著上調KKAy小鼠骨骼肌PI3K、AKT、GLUT4基因的表達，能夠上調AKT、GLUT4蛋白的表達。結論：山柰酚具有顯著降低KKAy小鼠血糖、體重的作用，能夠改善胰島素抵抗，其作用機制可能與上調骨骼肌PI3K-AKTGLUT4信號通路有關。

山柰酚 2型糖尿病 骨骼肌 PI3K-AKT-GLUT4信號通路 實驗研究

2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）是一類以胰島素分泌相對不足和胰島素抵抗（Insulin Resistance，IR）為病理生理基礎的代謝疾病，是目前糖尿病的主要類型[1]。IR的主要特征是組織器官對胰島素的敏感性降低。骨骼肌是糖代謝受到胰島素調控的重要作用部位，PI3K-AKT-GLUT4信號通路是細胞內胰島素信號傳導的重要通路，與IR的發生密切相關[2]。山柰酚（Kaempferol，KA）是從姜科植物山柰以及檀香科植物百蕊草中提取的黃酮類化合物[3]，具有降血糖、抑制腫瘤細胞增殖和抗氧化等作用，且不良反應較少，具有多種潛在藥用價值[4,5]。目前，已有多項研究表明，山柰酚可用于治療T2MD，但具體機制尚不明確[6]。本實驗通過觀察山柰酚對自發型2型糖尿病KKAy小鼠骨骼肌PI3K-AKTGLUT4信號通路的影響來探討其治療T2MD改善IR的機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

8周齡雄性KKAy小鼠12只，同周齡雄性C57BL/6J小鼠6只，購于中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，許可證號：SCXK（京）2009-0004，飼養于北京市動物實驗中心SPF級動物實驗室；溫度21-25℃、濕度45%-65%，12/12 h光照黑暗循環，自由攝食飲水。KKAy小鼠喂養全價高脂飼料（78.8%基礎飼料、10.0%蛋黃粉、10.0%豬油、1.0%膽固醇、0.2%膽鹽，由中國醫學科學院實驗動物研究所）；C57BL/6J小鼠喂養普通全價營養顆粒鼠飼料。

1.2 儀器與試藥

血糖試紙、GT-1810血糖儀（日本京都公司，型號：GT1941）；高脂飼料（中國醫學科學院實驗動物研究所，許可證號：SCXK京-2009-0014）；生物合成人胰島素注射液（丹麥諾和諾德公司，批號：國藥準字J20100117）；PI3K、AKT、GLUT4、GAPDH mRNA引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；AKT、GLUT4抗體、β-actin抗體（CST公司，批號分別為：0020、0006、0026）；GoTaq?qPCR Master Mix（Thermo公司，批號：00076581）；葡萄糖測定試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司，批號：E1010），蛋白定量試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司，批號：P1510），30%聚丙烯酰胺-雙丙烯酰胺溶液（北京普利萊基因技術有限公司，批號：B1000），GLUT4一抗（美國Cell Signaling Technology公司，批號：#2213），AKT 一抗（北京博奧森生物技術有限公司，批號：bs-6951R）等；山柰酚（成都普瑞法科技有限公司，純度＞98%，批號：13060307）。

2 方法

2.1 分組與給藥

KKAy小鼠適應性喂養1周后，連續3天于早晨7點測量小鼠隨機血糖，連續3天血糖高于13.9 mmol·L-1的動物即為2型糖尿病動物模型并入組，按體重和隨機血糖隨機分為模型組、山柰酚組；同周齡C57BL/6J小鼠6只為正常組。山柰酚組灌胃給藥山柰酚水溶液50 mg·kg-1（體重）；模型組和正常組給以等劑量的生理鹽水灌胃給藥，1次/日，每天上午7：00-8:00點給藥，連續給藥6周。

2.2 一般情況檢測

實驗期間，觀察小鼠精神狀態、活動情況、毛色、進食、飲水量等，每周記錄進食量、飲水量、體質量變化。

2.3 血糖水平

分別于0、3、6周檢測小鼠空腹血糖水平，檢測前12 h禁食不禁水，次日清晨斷尾取血檢測空腹血糖。分別0、3、6周末日清晨8:00段位取血檢測各組小鼠隨機血糖。

2.4 胰島素耐量實驗

給藥6周后進行胰島素耐量實驗（Insulin Tolerance Test，ITT）實驗，于早晨8:00禁食不禁水4 h，于當天中午12:00始腹腔注射短效胰島素1 U·kg-1（體質量），測定0、30、60、90、120 min血糖并繪制曲線，采用血糖儀斷尾檢測法測定血糖值。

2.5 RT-PCR檢測骨骼肌PI3K、AKT、GLUT4 mRNA表達

取液氮凍存的骨骼肌組織，使用RNA提取試劑盒提取總RNA；進行反轉錄，向RNA中加入逆轉錄引物，向10 μL RNA/引物混合物中加入10 μL GoScriptTM反應液，退火25℃ 5 min，延伸42℃ 1 h，滅活70℃ 15min，得到cDNA。RT-PCR 20 μL反應體系，將2 μL cDNA稀釋液加入10 μL GoTaq反應液、7.2 μL Nuclease-Free Water和0.8 μL引物混合物，置于Applied Biosystems 7 500 Real Time PCR System進行反應，反應條件：95℃10 min；95℃15 s，60℃ 1 min（共40次循環）；95℃15 s，60℃ 15 s溶解。反應條件參照說明書設定，再以內參校正，求得目的基因相對表達水平。引物序列如下：GAPDH上游引物 5′-TGAAGCAGGCATCTGAGGG -3′，下游引物5′- CGAAGGTGGAAGAGTGGGAG -3′；PI3K上游引物5′- GCTCCTGGAAGCCATTGAGAA -3′，下游引物5′- CGTCGATCATCTCCAAGTCCAC -3′；AKT上游引物5’- CCCTTCTACAACCAGGACCA -3′，下游引物5′- ATACACATCCTGCCACACGA -3′；GLUT4上游引物5′- AACGGATAGGGAGCAGAAA CCCAA-3′，下游引物5′- GTGCAAAGGGTGAGTGA GGCATTT -3′。

2.6 Western blot檢測骨骼肌PI3K、AKT、GLUT4蛋白表達

取液氮凍存的骨骼肌，用預冷RIPA裂解液提取蛋白，加上樣緩沖液，沸水浴5 min蛋白變性，制備凝膠，進行20 μg上樣，100 V電泳1.5 h，半干轉膜轉25 V 15 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加一抗（1：1 000稀釋），4℃孵育過夜，TBST洗滌10 min，3次，加二抗（1：10 000），室溫1 h，TBST洗滌10 min，3次，加ECL發光液反應1 min，置于凝膠成像系統成像，蛋白條帶用Image J 7.0圖像分析。

2.7 統計學方法

3 結果

3.1 山柰酚對KKAy小鼠一般情況的影響

正常組C57BL/6J精神良好，活動自如，皮毛光澤。與正常組比較，KKAy小鼠逐漸出現精神萎靡、動作緩慢、毛色欠佳、多尿等現象，并且體質量增加（P＜0.01）。與正常組比較，山柰酚組小鼠以上狀況得到改善，體質量顯著降低（P＜0.01）（表1）。

3.2 山柰酚對KKAy小鼠血糖水平的影響

治療6周后，與正常組小鼠相比，模型組空腹血糖、隨機血糖顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，山柰酚組小鼠空腹血糖、隨機血糖顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），說明山柰酚有降低KKAy小鼠高血糖的作用（表2、表3）。

表1 山柰酚對KKAy小鼠體質量的影響/g(±s，n=6）

表1 山柰酚對KKAy小鼠體質量的影響/g(±s，n=6）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；下同。

分組第0周第2周第4周第6周正常組20.60±1.78 23.96±3.24 23.57±1.14 24.89±0.84模型組30.43±6.63**33.63±3.96**37.40±4.30**40.36±3.00**山柰酚組34.40±1.71 35.10±1.99 36.61±2.20 37.11±2.08#

表2 山柰酚對KKAy小鼠空腹血糖水平的影響/mmol·L-1(±s，n=6）

表2 山柰酚對KKAy小鼠空腹血糖水平的影響/mmol·L-1(±s，n=6）

分組第0周第3周第6周正常組5.87±1.834.39±1.07 5.23±0.65模型組10.73±1.35**12.01±4.33**12.07±4.35**山柰酚組10.96±1.78 8.93±2.15 6.36±0.53##

表3 山柰酚對KKAy小鼠隨機血糖水平的影響/mmol·L-1(±s，n=6）

表3 山柰酚對KKAy小鼠隨機血糖水平的影響/mmol·L-1(±s，n=6）

分組第0周第3周第6周正常組7.76±0.61 6.21±0.85 7.93±1.48模型組31.59±2.42**30.33±5.21**32.37±1.35**山柰酚組31.23±2.26 29.73±2.67 28.64±2.81##

3.3 山柰酚對KKAy小鼠ITT的影響

治療6周后，進行胰島素耐量試驗，與正常組小鼠相比，模型組小鼠在ITT各時間點血糖均顯著顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，山柰酚組在30 min血糖顯著降低（P＜0.05）；AUC結果顯示山柰酚組顯著低于模型組（P＜0.01），說明山柰酚能夠明顯改善KKAy小鼠胰島素抵抗（表4）。

3.4 山柰酚對KKAy小鼠骨骼肌PI3K、AKT、GLUT4 mRNA表達的影響

與正常組小鼠相比，模型組小鼠骨骼肌PI3K、AKT、GLUT4 mRNA表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，山柰酚組小鼠骨骼肌PI3K、AKT、GLUT4 mRNA表達顯著升高（P＜0.01）；說明山柰酚對胰島素信號通路上關鍵分子PI3K、AKT、GLUT4的基因表達具有調節作用（表5）。

3.5 山柰酚對KKAy小鼠骼肌AKT、GLUT4蛋白表達量的影響

與正常組小鼠相比，模型組小鼠骨骼肌AKT、GLUT4蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，山柰酚組小鼠骨骼肌AKT、GLUT4蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；說明山柰酚調節胰島素信號通路上關鍵分子AKT、GLUT4蛋白表達（表6、圖1）。

4 討論

2型糖尿病受遺傳和環境因素共同決定，目前普遍認為胰島素抵抗（Insulin Resistance，IR）是其主要病因之一。骨骼肌作為糖代謝的主要外周組織，正常情況下胰島素與細胞表面胰島受體結合后激活受體底物，使其磷酸化，進而激活PI3K，激活后的PI3K可以催化4，5-二磷酸磷脂酰肌醇生成PIP3，其作為第二信使激活AKT，活化的PI3K和AKT觸發富含葡萄糖轉運蛋白4的囊泡向細胞表面轉位，與細胞膜融合，細胞表面GLUT4數量增多，增強葡萄糖的攝取能力。GLUT4一方面調節肌細胞對葡萄糖的攝取，另一方面通過抑制烯醇式丙酮酸羧激酶而抑制糖異生，最終增加葡萄糖利用和糖原合成[7]。當胰島素信號傳導通路的任一環節異常，骨骼肌對胰島素的敏感性降低，骨骼肌細胞不能正常攝取利用葡萄糖，造成糖耐量異常，從而導致血糖水平升高。因此，骨骼肌細胞中胰島素信號傳導通路在2型糖尿病發病中至關重要。

表4 山柰酚對KKAy小鼠ITT的影響/mmol·L-1(±s，n=6）

表4 山柰酚對KKAy小鼠ITT的影響/mmol·L-1(±s，n=6）

分組0 min 30 min 60 min 90 min 120 min AUC正常組8.32±0.44 3.26±0.511.74±0.69 2.20±0.67 2.66±0.80 380.70±45.93模型組26.32±3.91**20.76±3.86**16.14±3.20**16.16±2.93**16.22±3.26**2230.20±351.52**山柰酚組20.82±8.83 11.64±3.93#13.5±5.66 12.96±5.49 12.74±5.54 1646.60±620.13##

山柰酚是由中藥材中提取的黃酮類化合物，研究表明，山柰酚可降低癌癥、心血管等疾病的風險，并且具有明顯的降血糖作用[8]。有研究表明，山柰酚能夠降低糖尿病大鼠氧化應激水平，進而減少氧化應激產生的活性氧水平，達到保護胰島細胞和功能的作用，減少胰島β細胞凋亡，降低caspase-3酶活性，增加胰島素分泌，從而起到降低血糖的作用[9,10]，其作用途徑可能與PI3K-AKT信號通路相關[11]。此外，山柰酚能夠顯著降低STZ造模糖尿病大鼠體內炎癥反應水平[12,13]。糖尿病胰島素抵抗通常伴隨脂代謝紊亂，后者又能進一步加重胰島素抵抗，升高血糖，加重糖尿病并發癥的發生。山柰酚具有降低血脂，改善脂代謝紊亂的作用[14]。

動物實驗結果顯示，經過6周山柰酚治療，本實驗中自發性2型糖尿病動物KKAy小鼠小鼠體質量、空腹血糖、隨機血糖均明顯降低，ITT實驗結果顯示，山柰酚組胰島素敏感性顯著增加，說明山柰酚具有降糖、改善IR的作用；胰島素抵抗可以引起多種代謝紊亂，體質量增加，山柰酚具有降低體質量的作用。進一步檢測發現，山柰酚上調骨骼肌中PI3K、AKT、GLUT4基因表達，上調AKT、GLUT4蛋白表達，說明山柰酚降低血糖、改善胰島素抵抗的作用可能與其對骨骼肌PI3K-AKT-GLUT4信號通路有關。

表5 山柰酚對KKAy小鼠骨骼肌PI3K、AKT、GLUT4 mRNA表達的影響(±s，n=6)

表5 山柰酚對KKAy小鼠骨骼肌PI3K、AKT、GLUT4 mRNA表達的影響(±s，n=6)

分組PI3K相對表達量AKT相對表達量GLUT4相對表達量正常組1.03±0.26 1.02±0.23 1.01±0.15模型組0.16±0.05**0.51±0.08**0.27±0.02**山柰酚組0.48±0.07##0.79±0.19##0.59±0.12##

表6 山柰酚對KKAy小鼠骨骼肌AKT、GLUT4 蛋白表達的影響(±s，n=6)

表6 山柰酚對KKAy小鼠骨骼肌AKT、GLUT4 蛋白表達的影響(±s，n=6)

分組AKT/β-actin GLUT4/β-actin正常組1.12±0.14 1.07±0.21模型組0.34±0.08**0.47±0.16*山柰酚組0.86±0.12#0.79±0.12#

圖1 KKAY小鼠骨骼肌AKT、GLUT4 蛋白表達

綜上所述，山柰酚能夠通過調節PI3K-AKTGLUT4信號通路，增強骨骼肌糖代謝，改善糖尿病小鼠骨骼肌胰島素抵抗。

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3 張家瑞. 槲皮苷和山奈酚對糖尿病小鼠血糖及血脂水平的影響. 現代食品科技, 2013, 29(3): 459-462.

4 周瑤,杜標炎,譚宇蕙,等. 山奈酚對大鼠肝癌細胞CBRH7919的增殖抑制及誘導凋亡作用. 廣州中醫藥大學學報, 2010, 27(3):250-253.

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Effects of Kaempferol on the Skeletal Muscle of KKAy Mice via PI3K-AKT-GLUT4 Signaling

Zhang Zhuo1, Sun Wen2, Liu Tonghua3, Guo Xuan4, Hou Dan1, Xu Guangyuan4, Wu Lili2, Qin Lingling5, Hou Yi4, Zhang Lu4, Zhang Chengfei4
(1. College of Clinical Medical, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 100029, China;
2. Health-Cultivation Laboratory of the Ministry of Education, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029,China;
3. School of Graduates, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China;
4. Dongfang Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China;
5. Department of Science and Technology, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

This study aimed to investigate the effects of kaempferol on the skeletal muscle of KKAy mice via PI3K-AKT-GLUT4 signaling. Spontaneous type 2 diabetic KKAy mice were made up for the model group. After 6-week treatment of kaempferol by intragastric administration, key targets of PI3K-AKT-GLUT4 signaling were detected using biochemical and immunohistochemical technique, and western blot. It was found that the body weight, fast blood glucose and random blood glucose were decreased after kaempferol administration. ITT results show that blood glucose at 30 min after injecting insulin and the area under the curve drop were reduced in the kaempferol group, and so was the insulin resistance index in the kaempferol group. In addition, the mRNA expressions of PI3K, AKT and GLUT4 in the kaempferol group increased significantly, while the protein levels of AKT and GLUT4 were up-regulated by kaempferol administration. It was concluded that kaempferol can significantly regulate the blood glucose, body weight and insulin resistance in mice through activating the PI3KAKT-GLUT4 signaling.

Kaempferol, type 2 diabetes, PI3K-AKT-GLUT4 signaling

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

10.11842/wst.2016.07.009

R587.1

A

2016-07-01

修回日期：2016-07-12

＊ 北京市教育委員會高校重大成果轉化項目：糖調節受損保健食品產業化與社區與社區干預療效與安全性評價研究，負責人：劉銅華。

＊＊ 通訊作者：劉銅華，本刊編委，教授，博士生導師，主要研究方向：中醫藥防治糖尿病及其并發癥的臨床和基礎研究。