多指標正交試驗法優選小續命湯水提工藝＊

王仁杰，周恩麗，李 淼，秦建平，吳 云，孫永成，杜冠華，蕭 偉＊＊

（1. 江蘇康緣藥業股份有限公司 連云港 222001；2. 中藥制藥過程新技術國家重點實驗室連云港 222001；3. 中國醫學科學院藥物研究所 北京 100050）

多指標正交試驗法優選小續命湯水提工藝＊

王仁杰1,2，周恩麗1,2，李 淼1,2，秦建平1,2，吳 云1,2，孫永成1,2，杜冠華3，蕭 偉1,2＊＊

（1. 江蘇康緣藥業股份有限公司 連云港 222001；2. 中藥制藥過程新技術國家重點實驗室連云港 222001；3. 中國醫學科學院藥物研究所 北京 100050）

目的：優選小續命湯的水提工藝。方法：以升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、苦杏仁苷的提取率以及水提物的浸膏得率為綜合評價指標，選取加水量、提取時間、提取次數為考察因素，采用正交試驗法優選小續命湯的水提工藝。結果：最佳回流提取工藝為10倍量水，回流提取3次，每次1.5 h。結論：該優選工藝客觀可行、合理穩定，可為小續命湯的產業化研究提供實驗依據。

多指標成分 升麻素苷 5-O-甲基維斯阿米醇苷 苦杏仁苷 綜合評價 小續命湯 熵權法

“小續命湯”始載于《備急千金要方》（唐·孫思邈），該方具有“溫經通陽，扶正驅風”的功能，主治“正氣虛弱，風寒初中經絡所致半身不遂，口眼歪斜，語音失利，筋脈拘急，頭痛頸強等”，主要用于治療中風及中風后遺癥，具有顯著的臨床療效，且應用廣泛。本公司在該古方的現代研究[1-7]基礎之上開發了一款新型口服制劑產品，用于腦中風恢復期治療。該方由麻黃、桂枝、防風、苦杏仁、人參、白芍、防己等12味中藥組成，處方中麻黃、桂枝、防風、苦杏仁所含有效成分主要是升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、苦杏仁苷以及麻黃堿等成分，易溶于水[8-10]。通過前期藥效篩選試驗，確定了這4味藥的水提工藝。為了最大限度地提取出以上有效成分，充分發揮其功效，本試驗考慮采用水煎煮回流提取小續命湯的水溶性成分，選取升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷和苦杏仁苷的提取率以及浸膏得率為綜合評分指標，采用正交試驗法多指標優選小續命湯的水提工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

U3000型液相色譜儀（美國戴安公司）；RE-300型旋轉蒸發儀（上海亞榮）；JK-250DB型數控超聲波清洗器（合肥金尼克機械制造有限公司）；DZTW型調溫電熱套（北京市永光明醫療儀器廠）；Sartorius BP 211D電子分析天平（德國Sartorius公司）；超純水機（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

麻黃（產地吉林通榆）、苦杏仁（產地甘肅靈臺）、桂枝（產地廣西平南）、防風（產地黑龍江杜爾百特）分別經連云港康緣大藥房執業藥師吳舟鑒定為麻黃科植物草麻黃Ephedra sinica Stapf.的干燥草質莖、薔薇科植物杏Prunus armeniaca L.的干燥成熟種子、樟科植物肉桂Cinnamomum cassia Presl.的干燥嫩枝、傘形科植物防風Saposhnikovia divaricata（Turcz.） Schischk.的干燥根；升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111522-201008、111523-201007）；苦杏仁苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110820-201004）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 指標成分測定

2.1.1 升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的測定方法

色譜條件：Phenomenex C18鍵合硅膠柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；檢測波長254 nm；進樣量：10 μL；流動相為乙腈（A）-水（B），0-20 min，A：13%→30%；流速：1.0 mL·min-1。

對照品溶液的制備：分別精密稱取升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品適量，用50%甲醇溶解制成質量濃度分別為47.05 μg·mL-1、52.05 μg·mL-1的對照品混合溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過，冷藏備用。

供試品溶液的制備：精密量取待測提取液10 mL至中性氧化鋁柱，用50%乙醇洗脫，收集洗脫液，水浴揮干，殘渣用50%甲醇溶解，轉移至10 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶液稀釋至刻度搖勻，0.22 μm微孔濾膜（有機膜）濾過，取續濾液作為供試品溶液。

線性范圍的考察：精密量取升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品混合溶液2、4、8、12、16、20 mL，按擬定色譜條件進樣檢測，記錄色譜峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標，以對照品進樣量（X）為橫坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程。升麻素苷：Y=1 254.245 2 X-3.542 9（R2=0.999 9），5-O-甲基維斯阿米醇苷：Y= 1 815.057 9 X-14.172 5（R2=0.999 9），表明升麻素苷在0.094 1-0.941 0 mg范圍內與峰面積呈良好線性關系，5-O-甲基維斯阿米醇苷在0.104 1-1.041 mg范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.1.2 苦杏仁苷的測定方法

色譜條件：Phenomenex C18鍵合硅膠柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；檢測波長210 nm；進樣量：10 μL；流動相：甲醇-1%磷酸水溶液（21:79）；流速1.0 mL·min-1。

對照品溶液的制備：精密稱取芍藥苷對照品適量，用50%甲醇溶解制成質量濃度為160.60 μg·mL-1的對照品溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過，冷藏備用。

供試品溶液的制備：精密量取待測提取液10 mL至中性氧化鋁柱，用50%乙醇洗脫，收集洗脫液，水浴揮干，殘渣用50%甲醇溶解，轉移至10 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶液稀釋至刻度搖勻，0.22 μm微孔濾膜（有機膜）濾過，取續濾液作為供試品溶液。

線性范圍的考察：精密吸取芍藥苷對照品溶液1，3，5，10，15，20 mL，按擬定色譜條件進樣檢測，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標，以對照品進樣量（mg）為橫坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程：Y= 980.39 X + 1.50（R2=0.999 8），表明苦杏仁苷在0.160 6-3.212 mg范圍內與峰面積呈良好線性關系。

2.1.3 方法學考察

（1）精密度考察

精密量取升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷混合對照品溶液、苦杏仁苷對照品溶液，分別按照各自色譜條件連續進樣6次，每次進樣10 μL，測定峰面積，結果升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、苦杏仁苷的RSD分別為0.35%、0.65%、0.96%，表明儀器精密度較高。

（2）穩定性試驗

取同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、12、24 h注入液相色譜儀，記錄各自的峰面積值。結果升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、苦杏仁苷的RSD分別為1.4%、1.6%、1.4%，表明在24 h內供試品溶液穩定性良好。

（3）重復性試驗

精密量取待測提取液10 mL，平行量取6份，按擬定供試品溶液制備方法制備供試品溶液12份，每份精密吸取10 μL，分別按擬定的色譜條件進行測定。結果升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、苦杏仁苷的RSD分別為0.72%、0.45%、0.56%，表明方法重復性良好。

（4）加樣回收試驗

精密量取已知含量的提取液6份，每份5 mL，分別精密加入升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷混合對照品溶液、苦杏仁苷對照品溶液1.0 mL，按2.1.1和2.1.2項下方法制備供試品溶液，按各自項下擬定色譜條件進行測定，計算升麻素苷的平均回收率99.24%，RSD 0.68%, 5-O-甲基維斯阿米醇苷的平均回收率99.43%，RSD 0.87%，苦杏仁苷的平均回收率99.25%，RSD 0.76%，表明本法回收率良好。

2.1.4 浸膏得率測定

精密量取待測樣品V1（mL），置于已恒重蒸發皿中（M1），在105℃烘箱內干燥至恒重，取出置于干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱重（M2），計算浸膏得率。公式如下：

m為待測樣品中藥材總質量，V2為待測樣品總體積

2.2 基于信息熵理論的小續命湯水提工藝評價2.2.1 小續命湯水提工藝正交試驗

在相關文獻[11-16]基礎上結合預實驗，選取加水量（A）、提取時間（B）、提取次數（C）為考察因素，稱取麻黃30 g、苦杏仁90 g、桂枝30 g、防風60 g為1份，共9份，以升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、苦杏仁苷提取率以及浸膏得率為綜合評價指標，按L9（34）正交表進行煎煮提取。試驗設計及結果見表1。

2.2.2 小續命湯水提工藝研究數據的處理

根據文獻[17-19]所給出的步驟，建立原始評價指標矩陣，原始評價矩陣如下：

計算Pij，將原始評價矩陣轉換為“概率”矩陣。

計算各項指標的信息熵，得到評價指標的信息熵。

計算第i項指標的權系數。

對于1個m行n列的概率矩陣，綜合評價指標Mm＝P1m×W1＋P2m×W2＋P3m×W3＋…＋Pnm×Wn。

將概率矩陣的數據進行加權處理，得到綜合評價指標M，再進行方差分析，以確定最優實驗方案。正交試驗結果見表1，方差分析見表2。

由極差分析結果可知，各因素對綜合指標的影響主次順序為C＞B＞A，即提取次數＞提取時間＞加水量。方差分析結果表明，B、C兩個因素有顯著性差異，A因素無顯著性差異。最終確定最佳提取工藝為A2B3C3，即加10倍量水，提取3次，每次1.5 h。

表1 L9（34） 正交試驗設計與結果

表2 方差分析

表3 驗證試驗結果

2.3 驗證試驗

為確證該工藝的優劣和穩定性，按最佳條件提取麻黃、苦杏仁、桂枝、防風3批進行驗證，測定各指標成分提取率，計算綜合評分，結果見表3，RSD為0.62%。結果表明優化后的小續命湯水提工藝穩定可行。

3 討論

依據熱力學中熵的概念，把信息集的平均信息量稱為信息熵[20]。在信息論中，信息熵是系統不確定性和無序性的度量。該理論用于多指標綜合評價時，相當于將每個評價指標作為1個隨機變量，通過計算各指標的信息熵，從而給出各個指標的不同權重。對于一項評價指標，其取值變異程度越大，指標越有序，信息熵就越小，其提供的信息量越多，該指標就越重要，所占權重系數相應地就越大[18]。信息熵理論在多屬性決策問題中的應用屬于客觀賦權法的一種，經過對實驗數據的整理、計算和分析，得到的權重系數，可靠性更高。

本研究選取小續命湯水提組藥材中的已知有效成分：升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、苦杏仁苷的提取率，加上水提物浸膏得率作為多指標進行綜合評價，可較為全面地評判所篩選工藝的優劣。

在數據處理時，采用信息熵權重分析法對各指標進行客觀賦權。與主觀賦權法相比[21-23]，權重數據完全來自于對實驗數據的數理分析，清晰地反映了指標成分在不同提取條件下變化的客觀規律。分析結果更為科學、客觀，所優選的工藝合理、穩定、可行，可為小續命湯的產業化研究提供實驗依據。

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Optimum Water Extraction Method for Xiaoxuming Decoction via Multi-Target Orthogonal Design

Wang Renjie1,2, Zhou Enli1,2, Li Miao1,2, Qin Jianping1,2, Wu Yun1,2, Sun Yongcheng1,2, Du Guanhua3, Xiao Wei1,2
(1. Jiangsu Kanion Parmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China;
2. State Key Laboratory of New-Tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Lianyungang 222001, China;
3. Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100050, China)

This study aimed to optimize the water extraction method for Xiaoxuming decoction through multitarget orthogonal experiment. The comprehensive evaluation indexes included the extraction percentages of prem-O-glucosylcimifugin, 4’-O-beta-glucopyranosyl-5-O-methylvisamminol and amygdalin from water. The volume of water, extraction duration, and extraction frequency were crucial indexes for orthogonal design. It was found that optimum extraction parameters included three times of refluxing extraction with ten folds water, and 1.5 h for each time. In conclusion, this optimum extraction process was stable, practical and reasonable in the area of industrial production, and laid a fundamental for the water extraction method exploration of Xiaoxuming decoction.

Multi-target components, prem-O-glucosylcimifugin, 4’-O-beta-glucopyranosyl-5-O-methylvisamminol, amygdalin, comprehensive evaluation, Xiaoxuming decoction, entropy method

10.11842/wst.2016.04.017

R283.6

A

（責任編輯：馬雅靜，責任譯審：朱黎婷）

2015-01-31

修回日期：2015-03-16

＊ 科學技術部“重大新藥創制”科技重大專項（2013ZX09402203）：現代中藥創新集群與數字制藥技術平臺，負責人：王振中。

＊＊ 通訊作者：蕭偉，本刊編委，博士，研究員級高級工程師，主要研究方向：中藥制劑和創新中藥的研究與開發。