大蒜葉凝集素基因ASAL的克隆與表達載體的構建

陳德西，何忠全，向運佳，胡榮平

(四川省農業科學院植物保護研究所，農業部西南作物有害生物綜合治理重點實驗室，四川 成都 610066)

大蒜葉凝集素基因ASAL的克隆與表達載體的構建

陳德西，何忠全*，向運佳，胡榮平

(四川省農業科學院植物保護研究所，農業部西南作物有害生物綜合治理重點實驗室，四川 成都 610066)

大蒜葉凝集素基因(Alliumsativumleaf agglutinin,ASAL)是一種高活性的凝集素基因，且具顯著的抗蟲性。克隆大蒜ASAL基因將為其在轉基因作物中抗蟲特性研究奠定基礎。本文以GenBank 公布的ASAL基因序列設計特異引物，采用 RT-PCR 法從當地大蒜品種二水早和新都軟葉的幼苗中克隆ASAL基因。結果表明，克隆的兩個ASAL基因與已知基因的堿基序列相似性分別為98.7 % 和98.9 %，氨基酸序列相似性為98.3 %。將其亞克隆至表達載體中，經菌落 PCR 和酶切鑒定，成功構建了重組質粒。將該載體導入農桿菌EHA5ɑ進行保存。

ASAL基因；刺吸式害蟲；基因克隆；表達載體；構建

植物凝集素是來源于植物的一類能凝集細胞和沉淀單糖或多糖復合物的非免疫來源的非酶蛋白質。其研究始1888年，距今已有120多年的歷史。1982年Hoffman等[1]克隆出了第一個凝集素基因為菜豆凝集素基因(pha)，目前已經分離出多種如豌豆凝集素 (Pea lectin,PL)、雪花蓮凝集素 (Galanthus nivalis agglutinin,GNA)、麥胚凝集素 (Wheat germ agglutinin,WGA)、半夏凝集素 (Pinellia ternata agglutinin，PTA) 等植物外源凝集素基因[2]。由于植物凝集素對于單糖或糖復合物特異性結合的能力，在信號轉導、免疫反應、植物防御等諸多信號過程中均具有重要作用；同時也具有細胞凝集、抗病毒、抗真菌及誘導細胞凋亡或自噬等多種能力，因此在生命科學、醫學及農業等諸多方面有較好的研究價值和應用前景。其中在害蟲防治方面，植物凝集素具有對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目特別是對同翅目蚜蟲、飛虱、葉蟬等刺吸式口器害蟲及一些微生物有防效[3-7]，同時具有對環境無污染，穩定性好及對高等動物相對安全等優點，因此，通過轉基因技術利用植物凝集素基因來防治病害獲得抗性品種已成為研究熱點。成功用于植物抗病蟲害基因工程的植物凝集素基因有雪花蓮凝集素基因、豌豆凝集素基因、麥胚凝集素基因、大蒜葉片凝集素基因等，這些大都為單子葉甘露糖結合凝集素。其中雪花蓮外源凝集素、豌豆外源凝集素和大蒜葉片凝集素(ASAL)對哺乳動物的毒性低，對害蟲卻有極強的抑制作用而倍受青睞。到目前為止，油菜、番茄、水稻、甘蔗、甘薯、向日葵、煙草、馬鈴薯、大豆和葡萄等多種植物獲得了轉GNA基因抗蟲植株，均表現出一定的抗蟲性，該基因在后代中能穩定遺傳，符合孟德爾遺傳規律。近年來發現ASAL在濃度比GNA低100～400倍時，即0.0025 %(w/v)，即可影響刺吸式口器昆蟲的生長和繁殖能力[8]。ASAL對褐飛虱和大葉青蟬致死率高于GNA，在轉基因水稻中與對照相比死亡率分別高達83 %和84 %；GNA對白背飛虱更有效果，致死率達90 %[9-11]。

ASAL基因是來自大蒜葉片的一種植物凝集素基因，其包含546 bp 開放閱讀框，編碼110個氨基酸殘基，蛋白分子量為25 kDa，序列與GNA高度相似。ASAL只是中等豐度的蛋白，但通過凝集素與兔血清分析實驗表明，ASAL活性比來自大蒜球莖的凝集素ASAI高50倍。大蒜凝集素(ASAL)對人體腫瘤細胞有較強的毒害作用，能強烈抑制腫瘤細胞的生長和DNA合成，并誘發其凋亡，增強人體自身免疫功能。ASAL通過獨特的結合昆蟲上皮細胞，抑制昆蟲中腸營養的攝取，其上的受體細胞也被鑒定出。ASAL凝集素這種受體-配體能力與殺蟲劑的特征相關，在昆蟲的內臟也十分穩定。ASAL基因在CaMV35S啟動下表達的煙草中，檢測有2 %總溶解蛋白，轉基因煙草減少蚜蟲的存活和育性分別為17 %和34 %[12]大大高于轉GNA煙草[13]；同樣，芥菜蚜蟲吃食了轉ASAL基因的芥菜植株，死亡率達到89 %，育性減少60 %～64 %[14]；轉ASAL基因的水稻使褐飛虱(BPH)死亡率達到36 %和綠葉蟬(GLH)死亡率達到32 %，褐飛虱和綠葉蟬育性分別減少59.5 % 和70.5 %，比轉GNA的植株BPH 和 GLH 存活率降低近10 %[15]。

目前，我國轉ASAL基因作物報道十分少見，本項目通過克隆并構建該基因的合適的表達載體，以便該基因在轉基因作物中廣泛應用，提高植物的抗蟲性和減少病毒對作物的危害，減少農藥的施用量、保護有益昆蟲、減輕對環境的污染。

1 材料與方法

1.1 供試材料

大蒜品種為二水早、新都軟葉。克隆載體pMD 20-T購自寶生物；大腸桿菌DH 5a、根癌農桿菌EHA105和植物表達載體Pzh01為本實驗室保存。限制性內切酶、T4 DNA 連接酶、Taq酶購自TaKaRa公司；TRIzol試劑購自Invitrogen公司,其余試劑均為國產或進口分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取 蒜苗長至3葉1心時，取干凈的葉片用鋁箔包好，液氮速凍，放-80 ℃保存。大蒜總RNA的提取采用TRIzol試劑進行植物總RNA提取，按試劑盒的說明書進行操作。利用寶生物公司的Kit反轉錄試劑盒，合成cDNA第一鏈。

1.2.2ASAL基因克隆 根據已知大蒜的cDNA克隆 (Smeets et al. 1997a[16]，登陸號：No. AY866499)設計引物。上游引物為BamHI-d:5′GGATTCATGG GTCCTACTACTTCATCTCCT3′下游引物EcoRI-d:5′GAATTCTCAAGCAG CACCGGTGCCAACCTT 3′和SacI-d:5′ GAGCTCTCAAGCAGCA CCGGTGCCAACCTT 3′，分別加酶切位點為BamH I、EcoR I和SacI。引物由上海捷瑞生物有限公司合成。先進行大蒜ASAL基因的CDNA合成，按逆轉錄試劑盒進行。隨后進行PCR反應，體系為： cDNA 2μl，dNTP Mixture 各2.5 mM，正反引物10 μΜ各1μl溶液10×LA PCR Buffer II(Mg2+)5 μl，TaKaRa LATaq(5 U/μl)0.5 μl，用去離子水補足50 μl。PCR擴增程序為94 ℃變性5 min，94 ℃變性45 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，進行32個循環，最后72 ℃延伸10 min。PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠檢測。

1.2.3 凝集素基因的克隆及鑒定 擴增產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳后，并按DNA凝膠回收試劑盒E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit回收純化，與pMD20-T載體連接，轉化至感受態DH5a中，挑取單菌落，在含有X-Gal、IPTG、Amp的瓊脂平板培養基上培養37 ℃倒置培養過夜。用載體引物做菌落PCR檢測，將陽性轉化子送至上海英俊生物技術有限公司進行測序。

1.2.4 數據處理 采用DNAMAN軟件，對所克隆的基因序列進行氨基酸序列比對。

1.2.5 植物表達載體pzH01-ASAL的構建 以測序后的pMD20-T重組質粒和pZH01載體為模板，用EcoR I進行單酶切，利用產物純化試劑盒純化后再用BamH I再次進行酶切，電泳后切膠，用膠回收試劑盒回收ASAL基因片段和pZH01載體片段。

將以上2種處理好的回收產物在T4連接酶作用下進行連接并用連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，然后用40 mg/L卡那霉素的LB平板培養篩選單菌落。挑選轉化后形成的單菌落，用小量提取試劑盒小量提取質粒，用酶切和PCR檢測，得到陽性克隆。并將最終獲得的ASAL基因的重組子命名為pzH01-ASAL。通過熱激法將其轉入農桿菌EHA5ɑ中。

M為DL2000；1和2為大蒜總RNA M:Marker DL2000;1,2:Toltal RNA of garlic leaf圖1 大蒜總RNA Fig.1 Total RNA of garlic leaves

2 結果與分析

2.1 總RNA質量檢測

提取總RNA之后，經分光光度計和凝膠電泳分析，總RNA電泳檢測(圖1)所示，從圖1可以看出，28SrRNA和18SrRNA條帶清晰，總RNA純度較高而且沒有發生嚴重降解。可用于RT-PCR實驗。根據大蒜ASAL cDNA序列合成的引物PCR反應后得到一段長約560 bp的DNA片段，如圖2所示。

2.2 目的基因片段的克隆與測序

RT-PCR產物切膠回收后，將目的片段連接到PMDTM-20載體上，以重組質粒為模板，以特異性序列為引物經PCR擴增可得一條長約560 bp的片段，表明PMD-ASAL中有完整的ASAL片段。經過測序，發現其與Genebank中報道的大蒜ASAL基因比對結果發現二水早和新都軟葉的堿基序列同源性達到99.8 %，而與NCBI數據庫提交的ASAL堿基序列的相似性分別為98.7 % 和98.9 %(圖3)，氨基酸序列比對結果表明二水早和新都軟葉的氨基酸相似性達到100 %，與已知ASAL氨基酸的相似性達到98.3 %，主要的不同體現在第33位的氨基酸由已知的纈氨酸變為亮氨酸，第168位的賴氨酸變為天冬酰胺，第169位的天冬氨酸變為纈氨酸。基因的cDNA序列同源性為98.64 %(圖4)。

M為DL2000；1,5為RT-PCR擴增的片段M：DL2000;1,5:The amplified RT-PCR fragments圖2 RT-PCR 的ASAL產物Fig.2 RT-PCR product of ASAL by agarose gel electrophoresis

圖3 已知ASAL基因序列與大蒜二水早和新都軟葉的ASAL DNA序列比對Fig.3 Known ASAL gene DNA sequence alignment with the ASAL gene from the Ershuizao and Xindu soft leaf

圖4 已知ASAL蛋白與大蒜二水早和新都軟葉的ASAL氨基酸序列比對Fig.4 Comparison of the known amino acid sequences with the cloned ASAL sequences from the Ershuizao and Xindu soft leaf

2.3 構建植物表達載體pzH01-ASAL

選擇常用的植物表達載體pzH01，首先用EcoR I和BamH I切除其GUS基因(圖5)，然后用已獲得的ASAL基因的cDNA片段進行替換，最終構建出一個以CaMV35S啟動子調控的ASAL基因的植物表達載體pzH01-ASAL(圖6)，酶切鑒定。

3 討 論

害蟲是造成農林業減產的重要因素之一，過多的噴施化學農藥不僅會造成環境污染，且害蟲及容易產生抗性。生物殺蟲劑成本較高，見效慢。轉基因抗病蟲作物的出現為人們防治植物病蟲害開拓了新的思路。植物凝集素對鱗翅目特別是同翅目蚜蟲、飛虱、葉蟬等刺吸式口器害蟲及一些微生物有明顯的致死作用，減少蟲傳病毒且具有對環境無污染、穩定性好及對高等動物相對安全等優點，成為目前的重要研究對象。

大蒜RNA的提取較水稻和玉米等禾本科植物的提取棘手，因為里面含有大量的蛋白和多糖，葉片細胞破粹后，多糖會與RNA提取時所用變性劑形成難溶的膠狀物與RNA共沉淀，而且多糖會抑制許多酶的活性，不利于后續分子生物學實驗。我們試過的幾種試劑盒包括Total RNA提取試劑(TaKaRa RNAiso Reagent)、BIOROL Reagent和TRIZOL Reagent, 效果都不理想，都存在沉降過程中有難溶的膠狀物與RNA共沉淀。后來針對TotalRNA提取試劑配合使用去除多糖的RNAiso PLUS，仍然有難溶的膠狀物與RNA共沉淀。利用TRIZOL Reagent提取3葉1心的大蒜葉片并改進了沉降方法，即加糖原后由異丙醇和RNA沉降劑沉降，提取效果大為改觀，質量才能滿足后續實驗。因此在大蒜葉片RNA提取應該采用幼嫩葉片和合適的RNA沉降方法，才能獲得好的提取效果。

M為DL2000;1為未切的質粒;2～9為已切開的質粒M:Maker DL2000;1 was not digested by enzyme;2-9 were the digested plasmids 圖5 載體PZH01被BamH I和EcoR I雙切Fig.5 Vector PZH01 was digested by enzyme BamH I and EcoR I

圖6 pzH01-ASAL的表達載體圖譜Fig.6 Expression vector map of pzH01-ASAL

在大蒜ASAL基因的克隆過程中，筆者至少設計了8對引物，多數擴增的效果不理想，為多條帶。后來通過加酶切位點，PCR的擴增效果才得以改善。本研究構建了含ASAL基因的植物表達載體Pzh01-ASAL，其含有 CaMV35S 啟動子、ASAL基因、終止子表達單元和一個 CaMV35S 啟動子驅動的HPT篩選基因。近年來，許多凝集素基因的成功克隆及成功轉至水稻，小麥，玉米等作物中，培育出了新的抗蟲植株，突顯了凝集素蛋白在作物育種方面重要的應用價值[16]。本研究對我國大蒜本土品種的大蒜凝集素基因進行克隆，并構建了其植物表達載體，為深入研究大蒜葉凝集素的功能和進一步進行抗蟲基因轉化奠定了定了基礎。

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(責任編輯 陳 虹)

Cloning ofASALGene and Construction of Its Plant Expression Vector

CHEN De-xi, HE Zhong-quan*, XIANG Yun-jia, HU Rong-ping

(Institute of Plant Proteciton, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Southwest,Minsitry of Agriculture,Sichuan Chengdu 610066,China)

ASALgene was a highly active gene in many plants and had high insect resistance. CloningASALgene isolated from garlic would lay the foundation for transgenic crops characteristic research in insect resistance. In this paper, a pair of specific primers was designed according to the sequence ofASALgene in GenBank, and using the total RNA of garlic seedlings of the local varieties Eershuizao and Xindu soft leaves as the templates, the complete cDNA sequences by RT-PCR were obtained. The results showed that the recombinant plasmids containingASALgene from Eershuizao and Xindu were similar to reach 98.7 % and 98.9 % respectively withASALgene in GenBank and the amino acid sequences were similar to reach 98.3 % .The recombinant plasmids were successfully constructed by PCR amplification and digestion with restriction endonucleases. The vectors were transformed into theAgrobactriumtumefaciensEHA5ɑ for preservation．

ASALgene; Sucking pest; Gene cloning；Plant expression vector; Construction

1001-4829(2016)10-2445-05

10.16213/j.cnki.scjas.2016.10.036

2015-09-15

國家科技支撐計劃西南稻區水稻重大病蟲防控技術研究與集成示范(2012BAD19B03-09)；四川省財政基因工程優秀論文基金項目(2011LWJJ-005)

陳德西(1977-)，女，四川大竹人，副研究員，主要從事植物分子病理研究，*為通訊作者,E-mail:zhquhe6868@sina.com。

S633.4

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