超聲提取廣西白木香葉黃酮的工藝研究

黃惠芳，王麗萍，黃秋偉，檀小輝，曾黎明

(廣西壯族自治區亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001)

超聲提取廣西白木香葉黃酮的工藝研究

黃惠芳，王麗萍，黃秋偉，檀小輝，曾黎明

(廣西壯族自治區亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001)

探討白木香葉中黃酮的提取工藝，以廣西白木香葉為原料，通過單因素試驗，研究不同提取時間、超聲功率、乙醇濃度以及料液比對白木香葉黃酮提取率的影響，并采用正交試驗優化超聲提取白木香葉黃酮的工藝條件參數。結果表明，超聲提取白木香葉黃酮的最佳工藝條件為提取時間25 min 、超聲功率250 W、乙醇濃度80 %、料液比1∶40，在此條件下提取率為6.3096 %；超聲提取工藝優于常規提取工藝。

超聲提取；白木香葉；黃酮

白木香[Aquilariasinensis(Lour.) Spreng)] 是沉香屬瑞香科的植物，別稱沉香、土沉香、牙香樹等，是中國珍貴藥用植物，分布在我國海南、廣東、廣西、云南、福建等地區。白木香生長過程中受外界刺激會局部形成含黑色樹脂的樹材，可以入藥，是國產中藥沉香的唯一資源[1-2]。白木香葉為沉香的非藥用部分，白木香葉醇提取物具有鎮痛、抗炎、平喘、促進小腸運動、瀉下、止血、抗腦缺血缺氧、降血糖、抗腫瘤等活性[3-5]；同時，白木香葉茶具有理胃氣、潤腸通便、安神助眠、益氣益精等保健功效[6]。廣西是白木香的重要產區，白木香的生理生化特性會因地區有差異，這種差異不僅表現在沉香的品質上，白木香葉中的活性成分含量也會因地理區域、氣候土質條件而表現出差異。白木香葉黃酮超聲提取工藝研究未見有相關報道，對廣西白木香葉黃酮的研究亦未見有研究報道。

植物中黃酮的提取方法常用的有回流加熱提取法、常規溶劑浸提法、微波輔助提取法、超聲輔助提取法等。超聲提取在中草藥有效成分提取工藝中具有提取率高、提取時間短和低溫提取有利于保護有效成分等簡單高效的優點而被廣泛使用[7-9]，采用單因素實驗與正交試驗研究超聲提取廣西白木香葉黃酮的最佳工藝，并采用AlC13比色法測定廣西白木香葉中黃酮含量，為白木香葉開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白木香葉采自廣西靈山縣武利鎮沉香種植基地。白木香葉于50 ℃恒溫鼓風干燥箱中干燥，粉碎，過40目篩，得白木香葉干粉，用于提取白木香葉黃酮。乙醇、氯化鋁、乙酸鈉采用國產分析純試劑，蘆丁：上海綠葉生物科技有限公司生產。

1.2 儀器與設備

超聲波細胞粉碎機KBS-250(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)，電子天平GR200(日本A&D有限公司)，FZ102微型植物粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；低速冷凍離心機DL-6000B(上海安亭科學儀器廠)，Lambda35紫外可見分光光度計(美國PerkinElmer公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 白木香葉黃酮提取方法 取粉碎后的沉香葉干粉，放進50 mL圓底玻璃離心管中，加入提取溶劑，置于超聲波粉碎儀中，離心管下部套入冷水浴中，設定超聲工作模式為超聲5 s，間歇5 s，設定超聲工作時間及超聲功率，超聲結束后取出冷水冷卻，6000 r/min冷凍離心20 min。取上清液，用60 %乙醇稀釋至適當濃度，于420 nm波長下測定吸收度，計算黃酮含量。

1.3.2 沉香葉黃酮的測定 采用AlC13比色法測定黃酮，黃酮類化合物的甲醇(或乙醇)溶液中加入三氯化鋁試劑時，能使黃酮的酚羥基離解或形成絡合物，導致光譜發生變化[10-11]。沉香葉中黃酮主要包括洋芹素-7，4，-二甲醚、木犀草素-7，3，4-三甲醚、 木犀草素-7，4，-二甲醚、芫花素、木犀草素、羥基芫花素等[5,12]，具有4-羰基和5-羥基結構，因此，本研究采用丁明玉等[13]的AlC13比色法分析白木香葉黃酮含量。取1 mL樣品溶液于10 mL容量瓶中，加2 mL 0.1 mol/L AlCl3溶液和 3 mL 1 mol/L NaAc溶液，用 60 %乙醇定容至刻度，空白對照中加入同樣體積的反應液，不足部分以60 %乙醇補足，搖勻后于室溫下反應20 min，以蘆丁為標準品，在420 nm 處測定吸收度，通過回歸方程計算樣品中黃酮含量，從而計算出樣品中黃酮百分含量，計算公式如下：

式中，C：提取液中黃酮含量(mg)，V1：總樣品體積(mL)，W：樣品重量(g)，V2：測定樣品體積(mL)，N：稀釋倍數。

1.3.3 標準曲線的繪制 精密稱取蘆丁標準品 20 mg，置 100 mL容量瓶中，用60 %乙醇定容至刻度，搖勻，作為標準液。精密吸取標準液0.25，0.5，0.75，1.0，1.25，1.5 mL 分別置 10 mL容量瓶中，分別加入2 mL 0.1 mol/L AlCl3溶液和 3 mL 1mol/L NaAc溶液，用 60 %乙醇稀釋至刻度，空白對照加入2 mL 0.1 mol/L AlCl3溶液、3 mL 1mol/L NaAc溶液和60 %乙醇5 mL，在室溫下反應20 min，于420 nm 波長處測定吸收度(OD420)。

1.3.4 乙醇濃度對白木香葉提取率的影響 準確稱取1.0 g粉碎后的白木香葉干粉，放進50 mL圓底玻璃離心管中，加入不同濃度乙醇30 mL，試驗不同乙醇濃度對白木香葉黃酮提取率的影響，乙醇濃度為50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、100 %，超聲提取15 min，超聲功率250 W。冷凍離心后取上清液測定OD420，計算樣品中黃酮含量。

1.3.5 提取時間對白木香葉黃酮提取率的影響 準確稱取1.0 g粉碎后的白木香葉干粉，放進50 mL圓底玻璃離心管中，加入80 %乙醇30 mL，試驗不同超聲提取時間對沉香葉黃酮提取率的影響，超聲提取時間分別為5、10、15、20和25 min，超聲功率250 W。冷凍離心后取上清液測定OD420，計算樣品中黃酮含量。

1.3.6 超聲功率對白木香葉黃酮提取率的影響 準確稱取1.0 g粉碎后的白木香葉干粉，放進50 mL圓底玻璃離心管中，加入80 %乙醇30 mL，超聲提取15 min，試驗不同超聲提取功率對白木香葉黃酮提取率的影響，超聲功率分別為50、100、150、200和250 W。冷凍離心后取上清液測定OD420，計算樣品黃酮含量。

1.3.7 料液比對白木香葉黃酮提取率的影響 準確稱取1.0 g粉碎后的白木香葉干粉，放進50 mL圓底玻璃離心管中，加入不同倍數的80 %乙醇，試驗不同倍數溶劑對白木香葉黃酮提取率的影響，80 %乙醇用量分別為20、25、30、35和40倍。超聲提取15 min，冷凍離心后取上清液測定OD420，通過回歸方程計算樣品中黃酮含量。

1.3.8 正交試驗設計 在單因素實驗的基礎上，選取乙醇濃度(A)、提取時間(B)、超聲功率(C)以及溶劑倍數(D)進行四因素三水平的正交試驗，因素水平設定如表1所示。

1.4 統計分析

數據采用Excel 2010進行數據分析、制圖，采用正交試驗助手對數據進行直觀分析及正交試驗方差分析，同時采用SPSS 17.0軟件進行差異顯著性檢驗(Duncan’s新復極差法)。

表1 正交試驗設計因素與水平

2 結果與分析

2.1 黃酮標準曲線

以OD420為橫坐標，蘆丁標準品濃度為縱坐標作圖，得回歸方程為：y=0.3304x+0.0084，R2=0.9991。

2.2 超聲提取時間對白木香葉黃酮提取率的影響

超聲提取時間在5～25 min時，白木香葉黃酮提取率逐漸增大，5～10 min增幅十分明顯，提取時間增加到30 min時，提取率有所下降(圖1)。這是由于提取剛開始時，超聲波對細胞壁的破碎不充分，細胞內黃酮沒有充分溶解在溶液中，提取時間達到10 min后，細胞中的黃酮基本解離出來。進一步延長超聲提取時間，黃酮提取率增加幅度逐漸趨于穩定，至30 min時提取率略有降低，可能是超聲時間過長導致溶出的有效成分被分解所致。在實際生產中，增加超聲提取時間會延長生產周期，增加生產能源消耗，提高生產成本，還可能引起活性成分被氧化分解，從而導致提取率降低、產品收率降低，最終降低產品品質。

2.3 乙醇濃度對白木香葉黃酮提取率的影響

在乙醇濃度為50 %～80 %時，隨著乙醇濃度提高，白木香葉黃酮提取率逐漸提高，超過80 %，進一步提高乙醇濃度，黃酮提取率下降(圖2)。這是因為醇-水濃度變化會引起溶劑極性的變化，從而導致黃酮類物質的溶解率也發生變化，且過高乙醇濃度容易引起蛋白質凝聚作用，滯留在顆粒內部孔道中，使組織的微孔堵塞，增加了黃酮類化合物擴散的阻力，同時水分減少也削弱了對細胞的溶脹能力。因此乙醇濃度增加到一定程度，黃酮溶出率會反而減少，提取率降低。

圖1 超聲提取時間對黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic extraction time on extraction yield of flavonoids

2.4 超聲提取功率對白木香葉黃酮提取率的影響

超聲功率在50～200 W時，白木香葉黃酮提取率也逐漸提高(圖3)。其原因在于超聲功率過低，細胞破碎率不足，黃酮溶出不充分，導致提取率偏低，而隨著超聲功率的提高，細胞破碎完全，黃酮已基本溶出，提取率趨于穩定。

2.5 料液比對白木香葉黃酮提取率的影響

當提取溶劑在1∶20～1∶30倍時，隨著溶劑用量的增加，黃酮的提取率明顯增加(圖4)。這是因為溶劑的用量越大，黃酮溶解越充分，提取率就越高。當提取溶劑為30倍之后提取率的增加速率趨于平緩。這是因為當溶劑的用量達到一定程度時，溶劑已將有效成分基本溶出，使得率趨于穩定，即使增加溶劑用量，黃酮提取率也不會有明顯變化。同時，溶劑用量的增加，會導致生產成本增大，也會增加后續濃縮工藝的能耗成本。

圖2 乙醇濃度對黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of flavonoids

圖3 超聲提取功率對黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic extraction power on extraction yield of flavonoids

圖4 料液比對黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ratio of material to liquid on extraction yield of flavonoids

2.6 正交試驗優化超聲提取工藝

為全面研究超聲提取白木香葉黃酮各因素對白木香葉黃酮提取率的的影響，在單因素試驗結果的基礎上設計了正交試驗對提取工藝進行優化，以確定白木香葉黃酮提取的最佳工藝條件。

由表2～3可以看出，在實驗選定因素水平范圍內，選擇的4個因素對白木香葉黃酮提取率的影響程度由大到小依次為A乙醇濃度﹥C超聲功率﹥D料液比﹥B超聲時間，且4個因素對白木香葉黃酮提取率的影響均不顯著(α=0.05)。由于A因素，均值K2>K1>K3；B因素，均值K3>K2>K1；C因素，均值K3>K2>K1；D因素，K3>K2>K1；所以得出超聲提取白木香葉黃酮的最佳工藝參數組合為A2B3C3D3，即乙醇濃度80 %，超聲提取時間25 min，超聲提取功率250 W，料液比1∶40。

2.7 驗證及對比實驗

為了驗證工藝組合A2B3C3D3是否最佳，故確定乙醇濃度80 %，超聲提取時間25 min，超聲提取功率250 W，料液比1∶40，在此條件下對白木香葉黃酮進行3次超聲萃取，提取率分別為6.3059 %、6.2894 %和6.3334 %，平均提取率為6.3096 %。此結果大于正交試驗任意組提取率，說明正交試驗結果可靠，即工藝組合A2B3C3D3為最佳工藝條件。為了比較超聲提取工藝與常規提取工藝，采用以下兩種常規方式提白木香葉黃酮：①室溫下在白木香葉粉中加入40倍80 %乙醇浸提24 h，重復3次，黃酮提取率為(5.6508±0.0458) %；②在白木香葉粉中加入40倍80 %乙醇，在熱水浴中回流提取1.5 h,重復3次，黃酮提取率為(5.5003±0.0191) %。兩種常規工藝黃酮提取率均低于超聲提取白木香葉黃酮的提取率。

表2 正交實驗結果及直觀分析

表3 方差分析

3 討論與結論

本研究在超聲提取廣西白木香葉黃酮的單因素試驗中：①試驗選取超聲提取時間為5～30 min，在5～25 min時，沉香葉黃酮提取率逐漸增大，5～10min增幅十分明顯，提取時間增加到30 min時，提取率有所下降；②在乙醇濃度為50 %～80 %范圍內，隨著乙醇濃度提高，沉香葉黃酮提取率逐漸提高，進一步提高乙醇濃度，乙醇濃度在80 %～100 %范圍內，黃酮提取率下降；③超聲提取功率在50～200W范圍，白木香葉黃酮提取率隨功率增加也逐漸提高，并趨于穩定；④當料液比為1∶20～1∶30倍時，隨著溶劑用量的增加，黃酮的提取率明顯增加，當提取溶劑30倍之后提取率的增加速率趨于平緩。在正交試驗中，在實驗選定因素水平范圍內，選擇的四個因素對白木香葉黃酮提取率的影響程度由大到小依次為：乙醇濃度﹥超聲功率﹥料液比﹥超聲時間；且四個因素對白木香葉黃酮提取率的影響均不顯著。正交試驗最佳工藝參數條件下(乙醇濃度80 %，超聲提取時間25 min，超聲提取功率250W，料液比1∶40)，超聲提取廣西白木香葉黃酮的平均提取率為6.3096 %，均高于兩種常規工藝黃酮提取率。

[1]張玉臣，周再知，梁坤南，等. 珍貴樹種白木香研究現狀與展望[J].安徽農業科學，2010,38(3)：1531-1534.

[2]賈文杰,李恩香,楊柏云,等.白木香遺傳多樣性研究[J],熱帶亞熱帶植物學報,2010,18(2)：159-164.

[3]吳秀榮,李紅念,梅全喜,等. 沉香葉與沉香藥材平喘作用的對比研究[J].今日藥學，2013，23(6)：346-347.

[4]陳地靈，吳 祎，林 勵，等. 沉香茶提取物的體外抗氧化和體內降血脂作用評價[J].現代食品科技,2013,29(6)：1198-1202.

[5]王紅剛,周敏華,路晶晶,等. 沉香葉抗腫瘤活性化學成分研究[J].林產化學與工業,2008,28(2)：1-5.

[6]李紅念,江展增,梅全喜. 沉香葉茶與沉香藥材促進小腸推進作用的對比研究[J].亞太傳統醫藥,2013,9(6)：24-25.

[7]韓秋菊,馬宏飛,李寧豫. 3種方法提取枸杞黃酮效果的比較[J].江蘇農業科學，2013，41(2)：271-273.

[8]張素斌,廖燕婷. 4種甜蕎麥黃酮提取方法的比較研究[J].食品與機械，2012,28(6)：150-153.

[9]陶亮亮，馬 雄，丁雷濤，等. 超聲輔助提取杜仲葉中黃酮的工藝研究[J].江蘇調味副食品，2011,28(1)：7-10.

[10]楊 悠，許 軍，劉燕華，等.比色法測定白花蛇舌草中總黃酮含量的研究[J].中華中醫藥學刊，2011，29(2)：310-316.

[11]裴詠萍，李維林，張涵慶.三氯化鋁比色法測定中藥中總黃酮含量的方法改進[J].現代中藥研究與實踐,2009,23(4)：58-60.

[12]聶春曉,宋月林,陳 東,等. 白木香葉化學成分的研究[J].中國中藥雜志,2009,34(7)：858-860.

[13]丁明玉,趙紀萍,李擎陽. 貫葉金絲桃提取物中總黃酮的測定方法[J].分析實驗室，2011，20(6)：45-47.

(責任編輯 王冠玉)

Ultrasonic Extraction Technology of Flavonoids from Leaves ofAquilariasinensisin Guangxi

HUANG Hui-fang, WANG Li-ping, HUANG Qiu-wei, TAN Xiao-hui, ZENG Li-ming

(Guangxi Subtropical Crops Research Institute, Guangxi Nanning 530001, China)

In order to study extraction technology of flavonoids from the leaves ofAquilariasinensis, the influence of different extraction time, ultrasonic power, concentrations of ethanol and material to liquid radio on flavonoids extraction yield was evaluated using single-factor experiment method with leaves ofAquilariasinensisin Guangxi as raw materials. Then the orthogonal experimental design was used to optimize ultrasonic extraction parameters. The results showed that the best conditions for ultrasonic extraction of flavonoids from the leaves ofAquilariasinensiswere as follows:extraction time of 25 min, ultrasonic power of 250W, ethanol concentration of 80 % and material to liquid ratio of 1∶40. The yield of flavonoids was 6.3096 % under the best conditions. The ultrasonic extraction process is superior to the conventional extraction.

Ultrasound extraction; Leaves ofAquilariasinensis；Flavonoids

1001-4829(2016)10-2366-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.10.021

2016-04-01

廣西亞熱帶作物研究所專項資金項目(桂熱研201304，桂熱研201408)

黃惠芳(1969-)，女，廣西博白人，研究員，主要從事天然產物研究， E-mail：hhuif@126.com。

S567.19

A