高架〇迷宮實驗:昆明小鼠狀態焦慮動物模型的重測信度研究

孫世光

( 1．山東中醫藥大學第二附屬醫院藥學部，山東濟南　250001;2.山東省中西醫結合醫院藥學部，山東濟南　250001; 3．山東中醫藥大學藥學院，山東濟南　250355)

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高架〇迷宮實驗:昆明小鼠狀態焦慮動物模型的重測信度研究

孫世光1，2，3

( 1．山東中醫藥大學第二附屬醫院藥學部，山東濟南250001;2.山東省中西醫結合醫院藥學部，山東濟南250001; 3．山東中醫藥大學藥學院，山東濟南250355)

中國圖書分類號: R-332; R363-332; R749．72

摘要:目的探討高架〇迷宮實驗( elevated zero maze，EZM)作為昆明小鼠狀態焦慮動物模型的重測信度。方法昆明小鼠( 4周齡，♂/♀)進行EZM實驗，實驗間隔1周進行2次，采用攝像系統記錄5 min行為變化，包括兩臂區進入時間及進入次數;納入實驗參數有:開臂區進入時間百分率( Otime%)、開臂區進入時間( Otime)、閉臂區進入時間( Ctime)、開臂區進入次數百分率( Oentries%)、開臂區進入次數( Oentries)、閉臂區進入次數( Centries)及兩臂區進入總次數( Entries) ;通過組內相關系數( intraclass correlation coefficient，ICC)和kappa一致性系數( kappa agreement index，κ) 對EZM進行重測信度檢驗，并分析性別、重復測量等因素對EZM行為模式的影響。結果ICC結果顯示，Otime% (♂ICC =0．753，P＜0．01;♂+♀ICC =0. 535，P＜0. 05)、Otime(♂ICC = 0. 753，P＜0. 01;♂+♀ICC = 0. 535，P＜0. 05)、Ctime(♂ICC = 0. 753，P＜0. 01;♂+♀ICC = 0. 535，P＜0. 05)、Oentries(♂ICC = 0. 719，P＜0. 01;♀ICC = 0. 494，P ＜0. 05;♂+♀ICC = 0. 583，P＜0. 01)、Centries(♀ICC = 0. 658，P＜0. 01;♀ICC = 0. 508，P＜0. 05;♂+♀ICC = 0. 562，P＜0. 01)、Entries(♂ICC =0. 691，P＜0. 01;♀ICC = 0. 502，P＜0. 05;♂+♀ICC = 0. 574，P＜0. 01)初測重測信度相對較好，且有統計學意義;κ結果顯示，Otime% (♂κ= 0. 393，P＜0. 05)、Ctime(♂κ= 0. 393，P＜0. 05)、Oentries(♂κ= 0. 308，P＜0. 05;♂+♀κ= 0. 256，P＜0. 05)、Centries(♂κ= 0. 427，P＜0. 01;♂+♀κ= 0. 238，P＜0. 05)、Entries(♂κ=0. 469，P＜0. 01)有統計學意義，但初測重測信度相對較差。結論Otime%、Entries作為EZM評價狀態焦慮動物模型的穩定參數，具有尚可接受的重測信度;尤其應注意♂/♀(強烈推薦♂)對EZM重測信度影響效應相對較大，而重復測量影響效應相對較小。

關鍵詞:高架〇迷宮;狀態焦慮;動物模型;重測信度;性別;重復測量;昆明小鼠

高架〇迷宮實驗( elevated zero maze，EZM)是評價狀態焦慮動物模型的經典方法之一，廣泛應用于精神神經藥理學基礎研究; EZM源于高架十字迷宮實驗( elevated plus maze，EPM)，兩者原理都是基于實驗動物探索習性與危險環境之間的矛盾沖突。EZM作為焦慮動物模型進行藥理學評價時，常受實驗環境、實驗操作及實驗動物種屬、品系、性別等諸多因素影響而導致結果不盡一致［1－3］;本研究采用組內相關系數( intraclass correlation coefficient，ICC)和kappa一致性系數( kappa agreement index，κ)［4］，初步探討EZM作為昆明小鼠狀態焦慮動物模型的重測信度，篩選出穩定參數，并進行行為模式分析。

1　材料與方法

1．1實驗動物昆明小鼠，♂/♀，由山東大學實驗動物中心提供，許可證號SYXK(魯) 20130001;室溫( 20±2)℃，光照12 h( 18: 00～6: 00)和黑暗12 h( 6: 00～18: 00)環境，自由進水飲食飼養;預適應環境1周后，選取體質量( 20±2) g小鼠進入正式實驗(所有實驗均于6: 00～18: 00進行)。

1．2實驗裝置木質〇迷宮( 65 cm×5 cm)，包括2部分:兩相對開臂區( 30 cm×5 cm)，兩相對閉臂區，附有立墻( 30 cm×5 cm×30 cm) ;〇迷宮離地面50 cm，實驗由25 W紅燈泡離圓心40 cm高處照明［5］。

1．3實驗操作操作者將小鼠放入高架〇迷宮任一開臂區中間，頭面對圓心，用攝像系統記錄動物5 min的行為變化，包括兩臂區進入時間及進入次數;其中，小鼠4只爪子由一臂區均進入另一臂區方可開始記錄實驗參數。每只動物實驗結束后清除糞便，用70%乙醇噴灑箱底并用潔凈紗布抹干，以免前一只動物的殘留氣味造成對本次實驗的影響;全部實驗結束后由不熟悉實驗設計人員進行數據提取錄入。EZM納入實驗參數有:開臂區進入時間百分率( Otime%)、開臂區進入時間( Otime)、閉臂區進入時間( Ctime)、開臂區進入次數百分率( Oentries%)、開臂區進入次數( Oentries)、閉臂區進入次數( Centries)及兩臂區進入總次數( Entries) ;其中實驗參數Otime%、Entries數據又進行分割細化處理，按照5個重復測量片段( 1 min)來進行提取。

1．4統計學分析采用SPSS 13．0 for Windows軟件進行統計分析，GraphPad Prism 6．0軟件進行統計作圖。重測信度采用ICC和κ統計參數來評價，其中ICC參數主要適用于連續變量或等級變量，由Analyze→Scale→Reliability Analysis程序完成;κ參數主要適用于分類變量，由Analyze→Descriptive statistics→Crosstabs程序完成，分析前首先根據1st分位數、3rd分位數進行低( Low≤1st分位數)、中( 1st分位數＜Medium＜3rd分位數)、高( High≥3rd分位數)狀態分類; ICC/κ: ＞0. 75認為一致性很好，0. 50～0. 75認為一致性一般，＜0．50則認為一致性較差。此外，EZM實驗參數Otime%、Entries所有數據先進行Kolmogorov-Smirnov正態分布檢驗，而后依據其結果，總體數據進行t檢驗，而重復測量數據則進行Wilcoxon檢驗和Friedman檢驗［4，6－9］。

Tab 1 Intraclass correlation coefficient ( ICC) between Test and Retest of elevated zero maze

Tab 2 Kappa agreement index (κ) between Test and Retest of elevated zero maze

2　結果

Fig 1 Correlation between Test and Retest of elevated zero maze for the“Otime%”parameter

Fig 2 Correlation between Test and Retest of elevated zero maze for the“Entries”parameter

2．1EZM重測信度檢驗ICC參數提示，Otime% (♂ICC =0. 753，P＜0. 01;♂+♀ICC =0. 535，P＜0. 05)、Otime(♂ICC =0. 753，P＜0. 01;♂+♀ICC =0. 535，P＜0. 05)、Ctime(♂ICC = 0. 753，P＜0. 01;♂+♀ICC = 0. 535，P＜0. 05)、Oentries(♂ICC =0. 719，P＜0. 01;♀ICC =0. 494，P＜0. 05; ♂+♀ICC =0. 583，P＜0. 01)、Centries(♀ICC =0. 658，P＜0. 01;♀ICC = 0. 508，P＜0. 05;♂+♀ICC = 0. 562，P＜0. 01)、Entries(♂ICC =0. 691，P＜0. 01;♀ICC =0. 502，P＜0. 05;♂+♀ICC = 0. 574，P＜0. 01)初測重測信度較好，且有統計學意義。見Tab 1，Fig 1、2。κ參數提示，Otime% (♂κ=0. 393，P＜0. 05)、Ctime(♂κ= 0. 393，P＜0. 05)、Oentries(♂κ= 0. 308，P＜0. 05;♂+♀κ= 0. 256，P＜0. 05)、Centries (♂κ= 0. 427，P＜0. 01;♂+♀κ= 0. 238，P＜0. 05)、Entries(♂κ= 0. 469，P＜0. 01)有統計學意義，但初測重測信度相對較差。見Tab 2、3、4。

2．2EZM行為模式分析Kolmogorov-Smirnov檢驗提示，Otime%、Entries總體數據符合正態分布，而重復測量數據則僅部分符合正態分布( P＞0. 05)。t檢驗結果提示，與初測相比，重測EZM實驗參數Otime% (♂t = 0. 447，♀t = 1. 626，♂+♀t = 1. 612，P＞0. 05)、Entries(♂t =－0. 441，♀t =0. 949，♂+♀t =0. 551，P＞0. 05)差異無統計學意義。Wilcoxon檢驗結果提示( Fig 3)，與初測相比，重測EZM實驗參數Otime%在第2ndmin(♀z =－3. 37，P＜0. 01;♂+♀z=－2. 70，P＜0. 01)均降低且差異有統計學意義，而Entries亦在第2ndmin(♀z =－2. 74，P＜0. 01)降低且差異有統計學意義。Friedman檢驗結果提示，初測EZM實驗參數Otime%(♂χ2=16. 63，P＜0. 01;♀χ2=11. 22，P＜0. 05;♂+♀χ2=26. 88，P＜0. 01)、Entries(♀χ2=22. 29，P＜0. 01; ♂+♀χ2=21. 77，P＜0. 05)及重測EZM實驗參數Otime% (♂χ2=13. 58，P＜0. 01;♀χ2=31. 38，P＜0. 01;♂+♀χ2=41. 91，P＜0. 01)、Entries(♂χ2= 13. 52，P＜0. 01;♂+♀χ2=16. 53，P＜0. 01)重復測量片段間差異均有統計學意義。

Tab 3 Concordance between Test and Retest of elevated zero maze for the “Otime%”parameter categories ( low，medium and high)

Tab 4 Concordance between Test and Retest of elevated zero maze for the“Entries”parameter categories ( low，medium and high)

3　討論

EZM是Shepherd等［10］于1992年最先提出，其原理亦是基于實驗動物探索習性與危險環境之間矛盾沖突，是一種相當于EPM變型的新型焦慮動物模型;但是EZM又不同于EPM［10－11］:①沒有中央區，不存在中央“死時間”;②實驗動物探索行為是連續的，不受到兩臂區末端影響;③兩臂區之間可以直接轉換，不需要經過中央區過渡，而EZM同時也存在這樣一個問題:即兩臂區進入次數通常相等或者僅差1，導致兩臂區進入次數百分率實驗參數失去評價意義。

Shepherd等［12］研究發現，抗焦慮藥物可明顯增加SD大鼠EZM開臂區進入時間百分率和開臂區低頭探索頻次，減少由閉臂區向開臂區伸軀探索頻次，而致焦慮藥物則產生相反效應;同時一定劑量范圍抗抑郁藥物5-HT1A受體激動劑( 0. 001～0. 1 mg·kg－18-OH-DPAT)可減少由閉臂區向開臂區伸軀探索頻次，5-HT3A受體拮抗劑( 0. 0001～1. 0 mg·kg－1昂丹司瓊)可增加開臂區進入時間百分率，減少由閉臂區向開臂區伸軀探索頻次。Cook等［13］研究比較了3個不同遠交品系和2個不同雜交品系小鼠對EZM重復測量效應的差異，發現不同品系是通過不同感官(視覺、嗅覺等)來收集EZM初始位置，以避免進入EZM開臂區危險域。Milner等［14］研究比較了15個不同近交品系小鼠焦慮動物模型行為模式，發現EZM及曠場實驗、明暗箱實驗中反映焦慮情緒相關行為參數與反映運動探索相關行為參數無法區分，而與反映緊張情緒糞便粒數參數可以加以區分。Kulkarni等［15］研究不同類別抗焦慮藥物，包括安定類、巴比妥類、乙醇、印防己毒素(通道阻滯劑)、戊四唑、氟馬西尼( BDZRs拮抗劑)等，發現EZM對以苯二氮卓類受體( BDZRs) -γ-氨基丁酸A受體( GABAAR) -氯離子通道復合物為作用靶點的工具藥物均有效。

Fig 3 Behavioral pattern of elevated zero maze for the“Otime%”( ABC)＆“Entries”( DEF) parameters during a 5-minute observation period

本研究ICC和κ結果均提示，EZM實驗參數重測信度受性別影響較大，♂昆明小鼠EZM重測信度相對較好(尤其是Otime%和Entries)，而♀昆明小鼠EZM重測信度相對較差; Wilcoxon檢驗結果也顯示僅♀昆明小鼠EZM實驗參數Otime%、Entries在初測重測第2ndmin均有顯著性差異。此外，盡管Friedman檢驗結果顯示♂/♀昆明小鼠EZM實驗參數Otime%、Entries在5個重復實驗片段中具有波動性，但是t檢驗結果仍然證實，♂/♀昆明小鼠EZM實驗參數Otime%、Entries受重復測量效應影響相對較小。因此，EZM作為昆明小鼠狀態焦慮動物模型進行評價時，推薦采用Otime%、Entries實驗參數，推薦采用♂實驗動物，而間隔1周重復測量效應可以忽略。動物模型是研究疾病發生機制和評價藥物效應的有力工具;動物模型行為具有多維性，是結構和功能共同相互作用的結果;有關EZM狀態焦慮動物模型相關研究將在后續研究陸續報道。

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Elevated zero maze as an animal model of state anxiety in Kunming mice: test-retest reliability

SUN Shi-guang1，2，3
( 1．Dept of Pharmacy，Second Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine Jinan 250001，China; 2. Dept of Pharmacy，Shandong Provincial Hospital of Integrated Medicine，Jinan 250001，China; 3．College of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China)

Abstract:AimTo explore the test-retest reliability of elevated zero maze ( EZM)，as an animal model of state anxiety in Kunming mice．Methods The behavior of adult，male and female，Kunming mice in EZM was recorded twice，for five minutes，with a one-week inter-trial interval．The following parameters were evaluated: percentage of time on EZMopen arms ( Otime%)，time on EZM open arms ( Otime)，time on EZM closed arms ( Ctime)，percentage of entries into EZM open arms ( Oentries%)，entries into EZM open arms ( Oentries)，entries into EZM closed arms ( Centries)，total entries into EZM open and closed arms ( Entries)．Subsequently，the intraclass correlation coefficient ( ICC) and the kappa agreement index (κ) were calculated for these parameters．Results ICC for Otime%(♂ICC = 0. 753，P＜0. 01;♂+♀ICC = 0. 535，P＜0. 05)，Otime (♂ICC =0. 753，P＜0. 01;♂+♀ICC =0. 535，P＜0. 05)，Ctime (♂ICC = 0. 753，P＜0. 01;♂+♀ICC = 0. 535，P＜0. 05)，and Oentries (♂ICC =0. 719，P＜0. 01; ♀ICC =0. 494，P＜0. 05;♂+♀ICC =0. 583，P＜0. 01)， Centries (♀ICC = 0. 658，P＜0. 01;♀ICC = 0. 508，P＜0. 05;♂+♀ICC = 0. 562，P＜0. 01)，Entries (♂ICC = 0. 691，P＜0. 01;♀ICC = 0. 502，P＜0. 05;♂+♀ICC = 0. 574，P＜0. 05) showed a good and fair test-retest reliability，respectively．Only κ for Otime% (♂κ= 0. 393，P＜0. 05)，Ctime (♂κ=0. 393，P＜0. 05)，Oentries (♂κ= 0. 308，P ＜0. 05;♂+♀κ= 0. 256，P＜0. 05)，Centries (♂κ= 0. 427，P＜0. 01;♂+♀κ=0. 238，P＜0. 05)，Entries (♂κ=0. 469，P＜0. 01) displayed a significant but poor reliability between the test-retest trials．ConclusionsThe parameters Otime% and Entries for Kunming mice in EZM are stable over time，and indicate an acceptable reliability with a one-week inter-trial interval．Meanwhile，more attention should be paid not to repeated measure effect，but to the sex effect ( Male animals recommended to EZM，especially)．

Key words:elevated zero maze; state anxiety; animal model; test-retest reliability; sex; repeated measurement; Kunming mice

作者簡介:孫世光( 1983－)，男，博士生，主管中藥師，通訊作者，研究方向:方劑配伍規律與證候動物模型構建及其評價，Tel: 0531-82436123/82436487，E-mail: s．g．sun@ hotmail．com

基金項目:國家自然科學基金青年基金項目( No 81302887) ;山東省科技發展計劃項目( No 2014GSF119034) ;山東省中醫藥科技發展計劃項目( No 2015-131) ;山東省中醫藥科技發展計劃項目( No 2013-103) ;山東省中醫藥科技發展計劃項目( No 2011-107)

收稿日期:2015－10－04，修回日期: 2015－11－03

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978( 2016) 01－0133－05

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．028