漢中黑稻黃烷酮3-羥化酶基因(F3H)的遺傳變異分析

張 濤，尹亞軍，路宏朝，王 令

(陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000)

漢中黑稻黃烷酮3-羥化酶基因(F3H)的遺傳變異分析

張 濤，尹亞軍，路宏朝，王 令

(陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000)

本實驗通過PCR和測序拼接獲得漢中地區8個黑稻品種黃烷酮3-羥化酶基因(F3H)編碼區序列,在NCBI中用BLAST分析首次發現該基因位于水稻4號染色體。發現8種黑稻和普通秈稻F3H序列完全相同,與粳稻相比較，則存在4個突變位點，導致2個氨基酸突變。基于F3H序列信息的進化樹表明黑稻與秈稻、粳稻、小麥、玉米的親緣關系較近；遺傳距離和同源性分析表明F3H基因較為保守，是一個古老的基因，可用于種屬的鑒定分析。F3H蛋白理化性質分析發現,黑稻與其它禾本科植物存在一定差異，蛋白三維結構及相關位點預測發現粳稻和黑稻無明顯差異，初步認為黑稻F3H序列變異可能與花青素的合成無關，需要在其表當量與花青苷和成合成與沉積的關系方面開展進一步研究。

黑稻；黃烷酮3-羥化酶；序列分析；遺傳變異

水稻是主要的糧食作物，存在秈稻和粳稻2個變種，秈稻和粳稻中有部分群體的果皮層、種皮和米粒表現為黑色，研究發現黑色與花青素含量和結構有關，這一群體被稱為黑稻，是稻種資源庫中極具特色而又名貴的類群[1]。由于稻米中富含天然花青素和較多的蛋白質、氨基酸及微量元素，因而具有較高的營養保健功能和經濟價值，備受人們關注[2]。學者對于水稻中花色素苷的合成機制進行了大量研究，以期揭示其代謝調控機理，為水稻的育種和種質資源保護提供指導與借鑒[3-4]。

植物色素是天然色素主要來源，其合成機制已經開展了較為廣泛和深入研究，現有結果表明花青素合成主要通過苯丙氨酸途徑，大致可以分為3個階段：①由苯丙氨酸到4-香豆酰CoA；②由4-香豆酰CoA和丙二酰CoA到二氫黃酮醇；③由二氫黃酮醇到各種花青素的合成，進一步反應生成各種花青苷[5]。盡管有學者研究發現控制水稻種皮著色的Pb基因位于水稻第4染色體上，紫色種皮對白色種皮呈顯性[6]，但對于水稻中普通稻和黑稻之間花青素合成與沉積的分子生物學機制尚未闡述清楚，難以在育種中加以推廣應用。

表1 F3H基因序列目錄

表2 引物序列目錄

本研究基于植物花青素合成機制的研究，選擇在花青素合成第二階段發揮作用的黃烷酮3-羥化酶(F3H，Flavanone 3-Hydroxylase)為靶基因，對漢中地區主要種植的8個黑稻品種進行遺傳變異分析，研究F3H基因同時，基于該位點探索水稻的遺傳分化，為水稻的起源與進化提供相關的基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料及DNA提取

本研究以陜西漢中地區種植的黑寶(HB)，黑豐(HF)，黑帥(HS)，黑米A(HMA)，黑米B(HMB)，黑優粘(HYZ)，培811(P811)，云黑(YH)等8個黑稻品種為材料，該8個品種均為秈稻，由陜西省水稻研究所提供。種子在調溫調濕箱中進行萌發，取水稻其嫩葉葉尖，按照改良的CTAB法提取基因組DNA[7]。

1.2 引用序列和引物序列

由網站http:/ /www.ncbi.com查得不同植物F3H基因序列(表1)，通過BLAST在NCBI中檢索到粳稻的F3H序列，采用軟件Primer 5.0 設計用于PCR擴增F3H序列的引物(表2)，引物序列由上海生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 PCR擴增反應體系及程序

PCR反應總體系為25 μl：10×PCR緩沖液2.5 μl，dNTP (10 mM)0.5 μl，上下游引物 (10 pmol)各1.2 μl，TaqDNA聚合酶(5 U/μl)0.2 μl，DNA模板 (50 ng/μl)1.2 μl，超純水18.2 μl。PCR擴增程序：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環，然后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.4 統計分析

采用DNAMAN對不同黑稻品種和粳稻F3H基因序列進行拼接和比對；以不同物種F3H基因的序列信息為基本數據，通過MEGA5.0進行了物種的聚類分析；在www.expasy.org網站進行了水稻F3H蛋白質結構預測和理化性質分析。

2 結果與分析

2.1 黑稻F3H基因序列比對分析

本研究發現NCBI沒有直接標注水稻F3H數據信息，以其他禾本科植物的F3H序列為參照，通過BLAST檢索到NCBI中粳稻4號染色體的3個外顯子序列(55313..55654，55732..56160，57637..57999，反向互補)與禾本科F3H同源性很高，初步確定該基因為粳稻F3H,同時也得到了秈稻F3H的序列。水稻F3H的編碼序列全長1134 bp，其中外顯子1長363 bp，外顯子2長429 bp，外顯子3長342 bp。基于秈稻F3H序列設計了水稻F3H擴增的PCR引物，最終獲得了漢中地區選育、栽培的8個黑稻品種的F3H序列，8種黑稻F3H序列完全相同，以黑稻來代表8種黑稻(Br，Black rice)。通過黑稻與秈稻、粳稻的F3HmRNA序列比對分析發現，黑稻與秈稻之間無差異，與粳稻比較則存在4個變異位點(圖1)。這4個位點的變異分別為編碼區666位的T/G轉換，772位的C/G顛換，899位的T/G轉換，942位的G/A轉換(圖2)。結果表明F3H基因可以作為秈稻與粳稻亞種之間鑒定分析的一個候選基因，但是突變位點的變異不影響花青素的合成。

圖1 F3H序列比對Fig.1 The sequence alignment of F3H

圖2 F3H序列SNPsFig.2 The SNPs of F3H

2.2 不同物種F3H基因的聚類分析

探索黑稻、秈稻和粳稻的起源與分化也是水稻科學研究領域的一個值得關注的問題，F3H是一個較為保守的古老基因，其在不同物種間的遺傳變異可以作為系統進化研究的一個參考位點。本實驗以F3H的序列信息為基礎，通過近鄰相接法(NJ，neighbor-joining method)進行8個漢中黑稻和其他物種系統進化樹構建(圖3)，來探討以F3H序列為參考來進行不同物種系統進化研究的可行性。研究分析發現，漢中8個黑稻品種與秈稻聚為一類，然后與粳稻聚為一個稻屬的大類。稻屬植物與玉米、小麥等禾本科植物聚在一個分支，荔枝和龍眼形成一個分支，其他不同物種的系統進化關系能夠清楚區分，這一研究結果表明F3H可用以鑒定不同屬間和種間的進化關系，但不能清楚的進行種內品種間的親緣關系分析。

2.3 不同植物F3H基因mRNA序列的同源性和遺傳距離比較分析

為清楚闡明黑稻、水稻與不同物種間的親緣關系，本研究計算了不同物種間的同源性和遺傳距離(表3)。結果發現黑稻與秈稻完全相同，粳稻和秈稻、黑稻的同源性為99.6 %，與禾本科的小麥﹑玉米相比，同源性分別為84.9 %、83.8 %，水稻與其他植物同源性均在66.7 %以上。水稻與小麥的遺傳距離為0.152～0.153，和玉米遺傳距離為0.162～0.163，水稻與小麥的親緣關系較玉米近一些。不同植物之間的同源性都在65.1 %(柑橘和玉米)以上,遺傳距離都在0.349(柑橘和玉米) 以內，數據表明F3H序列相對保守，是一個比較原始的基因，對于植物生長發育過程中必是不可少的。由于秈稻、黑稻與小麥和玉米的親緣關系相對于粳稻要稍近一些，可以基于該結果判斷秈稻和本研究的黑稻比粳稻要古老一些，更接近于水稻祖先。

圖3 基于F3H基因序列的聚類分析Fig.3 Cluster analysis based on F3H sequence

種屬粳稻Ja秈稻In黑稻Br小麥Wh玉米Co葡萄Gr龍眼Lo荔枝Li蕎麥Bw蘋果Ap柑橘Ci粳稻Ja-99.6%99.6%84.7%83.7%71.5%71.5%69.6%69.3%68.6%66.8%秈稻In0.004-100%84.9%83.8%71.6%71.4%69.6%69.3%68.6%66.7%黑稻Br0.0040.000-84.9%83.8%71.6%71.4%69.6%69.3%68.6%66.7%小麥Wh0.1530.1510.151-84.4%70.1%70.0%68.3%67.2%67.6%65.7%玉米Co0.1630.1620.1620.156-70.8%70.6%68.9%67.9%68.4%65.1%葡萄Gr0.2850.2840.2840.2990.292-79.6%78.4%75.8%77.7%77.6%龍眼Lo0.2850.2860.2860.3000.2940.204-97.0%78.3%80.0%83.4%荔枝Li0.3040.3040.3040.3170.3110.2160.030-77.2%79.2%83.3%蕎麥Bw0.3070.3070.3070.3280.3210.2420.2170.228-74.7%75.0%蘋果Ap0.3140.3140.3140.3240.3160.2230.2000.2080.253-77.6%柑橘Ci0.3320.3330.3330.3430.3490.2240.1660.1670.2500.224-

表4 F3H蛋白理化性質

2.4 禾本科F3H蛋白質的理化性質與功能預測分析

稻屬植物F3H由377個氨基酸組成，研究發現秈稻和黑稻F3H mRNA序列在編碼區有4個突變位點，其中722位的C/G顛換引起的第241位的丙氨酸(Ala)突變為甘氨酸(Gly)，899位的T/G轉換遺傳變異引起第300位氨基酸甲硫氨酸(Met)突變為精氨酸(Arg)。為了進一步分析2個位點氨基酸的變化可能引起的理化性質和功能變化，在www.expasy.org上對不同植物F3H的部分理化性質及三維結構進行了預測分析(表4、圖4)。比較發現禾本科4種植物F3H蛋白為370～380個氨基酸；在理論等電點上，秈稻、黑稻為5.80，高于粳稻，低于小麥、玉米；總疏水性上，秈稻、黑稻低于粳稻，高于小麥、玉米；不穩定性上，秈稻、黑稻高于粳稻，低于小麥、玉米；在蛋白質三維結構上，粳稻與秈稻和漢中黑稻無明顯差異存在。通過NetPhos2.0、NetOGlyc3.0、NetNGlyc1.0程序對粳稻和秈稻及黑稻F3H的結構進行預測，發現磷酸化位點、O連接糖基化位點、N連接糖基化位點均無差異。

3 討 論

花青素是一種帶有氧正離子的天然色素，具有很強的抗氧化性，能清除體內積累的自由基，對很多疾病有一定的緩解作用[8]，因而備受關注。目前，關于黑稻花青素的研究主要集中在花青素的提取、功能活性及開發利用方面[9-12]，而關于黑稻花青素合成的分子調控機制研究相對較少。花青素的合成途徑受許多結構基因和調控基因影響，結構基因主要包括苯丙氨酸裂解酶、肉桂酸羥化酶、查爾酮合成酶、黃烷酮3-羥化酶(F3H)、二氫黃酮醇還原酶、花青素合成酶等[13]。F3H在花青素合成中負責催化4,5,7-三羥基黃烷酮C3位的羥化，生成二氫黃酮醇，對花色的形成具有重要作用[14]。目前研究表明植物F3H基因均有3個外顯子，2個內含子，編碼350～380個氨基酸[15]。已經有學者報道一些植物中果色及花色突變體的F3H 表達水平存在差異，表明 F3H 在花青素合成代謝過程中發揮重要作用[16-17]。A.Zuker等利用反義RNA技術抑制香石竹F3H表達，使花色發生不同程度的改變，花瓣顏色變淺，甚至出現了白色[18]。F.Jiang等在草莓中反義抑制F3H的表達，阻斷了花青素合成，進而影響果實中花青素積累[19]。L.Jaakola等發現正常藍莓成熟過程中，F3H大量表達，花青素含量急劇增加，果實由綠色經紅色變成黑紫色，但在白色和紅色突變體果實中基本檢測不到F3H的表達[20]。因此，本研究以黃烷酮3-羥化酶(F3H)作為黑稻花青素合成的一個候選基因來分析，探索該基因的變異是否與黑稻中花青素沉積有一定的關系。

圖4 F3H蛋白三維結構Fig.4 Three dimensional model F3H protein

由于植物體內黃酮物質的形成與色素的沉積是植物形成所具有的一個基本特征，所以認為F3H基因是一個相對古老的基因，基因結構和序列相對保守，在漫長的歷史進化中，物種遺傳分化會導致不同物種的F3H存在很大差異，可以作為花青苷合成和物種鑒定的一個候選基因。本實驗首次獲得了漢中地區8個黑稻品種F3H基因mRNA序列，通過BLAST分析，將水稻F3H基因定位在4號染色體。研究結果發現8個黑稻品種F3H基因序列相同，且與秈稻一樣，與普通粳稻的F3H相比，存在4處突變位點，導致2處氨基酸序列改變。通過蛋白質理化分析發現黑稻F3H的不穩定性較粳稻高一些，而蛋白質結構預測及磷酸化位點、O連接糖基化位點、N連接糖基化位點分析，兩者之間均無差異。結合其他學者關于F3H對花青素合成的研究記過，本研究認為黑稻F3H的突變可能與酶的催化活性無關，需要進一步研究黑稻中F3H基因表達水平對花青素合成的影響。另外，本研究基于F3H序列構建的黑稻、秈稻、粳稻和其他物種的系統進化樹結果表明F3H基因可以作為種屬鑒定的一個候選基因，但不能準確區分種內品種間的遺傳關系。聚類分析和遺傳距離結果發現秈稻、黑稻與小麥和玉米的遺傳距離稍近一點，可能初步判斷秈稻要比粳稻更古老一些，要確切分清兩者的進化關系，還需擴大范圍系統研究。

[1]張 羽,李新生,馮志峰,等.陜西省有色稻資源的SSR多態性分析[J].植物遺傳資源學報,2011(5):828-832.

[2]馬挺軍,任貴興.色稻功能成分研究進展[J].中國農學通報,2010(11):61-66.

[3]Hu J P，Reddy V S，Wessler S R．The rice R gene family:Two distinct subfamilies containing several miniature inverted-repeat transposable elements[J]. Plant MolBiol,2000(42):667-678.

[4]Sakamoto W, Ohmori T, Kageyama K, et al. The Purple leaf (Pl) Locus of Rice:the Plw Allele has a Complex Organization and Includes Two Genes Encoding Basic Helix-Loop-Helix Proteins Involved in Anthocyanin Biosynthesis [J]. Plant Cell Physiol, 2001(42):982-991.

[5]馬廷蕊,張金文,梁慧光,等.植物花青素合成與基因調控(英文)[J].Agricultural Science & Technology, 2012(3):507-511+54.

[6]王彩霞,舒慶堯.水稻紫色種皮基因Pb的精細定位與候選基因分析[J].科學通報,2007(21):2517-2523.

[7]ZHANG Y,BO G.R. Evluation of authentication of methodology on genonmic DNA isolation of plant[J]. Drag Evaluation,2004(4):292-297.

[8]沈 蕓,肖 鵬,包勁松.水稻營養成分遺傳育種研究進展[J].核農學報,2008(4):455-460+425.

[9]李新生,鄧文輝,吳三橋,等.陜西三種特種稻米氨基酸及品質分析[J].氨基酸和生物資源,2001(4):1-3.

[10]丁 銳.黑稻主要栽培品種過氧化物酶同工酶的研究[J].安徽農業科學,2005(6):947-948.

[11]王勝寶,馮志峰,李新生,等.陜西漢中特種稻產業發展現狀及前景[J].新疆農業科學,2010(S2):147-150.

[12]曹小勇,李新生.黑米花色素苷類色素研究現狀及展望[J].氨基酸和生物資源,2002(1):3-6.

[13]邵雅芳,徐非非,唐富福,等.水稻花青素合成相關基因的時空表達研究[J].核農學報,2013(1):9-14.

[14]李 明,王玉紅,李長生,等.花生黃烷酮3-羥化酶基因AhF3H的克隆和表達分析[J].山東農業科學,2013(11):1-6.

[15]石少川,高亦珂,張秀海,等.植物花青素生物合成相關基因的研究及應用[J].植物研究, 2011(5):633-640.

[16]Yang Y, Zhao G, Yue W, et al. Molecular cloning and gene expression differences of the anthocyanin biosynthesis-related genes in the red/green skin color mutant of pear (PyruscommunisL.) [J].Tree Genetics&Genomes,2013(9):1351-1360.

[17]Martin C, Prescott A, Mackay S, et al. Control of anthocyanin biosynthesis in flowers of Antirrhinum majus[J]. The Plant Journal,1991,1(1):37-49.

[18]Zuker A, Tzfira T, Ben-Meir H, et al. Modification of flower color and fragrance by antisense suppression of the flavanone 3-hydroxylase gene[J].Molecular Breeding,2002,9(1):33-41.

[19]Jiang F, Wang J, Jia H, et al. RNAi-mediated silencing of the flavonone 3-hydroxylase gene and its effect on flavonoid biosynthesis in strawberry fruit[J]. Journal of Plant Growth Regulation, 2013, 32 (1):182-190.

[20]Jaakola L, M?tt? K, Pirttil? A M,et al. Expression of genes involved in anthocyanin biosynthesis in relation to anthocyanin, proanthocyanidin, and flavonol levels during bilberry fruit development[J]. Plant Physiology, 2002,130(2):729-739.

(責任編輯 李 潔)

Genetic Variation of Flavanone 3-Hydroxylase(F3H)of Black Rice Varieties in Hanzhong

ZHANG Tao ,YIN Ya-jun, LU Hong-zhao, WANG Ling

(School of Biological Science Technology and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong Shaanxi 723100，China)

The full coding sequence of F3H was isolated from the 8 Black rice breeds in Hanzhong by PCR and sequencing. BLAST analysis found that the gene is located on the chromosome 4 of rice for the first time. The 8 black rice breeds andIndicahave the sameF3Hcoding sequence .There were 4 mutational sites betweenIndicaandJaponica, and resulting in 2 amino acid mutations. The phylogenetic tree indicated that black rice was very closely toIndica,Japonica, wheat, corn. The genetic distances and homology analysis showed that conservedF3Hgene was an ancient gene, and can be used to species identification . The physicochemical properties prediction of F3H found no significant differences between Black rice and other gramineae plants. There are no significant differences in the three dimensional structure of F3H protein and the related active site prediction of Japonica and Black rice. Therefore, it is considered that Black riceF3Hsequence variation may be unrelated to the synthesis of anthocyanins, and we need to further study on the expression level ofF3H.

Black rice; Flavanone 3-Hydroxylase; Sequence analysis; Genetic variation

1001-4829(2016)10-2257-06

10.16213/j.cnki.scjas.2016.10.001

2015-12-16

陜西省科技廳農業攻關項目(2013K02-26-02)

張 濤(1978-)，男， 碩士，副教授，主要從事分子遺傳學研究，E-mail：zl780823@163.com。

S511

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