餐廚垃圾降解細菌的Biology鑒定及系統發育分析

陳澤斌，鄭 旴，夏體淵*，李 冰，徐勝光，任 禛，張永福，牛燕芬

(1.昆明學院農學院，云南 昆明 650214；2.云南省都市特色農業工程技術研究中心，云南 昆明 650214；3.中國科學院昆明動物研究所，云南 昆明 650223)

餐廚垃圾降解細菌的Biology鑒定及系統發育分析

陳澤斌1,2，鄭 旴1*，夏體淵1**，李 冰3，徐勝光1，任 禛1，張永福1，牛燕芬1

(1.昆明學院農學院，云南 昆明 650214；2.云南省都市特色農業工程技術研究中心，云南 昆明 650214；3.中國科學院昆明動物研究所，云南 昆明 650223)

采用Biology和16S rDNA序列分析法對2株餐廚垃圾降解細菌進行了鑒定。菌株經純化培養，提取基因組DNA，采用16S rDNA通用引物，進行了16S rDNA序列PCR擴增，擴增產物純化后進行測序，序列經人工校對后用Megalign 7.0軟件進行比對分析，構建系統發育樹，表明C95可能歸屬于蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)或寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)，C132歸屬于Pseudomonasputida。用Biology微生物鑒定系統進行了鑒定，確定C95為Ochrobactrumgrignonense，C132為Pseudomonasputida。

餐廚垃圾；降解；細菌；Biolog鑒定；系統發育分析

餐廚垃圾是指賓館飯店等餐飲業單位和企事業單位食堂以及家庭生活在食物加工和用餐過程中產生的食物下料和剩余食物，它是目前城市生活垃圾的主要來源，在有些城市餐廚垃圾的比例甚至高達50 %以上[1-4]。以上海為例，每天產生的餐廚垃圾約達1100 t，在春節期間至少還要增加50 %以上。目前餐廚垃圾的處理，主要采用填埋、焚燒、堆肥、熱解、蚯蚓床法處理，都不夠安全有效，在應用中也存在各自的局限性[5-6]。對于如何安全有效地處理餐廚垃圾，少數發達的大城市已經引起了足夠的重視，從環保和資源化的觀點出發，利用生物技術處理城市生活垃圾正漸漸受到了人們的青睞。

好氧降解是在通氣的條件下，以好氧微生物為主將大分子的餐廚垃圾分解為小分子的有機物，微生物吸收、利用中間的代謝產物合成自身的細胞物質，生長繁殖[7-10]。垃圾中微生物種群極其豐富，尤其是含有大量對難降解污染物具有強烈降解作用的降解型微生物，是優良的生物處理載體和復雜生物處理菌種的來源。人們已從垃圾填埋場中分離出高效纖維素分解菌、能降解DBP的菌株、具有明顯除臭效果的菌株等[11-12]。

前期研究以昆明學院潤澤苑教工餐廳的餐廚垃圾為對象，對餐廚垃圾的各組分進行了研究，采用多種培養基廣泛分離菌種，選取與餐廚垃圾各營養成分對應的選擇性培養基，進行定性初篩和定量復篩，通過測定液體培養48 h后的菌懸液OD600值比較其對蛋白質、脂肪、淀粉、纖維素的分解能力，得到了2株有效降解細菌株。接下來降解細菌的鑒定工作是今后進行擴大化培養的必要前提。細菌的常規鑒定依賴于形態特征觀察及生理生化測定，雖然方法準確可靠，但費時、費力。基于16S rDNA序列分析的分子生物學鑒定快速靈敏，但不能作為最終的鑒定依據，常用于目標菌的初步檢測[13]。

Biology全自動微生物自動鑒定系統Gen III微孔板可以對微生物進行94種表型測試，其中包括：71 種碳源利用測試(圖3)和23種化學敏感性測試(圖3)。它主要根據四唑類氧化還原染料的色度變化來指示微生物對碳源的利用程度和對化學物質的敏感程度。微生物在測試板上所顯示出的特定“表型指紋”被用來在種的水平上進行鑒定[14-15]。文章分別通過Biolog微生物鑒定系統及16S rDNA序列分析的方法對2株餐廚垃圾降解細菌進行了快速鑒定，以期為餐廚垃圾降解細菌劑的開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

餐廚垃圾降解細菌C95和C132為2014年從昆明學院潤澤苑教工餐廳的餐廚垃圾分離篩選所得，保存于昆明學院農學院植物生產試驗中心實驗室。

1.2 培養基

NA培養基用于供試菌株的復壯和純化培養，LB培養基用于提取DNA前的液體培養，BUG + B培養基用于Biology鑒定中菌株的培養。

1.3 試劑和PCR引物

BUG + B培養基、GEN III微孔板(MicroPlate)、濁度儀、8 通道電動移液器等均購自Biology公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、DNA Marker購自大連寶生物工程有限公司；Taq酶、dNTP、GoldView購自北京鼎國生物技術有限公司。細菌16S rDNA擴增通用引物[16]由上海桑尼生物科技有限公司合成(正向引物27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引物1492R:5’-AAGGAGGTGATCCACCC-3’)。

1.4 16S rDNA系統發育分析

用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver.2.0提取細菌基因組DNA，方法參見試劑盒說明書。PCR反應體系(50 μl)組成：10×PCR緩沖液5 μl，dNTPs (10 mmol/L) 4 μl，引物F27/R1492[16](10 μmol/L) 2 μl，模板DNA (約50 g/L) 1μl，Taq酶2.5 U，雙蒸水35.5 μl。PCR擴增按Sambrook方法進行[17]。擴增產物經TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0回收后，送上海桑尼生物科技有限公司進行序列測定。將測得的16S rDNA全序列用EzTaxon Server version 2.1(http://www.ezbiocloud.net/)進行同源性搜索[18]，下載相似序列作為參比序列。用Megalign 7.0軟件，將這些序列用Clustal W法進行多序列比對，構建系統發育樹。

1.5 Biology鑒定

試驗在云南農業大學農業生物多樣性應用技術國家工程研究中心完成。試驗程序按Biology公司GEN III的操作指南進行[19]，所有菌株在Biology推薦的培養基(BUG + B)上33 ℃培養24 h。按照操作規程將微生物細胞濃度調至90 %～98 %(T為Biology濁度儀所測得的透光率)，將菌懸液倒入V型加樣槽中，用8通道電動移液器按每孔100 μl的量將菌懸液按順序加入微孔板的所有孔中，33 ℃黑暗培養，24 h后記錄結果。所有菌株均采用OmniLog讀數儀讀板，讀數結果直接與數據庫進行比較獲得鑒定結果。

2 結果與分析

2.1 16S rDNA系統發育分析

將C95和C132在NA培養基復壯純化(圖1)，挑取單菌落在LB培養基中28 ℃液體培養12 h后，分別提取細菌基因組DNA，用通用引物27F/1492R對2株細菌的16S rDNA進行PCR擴增，得到1.5 kb的PCR產物，送測序后，將序列提交到GenBank核酸數據庫中，C95和C132登錄號分別為KP771804和KP771807。將其與12個相似參比菌株的16S rDNA序列(表1)進行多重序列對齊后，構建系統發育樹(圖2)和系統發育進化距離圖(圖3)。結果顯示，C95與KF844052Ochrobactrumpseudogrignonense、KJ784477Stenotrophomonasmaltophilia、FJ266319Ochrobactrumanthropi、AB680343Ochrobactrumsp.聚于同一系統發育分支，同源性均為100.0 %；C132與FJ588702Pseudomonasfluorescens聚于同一系統發育分支，同源性為99.9 %。通過分子生物學方法尚無法確定C95的分類地位，C95可能歸屬于蒼白桿菌屬 (Ochrobactrum)，也可能歸屬于寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)；將C132確定為熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)。

a:C95；b:C132圖1 供試菌株在NA培養基上的形態特征Fig.1 The morphology of strains on NA culture medium

種類Species菌株名稱Strainsname登錄號Accessionnumber國家CountryPseudomonasputidaKF715AB109776JapanPseudomonassp.BSw10041NFJ416144ChinaPseudomonasfluorescensHDY-8FJ588702ChinaOchrobactrumpseudogrignonenseNG-T7KF844052ChinaOchrobactrumsp.-AB680343JapanStenotrophomonasmaltophiliaRJ14KJ784477IndiaOchrobactrumanthropiRFNB9FJ266319KoreaOchrobactrumthiophenivoransNf17nrRHQ406743MexicoOchrobactrumgrignonenseIHBB1375GU186118IndiaOchrobactrumpituitosumSPT1-119aKF580852ChinaOchrobactrumrhizosphaeraePR17NR_042600USAOchrobactrumcytisiA6KF439830China

標尺為核酸替換率bar-subsitutions per nucleotide position圖2 基于16S rDNA序列的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence

圖3 系統發育進化距離Fig.3 Sequence distance based on 16S rDNA full-length sequence

2.2 Biology鑒定結果

GenIII Microplate測試布局見圖4，2株餐廚垃圾降解細菌在GenIII鑒定板上的測試表現見圖5。以A1孔為陰性對照對GenIII微孔板1～9列中的碳源利用情況進行測試。所有視覺上看起來與A1孔類似的反應定義為“陰性”反應(-)，看起來成紫色(深于A1)的定為“陽性”反應(+)。孔中所顯的顏色非常淺，或者有紫色的小色斑，或者有菌塊或其他塊狀物，則將其判定為“邊界值”()。以A-10孔為陽性對照對列10～12進行化學敏感性測試，所有顏色不到A10孔一半，且容易被該化學物質抑制的反應被定為“陰性”反應(-)，顯紫色或接近紫色(與A10孔類似)的反應被定為“陽性”反應(+)。統計結果見表2。

圖4 GEN Ⅲ微孔板布局Fig.4 The layout of GenIII microplate

a-C95；b-C132圖5 供試菌株在GEN Ⅲ鑒定板上的表現Fig.5 The performance of strains on GenIII microplate

微孔編號MicroporeNo.碳源CarbonsourcesC95C132A1陰性對照--A2糊精+A3D-麥芽糖+-A4D-海藻糖-A5D-纖維二糖-A6龍膽二糖\A7蔗糖-A8松二糖+-A9水蘇糖-A10陽性對照++A11pH6++A12pH5-+B1蜜三糖,棉子糖-B2α-D-乳糖-B3蜜二糖\B4β-甲酰-D-葡糖苷-B5D-水楊苷-B6N-乙酰-D-葡糖胺+-B7N-乙酰-β-D-甘露糖胺-B8N-乙酰-D-半乳糖胺+-B9N-乙酰神經氨酸-B101%NaCl++B114%NaCl++B128%NaCl--C1α-D-葡糖++C2D-甘露糖+C3D-果糖+C4D-半乳糖+C53-甲酰葡糖\C6D-果糖+C7L-果糖+C8L-鼠李糖+C9肌苷+C10乳酸鈉++C11梭鏈孢酸-+C12D-絲氨酸-+D1D-山梨醇+-D2D-甘露醇+-D3D-阿拉伯醇+-D4肌醇++D5甘油+

續表2 Continued table 2

微孔編號MicroporeNo.碳源CarbonsourcesC95C132D6D-葡糖-6-磷酸-D7D-果糖-6-磷酸\D8D-天冬氨酸-D9D-絲氨酸\D10醋竹桃霉素++D11利福霉素SV++D12二甲胺四環素--E1明膠-E2氨基乙酰-L-脯氨酸-E3L-丙氨酸++E4L-精氨酸++E5L-天冬氨酸++E6L-谷氨酸++E7L-組胺++E8L-焦谷氨酸-E9L-絲氨酸++E10林肯霉素,潔霉素++E11鹽酸胍++E12硫酸四癸鈉+F1果膠-F2D-半乳糖醛酸+F3L-半乳糖醛酸內酯+F4D-葡糖酸+F5D-葡糖醛酸++F6葡糖醛酰胺+F7粘酸;粘液酸+F8奎寧酸+F9糖質酸+F10萬古霉素++F11四唑紫++F12四唑藍++G1p-羥基-苯乙酸-+G2丙酮酸甲酯\G3D-乳酸甲酯-G4L-乳酸++G5檸檬酸-+G6α-酮-戊二酸++G7D-蘋果酸++G8L-蘋果酸++G9溴-丁二酸+G10萘啶酮酸-+G11氯化鋰+

續表2 Continued table 2

微孔編號MicroporeNo.碳源CarbonsourcesC95C132G12亞碲酸鉀++H1吐溫40\H2γ-氨基-丁酸++H3α-羥基-丁酸\H4β-羥基-D,L丁酸\H5α-酮-丁酸\H6乙酰乙酸+H7丙酸++H8乙酸++H9甲酸\H10氨曲南+H11丁酸鈉-H12溴酸鈉-

表3 供試菌株經Biology GEN III 微孔板鑒定結果

2個供試菌株的Biolog鑒定結果見表3，其中相似性(SIM)和位距(DIS)是2個重要的參數，表示測試結果與數據庫相應數據的匹配程度。SIM值越接近于1，鑒定結果的可靠性越強。通常在SIM值大于0.5時，就可以確定菌株的分類地位。從表3可以看出，2個供試菌株均得到了準確鑒定，均為革蘭氏陰性菌，C95為Ochrobactrumgrignonense，C132為Pseudomonasputida，相似性分別為0.624和0.612。

3 討 論

采用Biolog鑒定和16S rDNA序列分析法對2株餐廚垃圾降解細菌進行了鑒定，發現分子生物學方法有局限性，從系統發育樹(圖2)來看，C95與KF844052Ochrobactrumpseudogrignonense、KJ784477Stenotrophomonasmaltophilia、FJ266319Ochrobactrumanthropi、AB680343Ochrobactrumsp.聚于同一系統發育分支，同源性均為100.0 %，表明通過分子生物學方法尚無法確定C95的分類地位，C95可能歸屬于蒼白桿菌屬 (Ochrobactrum)，也可能歸屬于寡養單胞菌屬(Stenotrophomonas)，結合Biology鑒定結果，才將C95鑒定為Ochrobactrumgrignonense。由此可見，基于16S rDNA的分子生物學鑒定方法并不能完全作為細菌鑒定的依據，還有許多細菌不能用這種方法區分開。它在屬的水平上效果是比較好的，鑒定到種還需要其他生理生化方法和寄主分析來縮小鑒定范圍。Biology 細菌鑒定系統可以將細菌鑒定到種的水平[20]。兩者相互驗證，互相補充。隨著Biology 數據庫的增大和培養條件的優化，其鑒定結果會更加簡便與準確，GEN III微孔板在細菌的鑒定和分類中具有廣闊的應用前景。

C95和C132分別歸屬于Ochrobactrumgrignonense和Pseudomonasputida2類細菌都曾被報道具有降解活性，Pseudomonasputida可降解萘、苯酚、磷[21-23]；Ochrobactrum屬細菌可降解煙堿、石油、潤滑油、苯胺、喹啉、百菌清[24-26]，其生物學特性及對溫度、pH等條件是否具有比較廣泛的適應性將是下一步研究的重點。

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(責任編輯 王家銀)

Biology Identification and Phylogenetic Analysis of Efficient Bacteria for Aerobic Degradation on Kitchen Waste

CHEN Ze-bin1,2, ZHENG Xu1*, XIA Ti-yuan1**, LI Bing3, XU Sheng-guang1, REN Zhen1, ZHANG Yong-fu1, NIU Yan-fen1

(1.Agriculture College, Kunming University, Yunnan Kunming 650214, China;2.Engineering Research Center for Characteristics Agriculture of Yunnan Province, Yunnan Kunming 650214, China;3.Kunming Institute of Zoology, the Chinese Academy of Sciences, Yunnan Kunming 650223, China)

2 strains of efficient bacteria for the aerobic degradation on kitchen waste were identified by biology microbes identification system and 16S rDNA gene sequence analysis. After the genomic DNA was extracted, the sequences of 16S rRNA gene were amplified by PCR with the bacterium universal primers and the purified PCR products were directly sequenced. The corrected sequences were aligned with Megalign 7.0 and the phylogenetic tree was constructed. The results of phylogenetic analysis showed that the C95 belonged toOchrobactrumorStenotrophomonas; C132 belonged toPseudomonasputida. The results of biology tests showed that the 2 strains wereOchrobactrumgrignonenseandPseudomonasputida,respectively.

Kitchen waste; Degradation; Bacteria; Biology identification; Phylogenetic analysis

1001-4829(2016)10-2488-08

10.16213/j.cnki.scjas.2016.10.043

2015-03-29

云南省都市特色農業工程技術研究中心項目(TSNY0201)；云南省教育廳科學研究基金項目(2014Y390)；云南省應用基礎研究青年項目(2013FD040)；昆明學院人才引進項目(YJL14005)；昆明學院人才引進基金項目(YJL12010)；昆明學院校立重點基金項目(XJL12020)；昆明學院大學生科研項目(XJD15054)；云南中煙品牌省內原料產地生態與主栽品種合理布局研究項目；云南省高校優勢特色重點學科(生態學)建設項目資助(05000511311)；昆明市農業局滇池流域農業面源污染綜合防控對策研究(2016JC01)

陳澤斌(1985-)，男，云南昆明人，博士，副教授，主要從事環境微生物的教學及科研工作，E-mail:zbchenkmu@163.com，*為共同第一作者，**為通訊作者，E-mail:xiatiyuan@sohu.com。

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