麥冬皂苷B體外調控非小細胞肺癌A549細胞miRNA-34b表達的研究＊

邱雯莉，姜澤群，陳海彬，周紅光

（南京中醫藥大學基礎醫學院 江蘇省中醫藥防治腫瘤協同創新中心 南京 210023）

麥冬皂苷B體外調控非小細胞肺癌A549細胞miRNA-34b表達的研究＊

邱雯莉，姜澤群，陳海彬，周紅光＊＊

（南京中醫藥大學基礎醫學院 江蘇省中醫藥防治腫瘤協同創新中心 南京 210023）

目的：本研究主要觀察不同方式處理后的非小細胞肺癌（NSCLC）A549細胞中miRNA-34b表達水平，探討miRNA-34b對MET信號 通路的調控機制，以及麥冬皂苷B（OPB）抑癌效應的分子機理，探尋治療NSCLC的新靶點。方法：采用非小細胞肺癌A549 細胞、胚肺成纖維細胞MRC-5、A549+OPB細胞、感染過表達慢病毒LV-hsa-mir-34b的A549細胞、以及感染陰性對照CON181B病毒的A549細胞作為研究對象，分別設為CON組、MRC-5組、CON+OPB組、Micro-up組、NC組。采用qRT-PCR方法檢測miR-34b在CON組、MRC-5組、A549+OPB組A549細胞中的表達情況。使用生物信息學軟件預測miRNA-34b可能的下游功能靶基因。使用qRT-PCR 的方法定量分析OPB對MET基因表達的影響，用Western blot檢測miRNA-34b和OPB對靶MET蛋白表達的影響。結果：與MRC-5組相比，A549細胞中miRNA-34b的表達明顯減少，加入OPB后miR-34b的表達增加。生物信息學預測顯示MET基因是miR-34b可能的關鍵下游靶基因。加入OPB后，MET基因水平和蛋白水平的表達均降低。結論：OPB可能通過上調A549細胞miRNA-34b表達，抑制下游靶基因MET進而發揮抗癌作用。

非小細胞肺癌 miRNA-34b MET基因 麥冬皂苷B

肺癌嚴重危害人類健康是目前世界上最常見的惡性腫瘤，在惡性腫瘤相關死亡原因中占第1位，造成極大的疾病負擔[1]。其中非小細胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC）是肺癌的主要病理類型，占所有肺癌病例的80.0%以上。隨著綜合治療模式以及分子生物化學的發展，NSCLC的治效有所提高，但預后仍不理想，5年總生存率不到20.0%。微小核糖核酸（miRNA）是一類廣泛存在的非編碼蛋白的小分子RNA，miRNA表達及調控失衡在惡性腫瘤的發生、發展中發揮重要作用[2]。近年來，隨著對miRNA研究的深入，越來越多的研究顯示miRNA在肺癌的發展過程中占有重要的地位[3]。其中miRNA-34b被證實與NSCLC的發生和發展密切相關。

“周氏克金巖方”為國醫大師周仲瑛教授臨床經驗總結的抗肺癌有效驗方,由軟堅散結、燥濕化痰、活血祛瘀、養陰益氣等4類功效藥物組成。經高通量篩選，得到對非小細胞肺癌（NSCLC）有細胞毒作用的單體靶點有20余種，包括麥冬皂苷、異甘草素、槲皮素、人參皂苷和聯芐類化合物等單體化合物。在這張抗肺癌方劑，麥冬皂苷B（OPB）[4]作為一味不可或缺的中藥組分，具有顯著的體外抗癌作用,但其相關機理有待進一步研究。本實驗通過檢測感染過表達慢病毒LV-hsa-miR-34b的A549細胞株以及加入了OPB的A549細胞株中miRNA-34b及MET基因的表達，來揭示OPB抗NSCLC的可能機制。

1 材料與方法

1.1.1 細胞

胚胎肺成纖維細胞MRC-5和人非小細胞肺癌細胞A549均購于中國科學院上海細胞庫。

1.1.2 分組

實驗細胞共分為CON組（A549細胞）、MRC-5組、CON+OPB組、Micro-up組（感染過表達慢病毒）、NC組（感染陰性對照病毒）。

1.1.3 主要試劑

1640、MEM、胎牛血清和鏈霉素（10 000 μg·mL-1）/青霉素（10 000 U·mL-1）（美國 Gibco公司，批號分別為：8115211、8114274、8172881、1491907）；Trizol （上海普飛公司，批號：3101-100）；oligo dT（上海化工，批號：B0205）；M-MLV、dNTPS、Rnase Inhibitor （promega 公司，批號分別為：M1705、U1240、N2115）；SYBR Master Mixture（TAKARA公司，批號：DRR041B）；hsa-miR-34b過表達慢病毒LV-hsa-miR-34b病毒（批號：17056-2）和陰性對照CON181B病毒以及Primer由上海吉凱基因有限公司合成；Lipofectamine 2000（Invitrogen公司，批號：11668）；兔抗人MET一抗（Abcam 公司，批號：ab193599），山羊抗兔 IgG 二抗（Santa公司，批號：B0513）；BCA Protein Assay（上海碧云天生物科技有限公司，批號：P0010S）；Polybrene 和 Enhanced Infection Solution （上海凱基基因，貨號：REVG0001、REVG0002）；麥冬皂苷B（南京澤朗醫藥科技有限公司，批號：ZL20110412B），配成 10 mmol·L-1貯液備用。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

MRC-5細胞用含有10%濃度的胎牛血清和1%濃度的青霉素/鏈霉素雙抗的MEM培養基，A549細胞用含有10%濃度的胎牛血清和1%濃度的青霉素/鏈霉素雙抗的1640培養基，均在37℃、5% CO2的培養箱內培養。

1.2.2 給藥

根據前期的實驗結果[5]，A549細胞密度達80.0%時，加麥冬皂苷B 10 μmol·mL-1，處理6 h后收樣。1.2.3 目的細胞A549慢病毒感染

將指數生長期的A549細胞用胰酶消化，用完全培養基配制成5×104個·mL-1的細胞懸液，6孔板每孔加入2 mL，繼續培養至感染時細胞鋪板量達20.0%，每孔更換為1 mL的無雙抗培養基。根據MOI值公式計算每孔加入的過表達hsa-miR-34b的慢病毒LV-hsa-miR-34b和空白陰性對照慢病毒LV-NC病毒量（109TU·mL-1）來感染A549細胞，感染時加入5 μg·mL-1的polybrene以增加感染率。感染12 h后更換為完全培養基培養細胞。觀察細胞狀況，根據其生長狀況更換培養基。感染96 h后，倒置熒光顯微鏡觀察熒光蛋白的表達情況，并攝像。

1.2.4 細胞總RNA的提取及純化

分別收集CON組細胞，CON+OPB組細胞，MRC-5細胞，Micro-up組細胞及NC組細胞2×106個，按照Trizol試劑盒上的說明方法提取總RNA。待RNA沉淀基本透明時，加入RNase-free水至完全溶解，NanoDropTM2000/2000C分光光度計分別測定所抽提RNA的濃度及質量。

1.2.5 實時熒光定量PCR

為了證實過表達慢病毒感染的情況，以及感染過表達病毒和加入OPB前后MET基因表達的變化，我們進行了qRT-PCR 驗證（以U6為內參）。qRTPCR反應條件為：95℃變性30 s；95℃退火5 s，60℃延伸30 s，30個循環。分析目的基因循環次數（Cycle Time，Ct值），通過2-△△Ct法計算目的基因差異表達倍數。所有實驗重復3次。

1.2.6 miRNA-34b的靶基因預測

通過生物學信息軟件對miRNA-34b的靶基因進行預測。研究常用的三大miRNA 靶基因預測軟件PicTar、Targetscan 和 Miranda同時對miRNA-34b的潛在靶基因進行預測。

1.2.7 Western blot 檢測MET蛋白的表達

將指數生長期的各組細胞用PBS洗滌兩次后用輕輕刮下細胞轉移入EP管中，用含有苯甲基磺酰氟（Phenylmethyl Sulfonylfluoride，PMSF）的RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，調整每個樣品濃度為2 μg·mL-1，每孔上樣20 μL，用SDSPAGE 膠進行電泳，然后將蛋白轉移到PVDF膜上，用含5%脫脂牛奶的TBST溶液封閉PVDF 1 h，加入一抗（1:500稀釋），4℃過夜，TBST洗4次，每次8 min，再加入含有辣根過氧化物標記的二抗（1:2 000 稀釋）孵育1.5 h，TBST洗4次，每次8 min。以1:40的比例混合A液和B液均勻滴加到硝酸纖維素膜上，曝光檢測。β-actin作為內參對照。所有實驗至少重復3次。

圖1 miRNA-34b的表達

圖2 各組細胞熒光視野下病毒感染結果（×100倍）

圖3 miR-34b的表達

1.2.8 統計學處理

采用SPSS 17.0 統計學軟件進行單因素方差分析，所有實驗數據采用平均數±標準差（x-±s）表示，組間兩樣本的均數比較采用成組 t 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miRNA-34b在MRC-5組、A549組、A549+ OPB組的表達

以U6為內參，MRC-5組為基準，校正計算各組2-△△Ct值。miRNA-34b在非小細胞肺癌中的表達明顯降低，加入抑制腫瘤的OPB后其含量升高，說明miRNA-34b具有明顯的抑癌作用，且OPB能升高A549細胞中miRNA-34b的含量（圖1）。

2.2 各組細胞感染結果

Micro-up組感染LV-hsa-mir-34b（17056-2）病毒，NC對照組感染陰性對照CON181病毒，病毒感染后96 h進行熒光拍照，放大100倍，各組細胞熒光拍照結果見圖2，可見病毒感染成功。

2.3 miRNA-34b潛在靶基因的預測

通過查閱相關文獻并利用生物學靶基因預測軟件分析，發現miRNA-34b預測的靶基因中包括MET，且提示MET可能是miRNA-34b的關鍵下游靶基因，這種基因已被證實在多種惡性腫瘤中發揮作用。

2.4 通過qRT-PCR驗證miR-34b的表達以及miR-34b和OP-B對MET基因表達的影響

為驗證A549細胞是否感染成功，以及OPB和miR-34b和MET基因的影響，感染96 h后通過qRT-PCR來測定miR-34b和MET基因的表達水平，以NC組為基準，計算各組細胞2-△△Ct。qRTPCR結果顯示，Micro-up組miR-34b的表達豐度是NC組的398.456倍（P=0.012），說明過表達慢病毒感染成功；轉染LV-hsa-miR-34b病毒和加入OPB后，都能使MET基因表達減少，說明miR-34b和OPB能抑制MET基因的表達，結果見圖3、圖4。

2.5 miR-34b以及OPB對MET蛋白表達的影響

過表達慢病毒LV-hsa-miR-34b感染96 h以后，以及加入OP-B6h以后，檢測A549細胞MET蛋白的表達水平。灰度分析結果顯示，轉染過表達慢病毒以及加入OP-B均使MET蛋白的表達量下調，與CON組相比P＜0.05，結果見圖5。

3 討論

microRNA（miRNA）是一類長度大約21-25 nt的內源性非編碼小分子RNA,它們由較長的初級轉錄前體（pri-miRNA）被剪切形成具有發卡結構初級miRNA（pre-miRNA）。pre-miRNAs 從細胞核轉運到細胞質中，并被Dicer酶切割為成熟的miRNA。miRNA主要通過與靶標基因3’非編碼區（3’-UTR）的完全或不完全互補配對，降解靶標基因mRNA或抑制其翻譯，從而參與調控細胞增殖、分化 凋亡、代謝，個體發育，腫瘤形成[6]。近年來隨著腫瘤研究的不斷深入，miRNA已經成為腫瘤研究領域的一個新靶點[7]。miRN的調控相當復雜，至今miRNA數據庫“miRBas”中已收錄近1 000種人類的miRNA，并且每一個miRNA都有很多潛在的作用靶點。據統計，microRNA調控了人體中近1/3的基因表達[8]。已發現的miRNA約50%在基因組上定位于與腫瘤發生相關的區域和脆性位點，miRNA在腫瘤的發生發展過程中起到調控的樞紐作用。miRNA-34家族包括miRNA-34a、miRNA-34b和miRNA-34，其中miRNA-34a有獨立的轉錄本，而miRNA-34b和miRNA-34c共用一個轉錄本[9]。由于miRNA-34b在肺部組織的特異性表達，且miRNA-34b影響腫瘤細胞的增殖、凋亡、轉移，在腫瘤發展過程中發揮抑制腫瘤的作用[10]，提示miRNA-34b對于肺癌研究的價值。因此，我們以非小細胞肺癌A549細胞與正常胚肺成纖維細胞中miRNA-34b的表達差異為切入點，研究其在非小細胞肺癌A549細胞中的作用及作用機制。

MET基因是原癌基因，其蛋白產物是肝細胞生長因子（Hepatocyte Growth Factor， HGF）的受體，具有酪氨酸激酶活性[11]。MET蛋白及其配體HGF的結合在多種惡性腫瘤如食管癌、肺癌、乳腺癌、肝癌等的發生、浸潤、轉移中發揮重要作用[12]。研究發現，幾乎所有的非小細胞肺癌中都有MET蛋白的表達，其中超過60%為過表達[13]。而通過生物學信息軟件預測發現MET基因可能為miRNA-34b下游調控靶基因，我們推測miRNA-34b可以通過調控MET基因的表達而發揮其抑癌作用[14]。miRNA-34b通過與MET mRNA的3’-UTR不完全互補配對結合而降解MET的mRNA，抑制其表達。本實驗發現感染了過表達慢病毒LV-hsa-miR-34b的非小細胞肺癌A549細胞中，MET基因的表達降低，說明miRNA-34b對MET基因的表達起抑制作用。

圖4 MET基因的表達

圖5 MET蛋白的表達

OPB是近年來發現的一種具有抑癌作用的單體。研究發現OPB對于多種NSCLC細胞株均具有明顯的抑制作用。通過抑制MMP-2和MMP-9，抑制 NSCLC細胞轉移和遷移；通過抑制PI3K/Akt通路，OPB能誘導NSCLC腫瘤細胞發生自噬；還可以通過抑制CyclinB1、CyclinA2、CDK2等基因的表達，誘導周期抑制蛋白P21和P27的表達而促進細胞周期阻滯[15]。在實驗中，我們發現加入OPB后A549細胞的miRNA-34b表達量升高，而MET基因和蛋白表達均降低；感染過表達慢病毒LV-hsa-miR-34b的A549細胞中MET基因和蛋白表達也降低。所以推測在非小細胞肺癌A549細胞中OPB的抑癌效應可能是通過調控miRNA-34b，從而調控MET通路來實現的。這一研究為明確miRNA-34b調控非小細胞肺癌的發生發展機制以及OPB的新藥研發提供了一種新的思路。

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A Research on miRNA-34b Expression Regulated by Ophiopogonin-B in Vitro in Non-Small Cell Lung Cancer A549 Cells

Qiu Wenli, Jiang Zequn, Chen Haibin, Zhou Hongguang
(School of Basic Medical Sciences, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China)

This study aimed to observe miRNA-34b expression through different treatments of non-small cell lung cancer (NSCLC), and investigate the regulatory effect of miR-34b on MET signaling pathway and the molecular mechanism of anti-tumor effect of ophiopogonin-B (OPB), and explore the new target for the treatment of NSCLC. Taking A549 cells, MRC-5 cells, A549 cells with OPB treatment, A549 cells infected with hsa-miR-34b-over-expressed lentivirus vector, and A549 cells infected with negative control CON181B virus as researchobjects, the CON group, the MRC-5 group, the CON+OPB group, the Micro-up group and the NC group were involved in the study. The expression of miR-34b in the A549 group, the MRC-5 group and the A549+OPB group were detected by qRT-PCR. Downstream targets of miR-34b were predicted by a bioinformatics software. Quantitative analysis was performed to quantify the expression of MET gene by qRT-PCR method with OPB administration. The effects of miR-34b and OPB on the expression of MET protein was tested by Western blot. Compared with the MRC-5 group, the expression of miR-34b in A549 cells was significantly decreased, but increased combining with OPB. TargetScan bioinformatics software showed that MET gene was prodicted to be the high-related downstream target gene of miR-34b. Within the administration of OPB, both genatic and protein levels of MET were decreased. In conclusion, OPB may present its anti-tumor effects through up-regulating miR-34b expression in A549 cells and supposing its downstream gene MET.

Lung cancer, miRNA-34b, MET gene, ophiopogonin-B

10.11842/wst.2016.04.011

R73-3

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

2016-03-07

修回日期：2016-03-25

＊ 國家自然科學基金委面上項目（81473608）：基于microRNA調控網絡的消癌解毒方抗腫瘤作用機制研究，負責人：周紅光； 國家自然科學基金委面上項目（81273717）：基于蛋白組學方法的“癌毒”病機研究，負責人：吳勉華；國家自然科學基金委青年科學基金項目（81503535）：基于mTOR信號通路調控缺氧微環境下細胞自噬的消癌解毒方抗腫瘤作用機制研究，負責人：李黎。

＊＊ 通訊作者：周紅光，醫學博士，副教授，副主任中醫師，主要研究方向：中西醫結合抗腫瘤研究。