膠體磨法包合紫蘇葉和荊芥混合揮發油的工藝研究＊

劉莉莉，張艷軍，劉 芳，李月婧，孟 瑾，吳 云，王振中＊＊

（1.南京中醫藥大學藥學院 南京 210000；2.中藥制藥過程新技術國家重點實驗室 連云港 222001；3.中藥提取精制新技術重點研究室 連云港 222001；4.江蘇康緣陽光藥業有限公司 南京 210000）

膠體磨法包合紫蘇葉和荊芥混合揮發油的工藝研究＊

劉莉莉1，2，3，張艷軍1，2，3，劉 芳4，李月婧4，孟 瑾1，2，3，吳 云1，2，3，王振中1，2，3＊＊

（1.南京中醫藥大學藥學院 南京 210000；2.中藥制藥過程新技術國家重點實驗室 連云港 222001；3.中藥提取精制新技術重點研究室 連云港 222001；4.江蘇康緣陽光藥業有限公司 南京 210000）

目的：優選膠體磨法制備紫蘇葉和荊芥混合揮發油-β-CD包合物的最佳工藝。方法：以包合物得率和揮發油包合率為綜合評價指標，采用單因素試驗結合Box-Behnken 響應面法，考察β-CD與水的比例、揮發油與β-CD的投料比和包合時間對包合工藝的影響；通過薄層色譜法初步驗證紫蘇葉和荊芥混合揮發油包合物是否形成。結果：確定紫蘇葉和荊芥揮發油包合的最佳工藝條件：紫蘇葉和荊芥混合揮發油與β-CD的比例為1:9，β-CD與水的比例為1:3，包合時間23min。結論：膠體磨法制備包合紫蘇葉和荊芥混合揮發油的工藝合理可行。

效應面法 揮發油包合率 膠體磨 Box-Behnken設計 紫蘇葉和荊芥混合揮發油

紫蘇葉為唇形科紫蘇屬紫蘇Perilla frutescens（L.）Britt.的干燥葉，為臨床常用中藥材，其中的揮發油具有抑菌、抗氧化性、抗過敏、鎮咳祛痰等功效[1]。荊芥為唇形科植物裂葉荊芥Schizonepeta tenuifolia Briq.的干燥地上部分，其總揮發油具有緩解支氣管平滑肌痙攣、抗過敏、鎮靜、祛痰、抗炎等作用[2]。由于揮發油具有易揮發、水溶性差和對胃腸道黏膜的刺激特性，為了降低其揮發性、增大水溶性、提高穩定性，多將其制備成β-CD包合物。有關紫蘇葉的包合工藝，文獻報道較多，但紫蘇葉荊芥混合揮發油的包合工藝研究未見報道。膠體磨法包合揮發油具有包合溫度低、時間短、包合率高、產量高、適合工業化生產等優點[3]。故本文采用膠體磨法，以包合率和包合物得率為評價指標，采用單因素試驗結合 Box-Behnken響應面法，對影響包合的主要因素進行考察，優選得到揮發油包合率高且包合物得率高的最佳包合工藝。

1 儀器與試藥

AWS（SA）型電子稱（上海英展機電企業有限公司）；TQ直筒式多能提取罐（溫州市森博輕工機械有限公司）；D2015W型攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表有限公司）；CT-C-I 型熱風循環烘箱（江陰市蘇新干燥設備有限公司）；PTHW 型調溫電熱套（上海耀裕儀器設備有限公司）；UV-2700型紫外可見分光光度計（日本島津公司）；J4W-L60 型多功能膠體磨（溫州昊星機械設備制造有限公司）；BX-53型數碼光學顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；β-環糊精（曲阜天利藥用輔料有限公司，批號：F1501021），其余試劑均為分析純。

本研究中的紫蘇葉樣品產地為安徽，經江蘇康緣藥業股份有限公司吳舟主管藥師鑒定為唇形科植物紫蘇的干燥葉；荊芥的產地為河北，經江蘇康緣藥業股份有限公司吳舟主管藥師鑒定為唇形科植物荊芥的干燥地上部分。

2 方法與結果

2.1 紫蘇葉和荊芥混合揮發油的制備

取紫蘇葉100 kg，荊芥100 kg投入多功能提取罐中，加入10倍量水，蒸汽加熱，回流提取4 h，得紫蘇葉和荊芥混合揮發油1 200 mL，置于4℃中貯存，備用。

2.2 包合物的制備方法和包合工藝評價指標的測定

按試驗設計，取實驗量純化水和β-CD，于1 000 rpm下攪拌10 min使其混勻，在攪拌下，緩慢滴加紫蘇葉和荊芥混合油，繼續攪拌5 min使其混勻后倒入膠體磨（功率：11 kW，乳化細度2-50 μm，）中進行擠壓包合一定時間后，放出包合物，40℃常壓干燥16 h，粉碎，稱重，得紫蘇葉和荊芥混合油-β-CD包合物。按下式計算包合物得率（%）。

取紫蘇葉和荊芥混合油-β-CD包合物，用適量無水乙醇淋洗包合物表面未包合揮發油，于常壓下干燥，稱重，得淋洗后包合物。取100 g淋洗后包合物置于圓底燒瓶中，加適量純化水，連接揮發油提取器，參照《中國藥典》2015年版一部附錄XD揮發油測定法進行揮發油測定。精密移取揮發油3 mL至揮發油提取裝置中，加300 mL的水提取5 h，平行試驗3次，讀取揮發油體積，計算揮發油空白回收率，結果見表1[4]。

2.3 單因素試驗設計和結果

2.3.1β-CD與水的比例對包合工藝的影響

按“2.2”項下包合物的制備方法，固定紫蘇葉和荊芥混合油與β-CD的比例為1:8，包合時間為30 min，考察β-CD與水的比例對包合物得率和包合率的影響。β-CD:水試驗水平設有1:2、1:3、1:4、1:5和1:6。投料量和試驗結果見表2。

由表2可知，隨著β-CD與水的比例的減小，包合物得率和包合率均呈先增后減的趨勢，但包合物得率的變化不明顯。當β-CD與水的比例為1:3時，包合物得率和包合率均高于其它4個水平。因此，選擇β-CD與水的比例在1:2～1:4之間進行響應面優化以確定最優的β-CD與水的比例。

2.3.2 紫蘇葉和荊芥混合油和β-CD比例對包合工藝的影響

按“2.2”項下包合物的制備方法，固定β-CD與水的比例為1:3，包合時間為30 min，考察β-CD與水的比例對包合物得率和包合率的影響。紫蘇葉和荊芥混合揮發油：β-CD試驗水平設有1:4、1:6、1:8、1:10和1:12[5]。投料量和試驗結果見表3。

由表3可知，紫蘇葉和荊芥混合揮發油與β-CD的投料比在1:4-1:8之間時，隨著β-CD投料量的增加，揮發油包合率增加；紫蘇葉和荊芥混合揮發油與β-CD的投料比為1:10時，揮發油包合率和包合物得率趨于平穩。因此，選擇紫蘇葉和荊芥混合揮發油與β-CD的投料比為1:6～1:10之間進行響應面優化，以確定紫蘇葉和荊芥混合揮發油與β-CD的最優比例。

2.3.3 包合時間對揮發油包合率的影響

按“2.2”項下包合物的制備方法，固定β-CD與水的比例為1:3，紫蘇葉和荊芥混合揮發油與β-CD的比例為1:8，考察包合時間對包合物得率和包合率的影響。包合時間的試驗水平設有10、20、30、40、和50 min。投料量和試驗結果見表4。

由表4可知，隨著包合時間的增加，包合物得率和包合率均呈現先增加后降低的趨勢；包合時間為30 min時，包合物得率和包合率均高于其它試驗水平。因此，選擇包合時間為20-40 min之間進行響應面優化以確定最優的包合時間。

表1 空白回收率結果

表2 β-CD與水的比例對包合工藝的影響（n=3）

表3 油/β-CD的投料比對包合工藝的影響（n=3）

表4 包合時間對包合工藝的影響（n=3）

2.4 響應面試驗設計方法（RSD）對工藝參數的優化

2.4.1 Plackett-Burman設計篩選主因素

在單因素試驗基礎上，利用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken設計對影響最大的3個因素3個水平（-1、1），即油和β-CD比例（1：6、1：8、1：10）、β-CD與水的比例（1：2、1：3、1：4）、包合時間（20、30、40 min）。Box-Behnken設計生成的17次試驗（5個零點），試驗結果以包合物得率和包合率為考察指標，試驗設計及結果見表5，各因素對考察指標影響的方差分析見表6[6-8]。

根據表中的實驗數據，利用Design-Expert 8.0.6軟件對表5的試驗結果進行二次多元回歸擬合，得包合物得率（R1）對β-CD:油/ g·mL-1（A）、水:β-CD/ mL·g-1（B）、包合時間（C）的二次多項回歸模型方程R1=+94.22+6.57A+0.32B-2.02C+2.20AB+1.42AC-0.13BC-9.75A2-3.26B2-1.17C2，相關系數R2=0.956 1；揮發油包合率（R2）對β-CD:油/ g·mL-1（A）、水：β-CD: / mL·g-1（B）、包合時間（C）的二次多項回歸模型方程R2=84.44+16.90A+0.47B-2.62C-0.62 AB-4.90AC+0.56BC-22.27A2-4.67B2-3.82C2，相關系數R2=0.991 5；這兩個模型的R2值分別為0.956 1、0.991 5，這說明通過二次回歸得到包合物得率和揮發油包合率與試驗擬合較好。同時，響應面二次回歸方程方差分析結果見表6，結果顯示包合物得率（R1）和揮發油包合率（R2）建立的回歸整體模型均達到顯著（P＜0.05），失擬項不顯著（P＞0.05），因此R1、R2模型成立。

2.4.2 影響因素的響應面曲線圖

2.4.2.1 影響包合物得率的主要因素分析

表6的結果顯示，包合物得率（R1）回歸方程的方差分析表明，A、A2項達到極顯著水平（P＜0.01），C、B2項達顯著水平（P＜0.05）。同時由F值大小可以推斷，在所選擇的試驗范圍內，3個因素對包合率影響的排序為β-CD:油比例（A）＞包合時間（B）＞水：β-CD比例（C）。

利用 Design-Expert 8.0.6 軟件，根據擬合模型繪制不同影響因素對包合物得率的三曲線圖，了解各因素的交互作用對包合物得率的影響。見圖1、圖2、圖3。

圖1顯示，包合物得率隨水:β-CD的比例增加先增加后緩慢減少，隨包合時間的增加無變化。圖2顯示，包合物得率隨β-CD:油的比例增加先增加后緩慢減少，隨包合時間的增加呈降低趨勢。圖3顯示，包合物得率隨水:β-CD的比例增加先增加后減少，隨β-CD:油的比例增加先增加后緩慢減少。

2.4.2.2 影響揮發油包合率的主要因素分析

表6的結果顯示，包合物得率（R2）回歸方程的方差分析表明，A、AC、B2、A2項達到極顯著水平（P＜0.01），C、C2項達顯著水平（P＜0.05）。同時由F值大小可以推斷，在所選擇的試驗范圍內，3個因素對包合率影響的排序為β-CD:油比例（A）＞包合時間（B）＞水與β-CD比例（C）。

表5 Box-Behnken試驗設計及結果

表6 Box-Behnken試驗設計方差分析表

圖1 包合時間和水:β-CD的比例對包合物得率的影響

圖2 包合時間和β-CD:油的比例對包合物得率的影響

圖3 水:β-CD比例和β-CD:油比例對包合物得率的影響

利用Design-Expert 8.0.6軟件，根據擬合模型繪制不同影響因素對揮發油包合率的三維曲線圖，了解各因素的交互作用對揮發油包合率的影響。見圖4、圖5、圖6。

圖4顯示，揮發油包合率隨水:β-CD的比例增加先增加后緩慢減少，隨包合時間的增加先增加后緩慢減少。圖5顯示，揮發油包合率隨β-CD:油的比例增加先快速增加后緩慢減少，隨包合時間的增加趨于平穩。圖6顯示，揮發油包合率隨β-CD:油的比例增加先迅速增加后緩慢減少，隨水:β-CD的比例增加先緩慢增加后趨于平穩。

2.5 包合物鑒別

2.5.1 顯微鑒別

將紫蘇葉和荊芥混合揮發油包合物、油與β-CD的混合物和β-CD分別置于顯微鏡下觀察，結果見圖7。由圖7可知，β-CD為板狀晶體，而包合物為無定形粉末，包合物已經形成。由于晶格排列發生變化，故在顯微鏡下含藥包合物與β-CD形狀不同。

2.5.2 薄層色譜鑒別

2.5.2.1 荊芥揮發油薄層鑒別

采用薄層色譜法（TLC）對荊芥揮發油包合前后的化學性質進行驗證。分別制備包合物的乙醇溶液樣品、β-CD的飽和乙醇溶液樣品、未洗滌的揮發油包合物以及荊芥揮發油的乙醇溶液對照品，吸取上述溶液各2 μL于硅膠G板上點樣，以氯仿-乙酸乙酯（9∶1）展開后，將薄層板放在通風處晾干，用香草醛-濃硫酸液顯色，結果荊芥揮發油在β-CD包合前后化學性質沒有發生變化，β-CD對包合物中揮發油的測定無干擾[9]。見圖8。

2.5.2.2 紫蘇葉揮發油薄層鑒別

采用薄層色譜法（TLC）對荊芥揮發油包合前后的化學性質進行驗證。分別制備包合物的乙醇溶液樣品、β-CD的飽和乙醇溶液樣品、未洗滌的揮發油包合物以及紫蘇葉揮發油的乙醇溶液對照品，吸取上述溶液各2 μL于硅膠G板上點樣，以環己烷-乙酸乙酯（9∶1）展開后，將薄層板放在通風處晾干，用5%香草醛-濃硫酸液顯色，在105℃加熱至斑點顯色清晰。結果荊芥揮發油在β-CD包合前后化學性質沒有發生變化，β-CD對包合物中揮發油的測定無干擾。見圖8。

2.5.3 紫外掃描法鑒別

分別將紫蘇葉和荊芥混合揮發油、β-CD和油的混合物、β-CD、包合物用無水乙醇溶解，過濾，取濾液在200-500 nm處進行紫外掃描，掃描結果見圖12。由圖9可知，揮發油、β-CD和油的混合物有紫外吸收，最大吸收波長為250 nm，而β-CD、包合物無紫外吸收，說明揮發油已經被β-CD包合。

2.6 驗證試驗

優選的紫蘇葉荊芥混合揮發油包合工藝應在較高的包合率的同時，還應有較高的包合物得率，同時還要考慮能耗等因素。對于多參數的優化過程應在相應的影響因素等高線圖（圖1-圖6底部平面圖）重合區域進行考察。在上述響應面模型分析的基礎上，利用 Design-Expert 8.0.5b 軟件對Y1和Y2兩個二次回歸方程求解，得最佳工藝條件為：水與β-CD的比例為3.17，β-CD與紫蘇葉荊芥混合揮發油的比例為8.61，包合時間為23.15 min，包合物得率可達95.94%，包合率達88.41%。

圖4 包合時間和水:β-CD的比例對揮發油包合率的影響

圖5 包合時間和β-CD:油比例對揮發油包合率的影響

圖6 水:β-CD比例和β-CD:油比例對揮發油包合率的影響

圖7 顯微影像圖（10×10）

圖8 薄層包譜圖

圖9 紫外掃描圖

為檢驗預測的結果，需對預測的最佳工藝條件進行驗證。為方便實際操作，將驗證條件修正為：紫蘇葉和荊芥混合揮發油與β-CD的比例為1:9， β-CD與水的比例為1:3，包合時間為23 min。

按此工藝條件進行紫蘇葉荊芥混合揮發油包合，平行操作3次，得到包合物得率依次為91.57%、91.23%、90.89%（均值為91.23%，相對標準偏差為0.30%），包合率依次為86.78%、87.07%和83.51%（均值為85.79%，相對標準偏差為1.88%），二者的實驗值與預測值比較，偏差為4.91%和2.97% [偏差[11]=（實測值-預測值）/預測值×100%]。試驗結果表明，預測值與實際值的偏差較小，試驗優化紫蘇葉和荊芥混合揮發油包合工藝的參數準確可靠，具有實際應用價值。

3 結論與討論

本試驗通過單因素分別考察了β-CD:油的比例、水與β-CD的比例、包合時間對包合物得率和揮發油包合率的影響，確定了影響包合物得率和揮發油包合率的主要因素，然后利用Design-Expert軟件的Box-Behnken設計法設計響應面試驗，建立了數學模型并通過方差分析，得出β-CD :油的比例、水與β-CD的比例及包合時間的交互作用都較強，同時表明影響包合物得率和揮發油包合率的因素主次關系為β-CD:油比例（A）＞包合時間（B）＞水與β-CD比例（C）。

響應面法是采用多元非線性擬合、二項式回歸分析，囊括試驗設計、建模、檢驗模型的合適性、尋求最佳組合條件等眾多試驗和統計技術，實驗精確度優于正交設計和均勻設計。本文在單因素試驗的基礎上，選用 Box-Behnken 響應面法優化了紫蘇葉和荊芥混合揮發油包合工藝，并得到了實際最佳工藝為：紫蘇葉和荊芥混合揮發油與β-CD的比例為1:9，β-CD與水的比例為1:3，包合時間23 min；在該條件下實際包合物得率為95.9%，揮發油包合率為88.4%，為工業化生產揮發油包合工藝提供了理論依據。

包合物制備完成后需對其進行鑒別研究，而薄層色譜法常用于鑒別包合物的形成，以有無薄層斑點，斑點數和Rf值與原揮發油是否相同來驗證包合物是否形成。本文通過薄層色譜法得到紫蘇荊芥包合物中提取的揮發油和原揮發油具有相同的色譜行為，而紫蘇荊芥油包合物（洗滌）無斑點，初步的驗證了紫蘇荊芥包合物已形成。

膠體磨法制備揮發油包合物一方面具有產品得率高、包合時間短，另一方面包合過程無需加熱、占用空間小、設備投入少，適合企業工業化大量生產。此外，包合時揮發油分散劑對包合工藝有一定的影響，揮發油直接包合效果不好，需用一些有機溶劑來稀釋。文獻[12]報道，用來稀釋揮發油的分散劑一般選用乙醇；分散劑種類和量的不同對紫蘇荊芥油包合工藝有無影響以及影響程度如何有待進一步研究。

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Optimizing the Inclusion Process of the Mixture Oil of Basil Leaves and Nepeta Using Colloid Mill Method

Liu Lili1,2,3, Zhang Yanjun1,2,3, Liu Fang4, Li Yuejing4, Meng Jin1,2,3, Wu Yun1,2,3, Wang Zhenzhong1,2,3
(1. Pharmacy College, Nanjing University of Chinese Medicine , Nanjing 210000, China;
2. State Key Laboratory of New-Tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China;
3. The Key Laboratory for the New Technique Research of TCM Extraction and Purification, Lianyungang 222001, China;
4. Jiangsu Kanion Sunshine Pharmaceutical Co. Ltd., Nanjing 210000, China)

This study aimed to optimize the inclusion process of basil leaves and nepeta by the response surface method to prepare the β-cyclodextrin (β-CD) complexes. Volatile oil-β-CD recovery ratio and volatile oil inclusion rate were involved in the evaluation indexes. The single factor test and Box-Behnken response surface method were applied to test the proportion of β-CD and pure water and materials input ratio of the volatile oil and β-CD, and observe the influence of the inclusion time on the inclusion process of volatile oil. Whether the mixture volatile oil inclusion of basil leaves and nepeta was synthesized needed to be proved primarily through thin layer chromatography method. As a result, the optimum essential oils inclusion process was figured out. The mixture ratio of the volatile oil of basil leaves and nepeta and β-CD was 1:9 (mL:g), and the ratio of β-CD and pure water was 1:3 (g:mL), and the inclusion time was 23 min. In conclusion, it was feasible to prepare mixture volatile oil inclusion complexes with basil leaves and negeta by the colloid mill method.

Response surface method, inclusion ratio of essential oils, colloid mill, Box-Behnken design, the mixture oil of basil leaves and nepeta

10.11842/wst.2016.04.013

R283

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

2015-11-24

修回日期：2016-02-15

＊ 科學技術部“重大新藥創制”科技重大專項（2013ZX09402203）：現代中藥創新集群與數字制藥技術平臺，負責人：王振中。

＊＊ 通訊作者：王振中，博士，碩士生導師，主要研究方向：中藥新藥的研究與開發。