稻瘟病抗性基因Pita特異性分子標記的開發及應用

華麗霞, 張 姝, 蘇 菁

(1.四川省農業科學院植物保護研究所, 四川 成都 610066; 2.四川省農業科學院經濟作物育種栽培研究所，四川 成都 610300; 3.廣東省農業科學院植物保護研究所, 廣東 廣州 510640; 4.廣東省植物保護新技術重點實驗室, 廣東 廣州 510640)

稻瘟病抗性基因Pita特異性分子標記的開發及應用

華麗霞1,2, 張 姝1, 蘇 菁3,4

(1.四川省農業科學院植物保護研究所, 四川 成都 610066; 2.四川省農業科學院經濟作物育種栽培研究所，四川 成都 610300; 3.廣東省農業科學院植物保護研究所, 廣東 廣州 510640; 4.廣東省植物保護新技術重點實驗室, 廣東 廣州 510640)

Pita是一個具有廣譜抗性的稻瘟病抗性基因，已經被引入到各稻區的抗性育種工作中。在基于分子標記輔助選擇的水稻抗性育種工作中，為了提高對Pita的篩選效率，本研究以導致Pita第918個氨基酸發生變異的單堿基差異為靶標，開發得到Pita基因特異性分子標記，Pita918。研究結果表明，Pita基因特異性分子標記能準確地將Pita與各抗性基因及感病等位基因區分開，這將為育種家提供了直接而高效的Pita篩選標記。同時，本研究還利用該標記對收集自華南及西南稻區的13個水稻地方抗性品進行基因檢測，結果顯示這13個品種均不攜帶有抗性基因Pita，表明Pita基因特異性分子標記在水稻抗性材料的基因型鑒定中具有應用價值，有助于育種家挖掘新的抗性基因材料。

水稻；稻瘟病；抗性育種；分子標記；MAS

植物病害可以對產量造成直接的影響，嚴重的時候可以引起糧食危機，如1845年發生在歐洲的馬鈴薯晚疫病。為此，育種家們一直致力于對不同的作物進行抗性改良。水稻(OryzasativaL.)是世界范圍內重要的糧食作物之一，成為世界上過半人口的主要口糧[1]。然而，水稻的產量每年都受到各種水稻病害的威脅，其中由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae；無性態：Pyriculariaoryzae)引起的稻瘟病對水稻的產量產生了嚴重的影響，造成嚴重的糧食損失[2-3]。抗性品種的使用被公認為是控制稻瘟病大流行最環保、最經濟有效的方法[2, 4-5]。然而，稻瘟病菌生理小種的遺傳易變性嚴重妨礙了抗性品種的使用壽命，攜帶單個主效抗性基因的水稻品種在推廣3～5年后，由于毒性菌株逐漸成為優勢小種，最終使品種抗性喪失[6]。因此，育種家需要不斷挖掘新的抗性材料，培育出具有優良農藝性狀的抗性品種。然而，通過傳統的表型鑒定來篩選新抗源材料不僅周期長，而且容易受環境因素的影響。因此，如何從大量的水稻種質資源中快速有效地篩選出新的抗源材料是育種家需要解決的一個問題。

水稻的2個亞種，粳稻及秈稻全基因組測序的相繼完成[7-8]，為水稻的基因組學研究提供了豐富的序列信息，加快了多態性分子標記，特別是基于PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈式反應)技術的分子標記的開發，加速了控制包括稻瘟病抗性在內的重要農藝性狀基因的定位、分離及克隆等工作。分子標記輔助選擇(marker-assisted selection，MAS)則是在分子標記快速發展的情況下衍生出來的，這一技術的出現大大提高了對目標性狀的定向選擇效率[9]。

到目前為止，已經克隆的稻瘟病抗性基因達26個(http://www.ricedata.cn/)。在這些已克隆的稻瘟病抗性基因中，部分是以復等位基因的形式存在于不同水稻品種的同一染色體位置中，這些等位基因雖然在序列上只有少數幾個堿基的差異，但是能夠抵抗不同的稻瘟病生理小種，典型的如Pik位點上的等位基因簇，該位點上包含了Pik-m、Pik、Pik-p、Pi1、Pik-h等幾個序列高度相似，抗譜卻有所不同的等位基因[10-14]。稻瘟病抗性基因的克隆及序列信息的公布使基因特異性分子標記的開發成為可能。基因特異性分子標記是指基于基因內部多態性序列所開發的分子標記[15]。與緊密連鎖的分子標記相比，基因特異性分子標記在抗性基因的篩查以及基于MAS技術的抗性育種工作中更具優勢。Hayashi 等[16]在Pit啟動子區域、編碼區分別開發得到稻瘟病抗性基因Pit的特異性分子標記，通過分子標記鑒定，在種資質源篩選得到5個Pit類型的抗性基因。華麗霞等[15]成功開發得到Pi2/9/zt的基因特異性分子標記，完成對101個水稻品種的基因型篩查，為育種家對抗源材料的選擇提供重要的參考信息。Pita是一個具有廣譜抗性的稻瘟病抗性基因，已經被廣泛應用于水稻抗性育種工作中[17-18]。雖然國內外關于Pita分子標記開發的研究已經有報道，但是這些分子標記抑或是位于Pita側翼，抑或是顯性標記，在應用過程中容易對目標基因造成錯選或漏選[19]。研究結果表明，Pita所編碼的氨基酸第918個位點由丙氨酸突變為成絲氨酸將引起基因功能的喪失，并且該突變在水稻種質資源中具有普遍性[20-21]。基于前期的研究結果，本文將以導致Pita第918個氨基酸發生變異的SNP(Single Nucleotide Polymorphism，單核苷酸差異)為靶標位點，以此開發得到稻瘟病抗性基因Pita特異性共顯性分子，旨在為水稻育種學家在稻瘟病抗性育種工作方面提供直接而有效的分子標記。

1 材料與方法

1.1 水稻材料

本研究所用的材料有：Pita供體品種IRBLta-K1；攜帶有不同抗性基因的水稻品種IRBL9-W (Pi9)、 C101A51 (Pi2)、IRBLzt-T (Piz-t)、C101LAC (Pi1)、IRBLa-A(Pia)、 IRBLk-Ka (Pik)作為陽性對照；感病品種Nipponbare、CO39以及麗江新團黑谷LTH作為陰性對照。

1.2 引物設計

Pita全基因序列來自Genbank數據庫(收錄號：AF207842)；感病等位基因序列來自日本晴基因組上的參考序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)；序列比對用DNAStar (http://www.dnastar.com/)的子軟件Seqman進行。CAPS/dCAPS標記通過在線軟件dCAPS finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)[22]來開發。

1.3 分子標記的檢測方法

用新型快速植物基因組DNA提取試劑盒(BioTeke, cat#DP3112)提取水稻葉片總DNA；引物序列由上海生工生物工程技術有限公司合成；PCR反應體系總體積為20 μl，其中包括2 μl的10×PCR buffer (Mg2+Plus)，1.6 μl的dNTPs (2.5 mM each，TAKARA)，各1 μl正反向引物(10 μM)，0.1 μl的TaKaRaTaqTM(5 U/μl)，水稻基因組DNA 50 ng/μl；反應程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環；72 ℃ 5 min。

用限制性內切酶PvuII (15 U/μl，TAKARA)對PCR產物進行酶切，酶切體系總體積為12 μl，其中包括1.2 μl的10×M buffer，6 μl的PCR產物，1 μl的內切酶，酶切反應條件為37 ℃酶切3 h。酶切產物用8 %的聚丙烯酰胺變性電泳凝膠中電泳檢測，90 V，120 min。

2 結果與分析

2.1Pita基因特異性分子標記的開發

通過序列比對，找到抗感等位基因之間導致Pita第918位氨基酸發生突變的SNP，如圖1所示。利用dCAP標記開發原理，在正向引物3'末端引入錯配堿基(圖1，小寫字母)，與Pita特異SNP構成一個可以被限制性內切酶PvuII識別的位點CAGCTG(圖1)。在SNP下游設計反向引物，擴增獲得可用于酶切鑒定的擴增產物(表1)。

表1 Pita特異性分子標記相關信息

注：F：正向引物；R：反向引物。

Note：F:Forward primer; R:Reverse primer.

斜體字母代表導致Pita第918個氨基酸發生突變的SNP，下劃線所代表的是編碼第918個氨基酸的三聯密碼子，其中GTC編碼氨酸(Alanine),TCT編碼絲氨酸(Serine)；雙下劃線代表正向引物，小寫字母為3'，未端引入的錯配編堿基圖1 Pita與感病等位基因之間的序列對比Fig.1 Sequence align ment of Pita and its orth logs

2.2Pita基因特異性分子標記的驗證

以攜帶不同抗性基因的水稻品種作為陽性對照，以感病品種作為陰性對照，對該標記進行多態性檢測。用上述引物對各水稻品種總DNA進行擴增，用限制性內切酶PvuII對擴增產物進行酶切后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，結果表明，該標記能清楚地將Pita與各抗性基因及感病等位基因區分開(圖2)。

2.3 用Pita基因特異性分子標記對抗性材料進行檢測

為了減少抗性育種工作的盲目性，提供育種效率，在育種初期應該對水稻材料進行抗性遺傳背景的分析，因此用基因特異性分子標記對水稻品種資源進行抗性基因篩查便顯得十分重要。Pita是一個具有廣譜抗性的稻瘟病抗性基因，適合引入到各稻區的抗性育種工作中。本研究用所開發的Pita基因特異性分子標記對收集自華南及西南稻區的13個水稻地方品進行基因檢測。這13個地方品種在自然條件對稻瘟病具有一定的抗性，對抗性育種工作及新抗性基因的挖掘具有一定的應用價值。然而，在這13個地方品種中，并沒有檢測到Pita基因，說明這13個地方品種的稻瘟病抗性并不是由稻瘟病抗性基因Pita所介導的(圖3)，這些抗源材料可能攜帶有其它稻瘟病抗性基因。

M:DL2000;Line 1:cv.IRBLta-K1(Pita);Line 2:cv.IRBL9-W(Pi9);Line 3:cv.C101A51(Pi2);Line 4:cv.IRBLzt-T(Piz-t);Line 5:cv.C101LAC(Pi1);Line 6:cv.IRBLa-A(Pia);Line 7:cv.IRBLk-Ka(Pik);Line 8:cv.Nipponbare;Line 9:cv.CO39.Line 10:cv.LTH.圖2 Pita特異性分子標記的多態性檢測Fig.2 Polymorphsim validation of Pita-specific marker

M:DL2000; Line 1:cv. IRBLta-K1 (Pita); Line 2-14:Resistance rice landraces圖3 Pita特異性分子標記對水稻抗性材料的基因型檢測Fig.3 Genotype analysis of resistance rice materials by Pita-specific DNA marker

3 討 論

抗性育種的關鍵在于：①獲得抗源材料；②快速準確地將目標基因導入到待改良的品種中。分子標記輔助選擇(MAS)是隨著現代分子生物學技術的迅速發展而產生的分子技術，可以準確快速地分析個體的遺傳組成，實現對目標性狀的定向選擇，為作物的分子設計育種提供重要的技術工具。在水稻抗性育種方面，分子標記輔助選擇已經逐漸被用于優良品種、不育系等品種的抗性改良中，主要集中在抗性基因的滲入及基因聚合等方面[23-25]。官華忠等[26]以水稻品系LAC23 (Pi1)作為抗性供體親本，保持系金23B為受體親本，以回交轉育為基礎，利用與Pi1連鎖的分子標記RM224或MRG4766對后代進行篩選，最終育成了抗稻瘟病秈型三系不育系金抗1A，其抗性不僅達到了LAC23 (Pi1)的抗性水平，而且還保持了金23A的優良農藝性狀。

在抗性育種工作中，分子標記與目標基因的連鎖程度對MAS技術的效率有著重要的影響。而與緊密連鎖的分子標記相比，基因特異性分子標記與目的基因完全共分離，實現了對目的基因的直接選擇，不受遺傳背景以及遺傳重組的影響，適合的群體較廣，在應用上更具優勢[15]。基因特異性分子標記有著重要的應用價值，在分子育種中，還可用于對水稻種子資源進行分子鑒定，了解各抗性基因在種質資源中的分布情況，不僅為抗性育種工作的開展提供重要的參考信息，使主效抗性基因在抗性育種工作中實現合理地使用，同時還可以對抗源材料的抗性遺傳背景進行分析，為育種家快速鑒定到新的抗源材料提供重要的技術手段。此外，用基因特異性分子標記對大田水稻生產品種進行抗性基因存在與缺失情況的監測，可以及早地發現因不明原因而造成基因丟失的品種，這對預防稻瘟病的流行起到一定的作用。隨著越來越多的功能基因被分離克隆，基因特異性分子標記的這些潛在應用價值將促使其在未來研究中越來越受到重視。

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(責任編輯 李 潔)

Development and Application of Specific DNA Marker for Rice Blast Resistance Gene,Pita

HUA Li-xia1,2, ZHANG Shu1, SU Jing3,4

(1.Plant Protection Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Sichuan Chengdu 610066，China; 2.The Industrial Crop Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Sichuan Chengdu 610300，China; 3.Plant Protection Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences,Guangdong Guangzhou 510640，China; 4.Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technology for Plant Protection, Guangdong Guangzhou 510640，China)

Pitais a broad-spectrum resistance gene for rice blast and has been applied in different rice resistance breeding programs. In order to improve the efficiency forPitaselection based on molecular marker-assistant selection (MAS), a gene-specific dCAPs marker, Pita918, targeted on single nucleotide polymorphism that result in single amino acid changed between resistant and susceptible allele ofPitaon 918th aa has been developed in this paper. The result showed thatPitaspecific DNA marker Pita918 can distinguishPitafrom otherRgenes and susceptible allele gene clearly, providing breeders an efficient and accurate marker forPitaselection. Additionally, Pita918 has been used for genotype characterization among 13 resistant rice landraces collected from south and southwest of China, the result showed that those landraces do not harboringPitafor their rice blast resistance, suggesting that Pita918 is a valuable DNA marker for genotype identification in rice germplasm, which will give breeders abundant genetic information in new resistance genes discovery.

Rice; Rice blast; Resistance breeding; Molecular marker; MAS

1001-4829(2016)10-2275-04

10.16213/j.cnki.scjas.2016.10.004

2015-12-30

四川省財政創新能力提升工程青年基金項目(2014CXSF-023)；國家自然科學基金資助項目(31301304)；國家科技(轉基因)重大專項(2014ZX0800904B)；公益性行業科研專項(201203014)；現代農業產業技術體系建設專項(CARS-01-24)

華麗霞(1983 -)，女，廣東英德人，博士研究生，主要從事作物病害方面的研究, E-mail：newpage@stu.scau.edu.cn。

S511

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