藏藥余甘子鞣質部位對大鼠肝微粒體代謝酶P450活性的影響＊

崔雅萍，楊光輝，亓 旗，吳玲芳，陳文靜，梁文儀，李 師，張蘭珍

（北京中醫藥大學中藥學院 北京 100102）

藏藥余甘子鞣質部位對大鼠肝微粒體代謝酶P450活性的影響＊

崔雅萍，楊光輝，亓 旗，吳玲芳，陳文靜，梁文儀，李 師，張蘭珍＊＊

（北京中醫藥大學中藥學院 北京 100102）

目的：考察藏藥余甘子鞣質部位對大鼠肝微粒體代謝酶P450活性的影響。方法：采用“Cocktail”探針底物與大鼠肝微粒體體外溫孵法，通過HPLC同時測定6種探針藥物氨苯砜、氫溴酸右美沙芬、香豆素、非那西丁、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲的代謝消除率，評價余甘子鞣質部位對P450酶中CYP3A4、CYP2D6、CYP2A6、CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9 亞酶活性的影響。結果：余甘子鞣質部位對P450酶影響較小，CYP3A4，CYP1A2的IC50值超過200 μg·mL-1，CYP2C9的IC50值超過500 μg·mL-1。結論：藏藥余甘子鞣質部位對肝P450酶活性影響較弱。

余甘子鞣質部位 大鼠肝微粒體 代謝酶P450 活性

余甘子（Phyllanthi Fructus）為大戟科植物余甘子Phyllanthus emblica L.的干燥成熟果實，系藏族習用藥材[1]。鞣質及酚酸類成分為其主要成分，具有抗脂質過氧化、抗腫瘤、抗癌、護肝益腎、抗病毒、抗菌等作用[2]。

藏藥主要以復方形式應用，也作為輔助藥物與西藥同時服用。藏藥成分間的相互作用以及藏藥-西藥藥物相互作用報道較少。抑制或誘導P450酶都可能產生相應的藥物-藥物相互作用，增加患者的治療風險。在臨床用藥過程中，藥物對P450酶抑制作用的危害遠大于誘導作用，尤其是與部分治療窗狹窄的藥合用會導致中毒[3]。CYP450各亞型活性的變化會導致由相關亞型代謝的藥物血漿濃度過高或過低，從而影響臨床治療效果[4-7]。

本實驗采用“Cocktail”探針藥物法，結合HPLC技術進行余甘子鞣質部位大鼠肝微粒體體外溫孵研究，評價其對P450酶活性的影響，為研究余甘子鞣質部位體內成分代謝提供實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 1525型高效液相色譜儀（PAD檢測器；Empower軟件）；氮吹儀（EYELA MG -2200）；水浴鍋（科偉HH-4）；渦旋混合器（北京北德科學器材有限公司）。

1.2 試藥

甲醇（美國Fisher公司，色譜純）；蒸餾水（哇哈哈純凈水）；氨苯砜（批號：142160）、氫溴酸右美沙芬（批號：KGC1-4EJ3）、香豆素（批號：1001833416）、非那西丁（批號：77440）、氯唑沙宗（批號：481850）、甲苯磺丁脲（批號：301955）、五味子醇甲（批號：110857-201111）、酮康唑（批號：973125）、奎尼丁（批號：216807）、反苯環丙胺（批號：834733）、α-萘黃酮（批號：1001977041）、二乙基二硫代甲酸鈉（批號：100183505）、氟康唑（批號：433638）等原料藥；NADPNa2（批號：11012231001）、六磷酸葡萄糖（批號：B6146）、六磷酸葡萄糖脫氫酶批號（1001293755）、MgCl2（批號：2105-100）均購于北京拜爾迪醫藥技術有限公司；SD大鼠肝微粒體為實驗室自制，蛋白含量為34.52 mg·mL-1。

余甘子藥材購自于西藏藏醫院，產地尼泊爾。經北京中醫藥大學閻玉凝教授鑒定為大戟科葉下珠屬植物余甘子Phyllanthus emblica L.的干燥成熟果實。

2 方法與結果

2.1 “Cocktail”探針藥物法的建立

2.1.1 溶液的配置

取氨苯砜、氫溴酸右美沙芬、香豆素、非那西丁、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲適量于10 mL容量瓶中，甲醇定容，配成各探針濃度分別為10 mmol·L-1、4 mmol·L-1、4 mmol·L-1、10 mmol·L-1、10 mmol·L-1、4 mmol·L-1的混合探針溶液，作為儲備液備用。五味子醇甲（內標物）：取4.01 mg，10 mL容量瓶中甲醇定容。

NADPH再生系統：含2 mmol·L-1NADPNa2，20 mmol·L-1六磷酸葡萄糖，2 u·mL-1六磷酸葡萄糖脫氫酶，20 mmol·L-1MgCl2。

2.1.2 肝微粒體體外溫孵反應

將混合探針儲備液適量稀釋200倍后，取100 μL于2 mLEP管中，氮氣吹干，加入Tris-HCL緩沖液溶解的肝微粒體（2 mg·mL-1）100 μL，于37 ℃水浴中預溫孵5 min，加入100 μL NADPH再生系統啟動反應，反應體系總體積為200 μL，包含SD大鼠肝微粒體蛋白1 mg·mL-1，NADPH 再生系統（1 mmol·L-1NADPNa2、10 mmol·L-1六磷酸葡萄糖、1 u·mL-1六磷酸葡萄糖脫氫酶、10 mmol·L-1MgCl2）以及6種混合探針底物：氨苯砜、氫溴酸右美沙芬、香豆素、非那西丁、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲（終濃度分別為: 25、10、10、25、25、10 μmol·mL-1），溫孵時間30 min。

2.1.3 樣品處理方法

溫孵30 min后在反應體系中按1:3比例加入冰甲醇結束反應，加入內標物（五味子醇甲0.4 mg·mL-1）50 μL，渦旋3 min，4 ℃，12 000 g·min-1離心20 min，取上清液，氮氣吹干，200 μL50%甲醇復溶，4 ℃，12 000 g·min-1離心20 min，20 μL進HPLC分析。

2.1.4 色譜條件

Diamonsil C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm），流速：1 mL·min-1，柱溫：35 ℃，流動相：甲醇-0. 2%冰醋酸溶液，梯度洗脫，進樣量：20 μL。

2.1.5 專屬性考察

按照2.1.4 HPLC-UV條件，測定空白肝微粒體、空白肝微粒體中加入探針底物和內標物。實驗結果如圖1。

實驗結果顯示，空白肝微粒體所含內源性物質不干擾探針藥物和內標物的測定，7個被測成分峰形良好，符合測定要求。

2.1.6 肝微粒體溫孵體系酶濃度和溫孵時間的確定

控制肝微粒溫孵時間，以探針藥物氨苯砜為底物，設置體系肝微粒體濃度分別為0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mg·mL-1考察肝微粒體濃度對代謝反應的影響。結果如表1和圖2所示。

控制肝酶濃度，以探針藥物氨苯砜為底物，設置溫孵時間分別為5、10、20、30、60、120 min考察溫孵時間對代謝反應的影響。結果如表2和圖3所示。分析實驗結果可得，反應體系中肝酶濃度達1 mg·mL-1、溫孵時間為30 min時，底物代謝趨于平緩，因而確定為實驗條件。

2.1.7 方法學驗證

（1）標準曲線的制備

采用倍半稀釋法，將探針藥物的儲備溶液配制成一系列梯度濃度的“Cocktail”探針混合溶液：氨苯砜（6.25、10.00、16.70、25.00、50.00、100.00 μmol·L-1）；氫溴酸右美沙芬（2.5、4.0、6.7、10.0、20.0、40.0 μmol·L-1）；香豆素（2.5、4.0、6.7、10.0、20.0、40.0 μmol·L-1）；非那西丁（6.25、10.00、16.70、25.00、50.00、100.00 μmol·L-1）；氯唑沙宗（6.25、10.00、16.70、25.00、50.00、100.00 μmol·L-1）；甲苯磺丁脲（2.5、4.0、6.7、10.0、20.0、40.0 μmol·L-1）。

取稀釋梯度濃度的混合探針，用滅活的肝微粒體按2.1.2項下溫孵方法進行溫孵實驗。分別繪制6種探針藥物標準曲線，結果見表4。

（2）精密度和穩定性實驗

分別取低、中、高3個濃度的混合探針藥物100 μL于EP管中，氮氣吹干，加入滅活肝酶200 μL溶解，按2.1.3項下方法處理樣品，配置探針藥物低、中、高三個濃度的基質混合對照品，每個樣本平行制備3份。同一樣品于同日內測定連續測定6次，計算日內精密度，連續3天內測定3次，計算日間精密度。將樣本放置24 h后測定，考察樣本在24 h內的穩定性。結果顯示6種探針藥物測定的日內精密度和日間精密度良好，RSD均小于6%，樣本24 h穩定性良好，RSD均小于5%，符合樣本含量測定的要求。

圖1 空白肝微粒體加混合探針和內標物HPLC色譜圖

表1 肝微粒體濃度對探針底物代謝消除率的影響/%

表2 肝微粒體溫孵時間對探針底物代謝消除率的影響/%

表3 肝微粒體中各探針藥物標準曲線方程式

圖2 混合探針代謝率變化圖

圖3 混合探針代謝率變化圖

（3）回收率實驗

按（2）項下方法制備混合探針藥物低、中、高3個濃度的基質混合對照品，平行3組，另取相應濃度的標準溶液直接進樣，計算絕對回收率。結果顯示6種探針藥物的絕對回收率均大于73.08%，且RSD均小于5%，符合樣本含量測定要求。

2.2 陽性抑制劑對大鼠肝微粒體代謝酶P450活性影響

2.2.1 陽性抑制劑對P450酶活性的抑制

選取添加陽性抑制劑與未加抑制劑的對照組進行比較，以探針底物的代謝率來反映酶的活性，每個陽性抑制劑系列濃度均為0.01/0.1/1/10/100 μmol·L-1，平行做3份。

2.2.2 酶活性（control activity）的計算

使用已建立的HPLC法測定6種探針底物的峰面積，將其與內標峰面積的比值代入各探針底物的肝微粒體標準曲線中計算出各探針底物濃度，以未加陽性抑制劑和受試中藥提取物的空白對照的活性為100%，計算各CYP450亞型在不同藥物作用下的相對酶活性。

2.2.3 抑制曲線及IC50值

采用Graphpad prism 5.0軟件進行非線性回歸分析，將酶相對活性對各抑制劑濃度的對數值作圖，并計算IC50值。結果如表4和圖4所示。實驗結果表明，選用的各抑制劑的IC50值均小于5 μM，抑制作用效果良好。

2.3 余甘子鞣質部位對肝微粒體代謝酶P450活性的影響

以余甘子鞣質部位替換2.2項下孵育體系中的陽性抑制劑。余甘子鞣質部位提取物的梯度終濃度為0.102、1.020、10.170、101.720、1 017.200 μg·mL-1。空白對照組和實驗組同時進行，分別計算相應的IC50值，結果如表5和圖5所示。實驗結果表明：余甘子鞣質部位對于肝微粒體代謝酶P450各亞型的IC50值均大于50 μg·mL-1，且對CYP3A4、CYP1A2的IC50值超過200 μg·mL-1，對CYP2C9的IC50值超過500 μg·mL-1。

表4 添加陽性抑制劑后各P450酶亞型的相對酶活性(n=3)

表5 余甘子鞣質部位對P450酶亞型的相對酶活性的影響(n=3)

圖4 陽性抑制劑抑制曲線(n=3)

3 討論

圖5 余甘子鞣質部位抑制曲線(n=3)

依照通用的CYP450酶抑制劑強度分級規則[8，9]：當某種中藥的提取物對P450酶亞型的半數抑制濃度IC50值小于10 μg·mL-1時，被認為有很強的抑制作用，在臨床使用過程中發生藥物相互作用的可能性較大，結果可能使其他由CYP450酶代謝的藥物療效減弱甚至失效；當IC50值介于10 μg·mL-1到50 μg·mL-1時，被認為有明顯的抑制作用；當IC50值介于100到200 μg·mL-1時，被認為有微弱的抑制作用；當IC50值大于200 μg·mL-1則認為抑制作用不明顯，臨床聯合用藥相對安全。

本實驗結果表明余甘子鞣質部位對于肝微粒體代謝酶P450各亞型抑制作用的IC50值均大于50 μg·mL-1，且對CYP3A4、CYP1A2的IC50值超過200 μg·mL-1，對CYP2C9的IC50值超過500 μg·mL-1，說明余甘子鞣質部位對于肝酶活性的抑制作用并不強烈，在臨床使用過程中發生藥物相互作用的可能性較小。余甘子鞣質部位對肝微粒體P450代謝酶6種主要亞型的抑制作用不明顯，不易產生相應的藥物-藥物相互作用。

1 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部).北京:中國醫藥科技出版社, 2015: 179.

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3 葉林虎,閆明珠,孔令提,等.槲皮素及其糖苷類化合物對P450酶活性的體外抑制作用.中國藥學雜志, 2014, 49(12): 1051-1055.

4 王歡歡,呂雅瑤,彭博,等.基于液相色譜-質譜聯用的肝微粒體中藥物代謝酶定量方法研究進展.色譜, 2015, 6: 553-557.

5 袁紅昌.穿心蓮內酯對大鼠肝微粒體CYP450酶活性的體內外影響研究.河南科技大學, 2015.

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7 Sevrioukova I F, Poulos T L. Understanding the mechanism of cytochrome P450 3A4: Recent advances and remaining problems. Dalton Trans 2013, 42(9): 3116-3126.

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Effects of Tannins Extracted from Phyllanthi Fructus on the Activity of Cytochrome P450 Enzymes in Rats

Cui Yaping ,Yang Guanghui, Qi Qi,Wu Lingfang, Chen Wenjing, Liang Wenyi, Li Shi, Zhang Lanzhen
(School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

This study aimed to investigate the effects of tannins extracted from Tibetan medicine Phyllanthi Fructus on cytochrome P450 enzyme of liver microsomes in rats. Cocktail probe substrates were incubated with liver microsomes in vitro. Metabolic elimination percentages of the six probe substrates, including dapsone, dextromethorphan hydrobromide, coumarin, phenacetin, chlorzoxazone and tolbutamide, were determined by HPLC. The effects of tannins extracted from Tibetan medicine Phyllanthi Fructus on the enzymatic activity of rat liver microsomal P450s was evaluated. It was found that tannins extracted from Phyllanthi Fructus did not impact P450 enzymes. The IC50values of CYP3A4 and CYP1A2 were over 200 μg·mL-1, while the IC50 value of CYP2C9 was superior to 500 μg·mL-1. In conclusion, Tannins extracted from Tibetan medicine Phyllanthi Fructus did not significantly affect cytochrome P450 enzymes.

Tannins extracted from Phyllanthi Fructus, rat liver microsomes, metabolic enzyme P450, activity

（責任編輯：姜月瀅，責任譯審：朱黎婷）

10.11842/wst.2016.07.013

R282

A

2016-06-19

修回日期：2016-06-19

＊ 國家自然科學基金委面上項目（81274187）：基于藏藥余甘子酚酸類成分體內動態變化的抗癌藥效物質與質量控制研究，負責人：張蘭珍。

＊＊ 通訊作者：張蘭珍，本刊編委，研究員，博士生導師，主要從事中藥和民族藥藥效物質研究。