額爾敦-烏日勒對MCAO/R大鼠腦前額葉皮質BDNF及NGF表達的影響＊

蓮 花，麻春杰，呼日樂巴根，李 超，田海廣，肖志彬

（1.內蒙古醫科大學蒙醫藥學院 呼和浩特 010110；2.內蒙古醫科大學中醫學院 呼和浩特 010110；3.內蒙古醫科大學圖書館 呼和浩特 010110）

額爾敦-烏日勒對MCAO/R大鼠腦前額葉皮質BDNF及NGF表達的影響＊

蓮 花1，麻春杰2＊＊，呼日樂巴根1，李 超2，田海廣2，肖志彬3

（1.內蒙古醫科大學蒙醫藥學院 呼和浩特 010110；2.內蒙古醫科大學中醫學院 呼和浩特 010110；3.內蒙古醫科大學圖書館 呼和浩特 010110）

目的：探討額爾敦-烏日勒對大腦中動脈阻塞/再灌注損傷（Middle Cerebral Artery Occlusion /Reperfusion，MCAO/R）大鼠皮質腦源性神經營養因子（Brain-Derived Neurotrophic Factor，BDNF）及神經生長因子（Nerve Growth Factor，NGF）的影響。方法：取清潔級健康SD大鼠60只，隨機分為假手術組、模型組、尼莫地平片組、額爾頓-烏日勒組，采用改良Zea-Longa法，制備MCAO/R模型。實驗結束后，各組大鼠麻醉、取腦，采用HE染色、SP等免疫組化方法評價腦組織病理形態學的改變情況，并且采用雙抗夾心ELISA 法和熒光定量RT-PCR法檢測大鼠腦前額葉皮質BDNF mRNA、NGF mRNA相對表達量及其蛋白含量。結果：與模型組相比，額爾敦-烏日勒組大鼠腦前額葉皮質壞死細胞數顯著減少（P＜0.05），BDNF、NGF蛋白含量及mRNA表達明顯增加（P＜0.05）。結論：額爾敦-烏日勒可上調MCAO/R大鼠腦前額葉皮質BDNF、NGF表達，促進星形膠質細胞活化，從而保護神經元，進而起到腦保護作用，這可能是額爾敦-烏日勒治療“白脈”病的傳統功效機制之一。

額爾敦-烏日勒 MCAO/R模型大鼠 腦源性神經營養因子 神經生長因子

缺血性腦卒中（Ischemic Cerebral Stroke，ICS）是卒中最常見的疾病類型。近年來研究證實，發病率呈現上升趨勢，致殘率、致死率大約為80%，是一種突然起病的腦部血液循環障礙性疾病，給患者家庭及社會都帶來巨大的精神與經濟壓力。目前以溶栓法治療恢復缺血腦細胞、組織血液灌流，可挽救瀕臨死亡的腦細胞，但血流再灌注在某些情況下會進一步導致細胞、組織損傷和功能障礙，造成腦缺血再灌注損傷（Cerebral Ischemia Reperfusion Injury，CIRI）。CIRI是由于血流再灌注后引起的繼發性損傷，是目前最受關注的問題之一。本課題組前期研究[1]發現：額爾敦-烏日勒能顯著改善缺血性腦損傷大鼠的神經行為學功能，并減輕腦水腫，減小缺血再灌注腦梗塞范圍，表明額爾敦-烏日勒對局灶性腦缺血再灌注損傷有較好的保護作用。本研究探討額爾敦-烏日勒對MCAO/R大鼠腦前額葉皮質BDNF及NGF表達的影響，闡明額爾敦-烏日勒發揮神經保護作用的可能機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級健康SD大鼠60只，雄性，約10周齡，體質量250-300 g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供許可證號：SCXK（軍）2012-0004。普通飼料由內蒙古醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 藥物與試劑

額爾敦-烏日勒（內蒙古蒙藥股份有限公司，批號：100336）蒸餾水溶解；銀杏葉片（涿州動樂制藥有限公司，批號：Z20028025）蒸餾水溶解；尼莫地平片（山西亞寶藥業集團股份有限公司，批號：H1402282）蒸餾水溶解；水合氯醛（天津市福晨化學試劑廠，批號：MB1699）；腦源性神經營養因子（BDNF）、神經生長因子（NGF）一抗、二抗試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司，型號：SP0022）；DAB顯色劑、枸櫞酸鹽H6.0及PBS緩沖液pH7.2-7.6（武漢博士德有限公司，型號分別為：AR1022、AR0024及AR0030）；ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；Trizol試劑盒（美國 invitrogen，貨號：15596026，批號：47303）；M-MLV反轉錄（日本Takara公司，貨號：D2639A，批號：CK3401A）；Oligd（T）（日本Takara公司，貨號：D511，批號：CT2901F）；dNTP（日本Takara公司，貨號：D4030RA，批號：CB3301A）；DNA Marker（日本Takara公司，貨號：D525S，批號：B501A）；SYBR mix（美國ABI，貨號：4472908，批號：1209004）；Agarose（美國Promega公司）；DEPC（美國Sigma公司）；100bp DNA Ladder（北京全式金生物技術有限公司）；Real-time PCR擴增試劑盒（北京中原領先科技有限公司）。

1.3 實驗儀器

栓線（北京沙東生物技術有限公司），CV-2000型高頻電凝刀（北京康威電子技術有限公司）；ASP200S型脫水機、EG1150H型包埋機（德國LEICA公司）；B1SERIES型生物顯微鏡（德國Motic廠家）；MR23i型臺式高速低溫離心機、FINESSE325型切片機（美國Thermo公司）；ABI7500型實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；Biophotometer型紫外分光光度儀、5417C型臺式高速常溫離心機、Reference型微量加樣器（德國eppendorf公司）；HB-202型恒溫金屬?。ū本┲形鬟h大有限公司）；SIM-F124型制冰機（日本SANYO電機公司）；GelDoc2000型凝膠成像系統、穩壓穩流電泳儀（美國伯樂Bio-rad公司）；BINTA2020D型全自動凝膠成像系統（北京賓達英創科技有限公司）。

2 方法

2.1 動物分組與處理

取清潔級健康SD大鼠60只，適應性飼養1周后，隨機分為假手術組（I組）、模型組（II組）、尼莫地平片組（III組）、額爾頓-烏日勒組（IV組），每組15只，采用改良Zea-Longa法，制備MCAO/R模型。假手術組與模型組分別灌胃蒸餾水，陽性對照組每日給予尼莫地平片0.62 mg·kg-1，治療組每日給予額爾敦-烏日勒6.2 mg·kg-1，連續給藥14 d。所有實驗大鼠均單籠飼養，限食量，每大鼠每日30 g，自由飲水。實驗結束后，每組隨機選取5只大鼠用10%水合氯醛麻醉，快速取腦，稱重，將與腦組織相連的硬腦膜剝離切斷延髓，棄去奧球、小腦和低位腦干后，將視交叉平面前后2-5 mm處冠狀切開大腦，留取中間部分置4 ℃ 4%多聚甲醛溶液中固定24 h，剃度酒精常規脫水，二甲苯透明，浸石蠟包埋，切片。HE染色切片3 μm厚，隔5取1貼于載玻片上，進行HE和SP染色，光鏡下觀察大鼠腦組織形態。每組剩余10只大鼠用10 %水合氯醛0.35 mL/100g麻醉，快速取腦，稱重，剝離硬腦膜，切斷延髓，棄去嗅球、小腦和低位腦干后，用冰生理鹽水沖凈腦組織表面的血液，在冰盤上快速剝離缺血側腦皮質，稱重，并將缺血側半球腦皮質分為兩部分，分別迅速精確稱量，用液氮迅速冷凍，然后轉移到-80 ℃冰箱中保存備用。

2.2 實驗指標

2.2.1 各組大鼠腦組織病理學

取各組鼠腦切片行常規HE染色。石蠟切片（3 μm）→常規脫蠟至水→去氧化層→上行逐級脫水→中性樹膠封片→光學顯微鏡觀察。

2.2.2 各組大鼠腦組織BDNF、NGF免疫組化染色

操作步驟：石蠟切片（3 μm）→常規脫蠟至水→0.01 mol·L-1PBS浸泡5 min→抗原修復→3 % H2O215 min→滴加A室溫15 min→傾去液體，吸去切片和組織周圍液體，勿洗→稀釋后的兔抗大鼠一抗（1:150）4 ℃ 1 h→0.01 mol·L-1PBS浸泡3×3 min→滴加B室溫孵育15 min→0.01 mol·L-1PBS浸泡3× 3 min→滴加C室溫孵育15 min→0.01 mol·L-1PBS浸泡3×3 min→DAB顯色→自來水沖3 min，終止顯色→蘇木素復染3 min→水洗3 min→鹽酸乙醇分化10 s →水洗3 min→1%伊紅染液浸染2 s→上行逐級脫水→中性樹膠封片→光學顯微鏡觀察。

細胞計數及統計：在相同的光亮強度，分別于10倍目鏡×4、20、40倍物鏡下，用圖像分析儀對免疫陽性細胞進行細胞計數。每只大鼠取6張腦片，每張大鼠腦缺血部位切片隨機取6個視野，求其算術平均值，結果±S表示，并用分組t檢驗法進行檢驗各組細胞數量差異。

2.2.3 腦前額葉皮質BDNF及NGF的含量

取凍存的腦前額葉皮質，保持2-8℃的溫度融化，加入一定量的PBS（pH7.4），手工法將組織充分勻漿化，3 000-4 000 r·min-1離心15 min左右，輕輕吸取上清液分裝后，按BDNF及NGF試劑盒說明書，采用雙抗夾心ELISA法檢測各組大鼠皮質BDNF及NGF的含量，其余冷凍備用。

2.2.4 腦前額葉皮質BDNF mRNA及NGF mRNA的表達

取凍存的腦前額葉皮質，放入預冷的研缽中加入液氮進行快速研磨，采用RNA提取試劑盒常規提取出總RNA，于-80 ℃保存。用核酸紫外分光光度計測定經稀釋的RNA提取物的OD值和濃度，判斷RNA純度，計算RNA濃度。采用25 μL反轉錄體系合成cDNA。反應條件：42 ℃反應60 min，70 ℃滅活 10 min。取反轉錄后產物cDNA作為模板進行PCR擴增。擴增以磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehydephosphate Dehydrogenase，GAPDH）基因mRNA作為內參照，引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。BDNF的上游引物序列為5'-CTGGATGAGGACCAGAAGGT-3’，下游引物序列為5'-CAGAAAGAGCAGAGGAGGCT-3’，擴增產物長度為117 bp；NGF的上游引物序列為5'-CACTCTGAGGTGCATAGCGT-3’，下游引物序列為5'-GCTTCAGGGACAGAGTCTCC-3’，擴增產物長度為125 bp；GAPDH的上游引物序列為5'-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3'，下游引物序列為5'-GAGCCAAGACACCTCAAACTC-3'，擴增產物長度為128 bp。Real-Time PCR反應體系為20 μL，含SYBR Premix Ex TaqTM （2×）10 μL，PCR Forward primer（10 pmoL·μL-1）0.5 μL，PCR Reverse primer（10 pmoL·μL-1）0.5 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 8.0 μL反應條件：94 ℃預變性2 min，然后45次循環，每次循環條件為94 ℃變性15 s，60 ℃退火，延伸60 s。每個樣本重復3次。利用RT-PCR 儀數據分析軟件（7500 System SDS Software）得出BDNF及NGF的CT值。

2.3 統計學方法

3 結果

3.1 大鼠腦組織形態學變化

假手術組腦前額葉皮質細胞層次清晰，排列緊密而有序，細胞結構、形態正常，神經細胞胞漿、核染色均勻，核仁清楚，核膜完整，間質內未見出血、壞死、水腫；模型組：左側大腦缺血范圍內可見皮質及紋狀體有片狀壞死，細胞排列松散，形態不規則，少量神經元殘存，神經細胞與細胞周圍間質分離，細胞深染固縮，胞漿尼氏體消失，胞核固縮，核仁消失。額爾敦-烏日勒組及陽性對照組大鼠腦組織病理改變減輕，有所減輕細胞水腫情況，但可見細胞變性、壞死，細胞排列較紊亂，胞核模糊或不可見。結果參見圖1。

3.2 大鼠腦前額葉皮質BDNF、NGF免疫組化染色

實驗結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠皮質BDNF、NGF陽性細胞數較多，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，尼莫地平片組大鼠皮質BDNF陽性細胞數明顯增多，額爾敦-烏日勒組大鼠皮質BDNF、NGF陽性細胞數明顯增多，差異具有統計學意義（P＜0.05），其作用與尼莫地平片組相當。結果見表1、圖2-圖4。

圖1 各組大鼠腦切片HE染色(×400倍)

表1 各組大鼠腦前額葉皮質BDNF、NGF陽性細胞數的比較(±s， n=10)

表1 各組大鼠腦前額葉皮質BDNF、NGF陽性細胞數的比較(±s， n=10)

注：與假手術組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

50.66±3.93 65.66±6.91組別劑量/mg·kg-1BDNF NGF I -II -58.50±5.85*71.50±4.08*III 0.62 66.33±5.64*#77.50±5.08*IV 6.20 75.16±4.35*#95.16±4.95*#

圖2 各組大鼠腦前額葉皮質BDNF、NGF陽性細胞數的比較

3.3 大鼠腦前額葉皮質BDNF、NGF的含量情況

采用雙抗夾心ELISA法檢測大鼠腦前額葉皮質BDNF、NGF含量的影響。實驗結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠皮質BDNF、NGF蛋白含量較高，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，尼莫地平片組與額爾敦-烏日勒組大鼠皮質BDNF、NGF蛋白含量明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結果見表2、圖5。

3.4 大鼠腦前額葉皮質BDNF mRNA、NGF mRNA的表達情況

采用RT-PCR法檢測大鼠腦前額葉皮質BDNF mRNA、NGF mRNA表達的影響，RT-PCR結果顯示，與假手術組相比，其他組大鼠腦前額葉皮質BDNF mRNA、NGF mRNA表達普遍增高（P＜0.05），額爾敦-烏日勒組的分別是假手術組的3.43、2.49倍，尼莫地平片組的是假手術組的1.44、1.42倍，模型組是假手術組的1.27、1.30倍，額爾敦-烏日勒組明顯高于模型組（P＜0.05）。結果見表3、圖6。

4 討論

圖3 各組大鼠腦前額葉皮質BDNF免疫組化染色(×400倍)

圖4 各組大鼠腦前額葉皮質NGF免疫組化染色(×400倍)

據文獻報道，局灶性缺血損傷后，BDNF、NGF表達都開始上調，在不同的過程參與調節神經再生。并明顯促進缺血后神經元的存活和生長發育并能夠防止他們受損死亡，改善神經元的病理狀態，促進受損神經元再生及分化成熟，在中樞神經系統（Central Nervous System，CNS）損傷修復中具有重要作用。但由于神經營養因子（Neurotrophic Factor，NTFS）多為大分子肽，難以通過血腦屏障，因此外周給藥難以達到作用部位。而腦內給藥又會加重缺血損傷，且操作復雜。所以，充分誘導內源性NTFs 的表達，可能是治療缺血神經元損傷的重要途徑。BDNF和NGF由神經元和神經元支配的靶器官或星形膠質細胞產生，具有多種生物活性。腦缺血后，腦神經細胞的損傷程度與BDNF和NGF的表達含量密切相關[3,4]。由靶區（海馬及皮質）產生的NGF 可經逆行運輸到中樞神經系統基底前腦膽堿能神經元胞體，發揮其靶源性營養作用。缺血再灌注損傷的輕重與BDNF mRNA 表達的含量有相關性，損傷過重反而抑制其表達。Lee等[5]發現缺血1周后可見年輕大鼠海馬CA 區和皮層內BDNF蛋白的免疫活性明顯增加，但mRNA 變化不明顯。這種蛋白含量和mRNA含量不一致的現象，出現在海馬的CA1 區和齒狀回之間。缺血再灌注過程可明顯提高大鼠海馬部位BDNF mRNA表達含量。小強度跑臺運動可在缺血再灌注作用的基礎上進一步提高海馬部位BDNF mRNA含量[6]。李娜等[7]發現缺血組隨著腦缺血再灌注時間的延長，在大腦梗死周邊區皮質中BDNF陽性神經元表達呈規律性變化，于腦缺血再灌注3 h表達開始增加，至24 h達高峰，之后開始下降，但直至7 d，其表達仍高于假手術組。成體大鼠短暫局灶性腦缺血后，BDNF和GDNF的表達都開始增加。Liu Xing-Long等[8]發現ADSCs（脂肪間充質干細）通過提升NTFs的表達，促進損傷后神經修復，而抑制神經細胞的凋亡。Srinivas Madduri等[9]發現在前3天，膠原蛋白神經導管釋放2%的NGF，在第14天顯著增強早期神經再生的軸突和施旺細胞遷移產物；與靶向器官有關的許多協同作用的NTFs具有增強早期軸突再生作用。Yang Ke-hong等[10]發現三七皂苷-Rg1可以上調大鼠大腦皮層BDNF mRNA表達，促進腦內BDNF蛋白。三七皂苷-Rg1可以治療腦缺血損傷。Hamed Fanaei等[11]發現在10天內，睪酮明顯增強腦缺血大鼠抗氧化，提高BDNF水平和和細胞增殖，并恢復感覺運動。Phatcharida Kaengkan等[12]發現齊拉西酮、齊拉西酮+NPCs（神經祖細胞）能誘導BDNF mRNA、NGF mRNA表達。齊拉西酮和NPCs聯合治療局灶性腦缺血具有增強缺血性腦損傷的神經保護作用。Zhang等[13]發現川陳皮苷可能通過激活BDNF活性，而保護大腦缺血性損傷。Gyeyeop等[14]發現先前跑步機鍛煉能加強運動能力和BDNF表達水平，并達到腦缺血損傷具有保護神經作用。前期適當強度的跑步機鍛煉對中風后期康復至關重要。Shih等[15]發現低強度的運動能增強腦缺血大鼠海馬BDNF表達水平，改善突觸可塑性。其本實驗結果表明，額爾敦-烏日勒可能通過上調BDNF、NGF蛋白含量及mRNA相對表達量，發揮其靶源性神經營養作用和保護作用，進而達到保護或修復受損神經元，抑制腦缺血損傷的作用。額爾敦-烏日勒可上調MCAO/R大鼠腦前額葉皮質BDNF、NG表達，促進星形膠質細胞活化，從而保護神經元，進而起到腦保護作用，這可能是額爾敦-烏日勒治療“白脈”病的傳統功效機制之一。

表2 各組大鼠腦前額葉皮質BDNF、NGF含量的影響(±s，n=10)

表2 各組大鼠腦前額葉皮質BDNF、NGF含量的影響(±s，n=10)

注：與假手術組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別BDNF/pg·mL-1NGF/pg·mL-1I 11.611 0±0.537 7 25.360 8±0.164 7 II 12.726 9±0.284 9*27.385 7±0.933 3*III 13.700 2±0.605 0*#28.740 9±1.144 5*#IV15.1196±0.9089*#40.1986±2.3363*#

圖5 各組大鼠腦前額葉皮質BDNF、NGF含量的影響

表3 各組大鼠腦前額葉皮質BDNF mRNA、NGF mRNA表達的影響(±s，n=10)

表3 各組大鼠腦前額葉皮質BDNF mRNA、NGF mRNA表達的影響(±s，n=10)

注：與假手術組相比，*P＜0.05；與模型組相比，#P＜0.05。

組別BDNF NGF I 0.812 1±0.115 0 0.712 0±0.101 3 II 1.035 3±0.131 3*0.925 6±0.142 0*III 1.168 5±0.153 0*1.008 4±0.033 9*IV 2.784 8±0.537 2*#1.773 1±0.169 7*#

圖6 各組大鼠腦前額葉皮質BDNF mRNA、NGF mRNA表達的影響

1 蓮花,那生桑,麻春杰,等.額爾敦-烏日勒對大腦中動脈阻塞再灌注損傷大鼠的治療作用研究.中國中醫急癥. 2014, 23(3): 394-396.

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13 Zhang L, Zhao H, Zhang X, et al. Nobiletin protects against cerebral ischemia via activating the p-Akt, p-CREB, BDNF and Bcl-2 pathway and ameliorating BBB permeability in rat. Brain Res Bull, 2013, 96(7) :45-53.

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Effects of Eerdun-Wurile on the Expressions of BDNF and NGF in the Prefrontal Cortex in Middle Cerebral Artery Occlusion / Reperfusion (MCAO / R) Injured Rats

Lian Hua1, Ma Chunjie2, Hu Relebagen1, Li Chao2, Tian Haiguang2, Xiao Zhibin3
(1. College of Mongolian Medicine, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, China;
2. College of Traditional Chinese Medicine, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, China;
3. Library of Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, China)

The present study aimed to explore the effects of Eerdun-Wurile on brain-derived neurotrophic factor(BDNF) and nerve growth factor (NGF) expressions in the prefrontal cortex of MCAO / R injury rats. Sixty SD male rats of SPF grade were selected to establish the model of MCAO / R with Zea-Longa thread occlusion, and divided into five groups at random: the sham operation group, the model group, the nimodipine group and the Eerdun-Wurile group. After modeling, rats were anesthetized for preparing the brains. The pathomorphological changes of the brains were evaluated by immunohistochemical techniques, such as HE staining and SP. The protein and mRNA expressions of BDNF and NGF in the prefrontal cortex of rats were detected by ELISA and RT-PCR, respectively. As a result, compared with the model group, it was found that the number of necrotic cells in the prefrontal cortex were significantly reduced in the Eerdun-Wurile group (P ＜ 0.05), while the mRNA and protein expressions of BDNF and NGF were significantly increased (P ＜ 0.05). In conclusion, the BDNF and NGF expressions in the prefrontal cortex were up-regulated for stimulating the activation of astrocytes and protecting the neurons with the treatment of Eerdun-Wurile in MCAO / R injured rats, which may be the mechanism of the treatment of Eerdun-Wurile for “white vein” disease.

Eerdun-Wurile, middle cerebral artery occlusion / reperfusion model, brain-derived neurotrophic factor, nerve growth factor

（責任編輯：姜月瀅，責任譯審：朱黎婷）

10.11842/wst.2016.07.022

R2-031

A

2015-12-23

修回日期：2016-02-03

＊ 國家自然科學基金委面上項目（81560700）：額爾敦-烏日勒預處理對心肌缺血再灌注損傷的作用及其復雜機制研究，負責人：麻春杰；內蒙古醫科大學博士啟動基金項目（2014YKDXBSJJ15）：額爾敦-烏日勒中揮發性成分的定性研究，負責人：蓮花；內蒙古醫科大學青年創新基金項目（YKDX2014QNCX018）：額爾敦-烏日勒血清藥物化學的初步研究，負責人：蓮花。

＊＊ 通訊作者：麻春杰，教授，博士，主要研究方向：中蒙醫藥防治心腦血管疾病的研究。