左金方和5-FU對胃癌細胞生長及BAX/Bcl-2表達的調控研究*

周紅祖，周禹練，余惠旻△

(1.深圳市中醫院，廣東深圳 518020;2.深圳大學醫學院，廣東深圳 518060)

左金方和5-FU對胃癌細胞生長及BAX/Bcl-2表達的調控研究*

周紅祖1，周禹練2，余惠旻2△

(1.深圳市中醫院，廣東深圳 518020;2.深圳大學醫學院，廣東深圳 518060)

目的:研究左金方和5-FU單獨與聯合對人正常胃黏膜上皮細胞GES-1和人胃癌MGC803細胞生長及凋亡的影響及對BAX/Bcl-2蛋白表達水平的改變。方法:將不同濃度的左金方、5-FU及兩藥聯合作用于體外培養的人胃黏膜上皮細胞GES-1和人胃癌細胞MGC803，Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測細胞增殖率的變化，流式細胞儀檢測細胞凋亡，Western blot法檢測bcl-2、bax蛋白表達。結果:1.00 ug·mL－1左金方、50.00、100.00 ug·mL－15-FU作用GES-1細胞24 h后，細胞存活率分別為(107.54± 2.25)%、(53.67±1.91)%和(47.43±1.35)%，作用MGC803細胞24 h后，細胞凋亡率分別為(45.46±1.66)%、(37.02±1.68)和(45.60±1.14)%;左金方聯合5-FU(1.00+50.00)、左金方聯合5-FU(1.00+100.00)作用GES-1細胞24 h后，細胞存活率分別為(81.66±2.22)%和(78.68±2.10)%，作用MGC803細胞24 h后，相應的凋亡率為(61.30±1.71)%和(71.30±1.79)%，與單獨用藥比較差異有統計學意義。Western Blot凝膠電泳圖可以看出，左金方聯合5-FU(1.00+50.00)、左金方聯合5-FU(1.00 +100.00)作用MGC803細胞24 h后，進一步促進Bax的表達，降低Bcl-2的表達，與各單獨用藥組比較差異有統計學意義。結論:左金方與5-FU聯合用藥有大幅降低5-FU細胞毒性作用，顯著提高人正常胃黏膜上皮細胞GES-1的存活率;通過促進MGC803細胞中Bax蛋白的高表達和Bcl-2的低表達，促進人胃癌細胞的凋亡。

左金方;5-FU;GES-1;MGC803;聯合用藥;凋亡

胃癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一［1-2］，目前尚無廣泛治療作用的抗胃癌中藥制劑問世。左金方是出自《丹溪心法》的名方，目前臨床常用于急慢性胃炎和消化性潰瘍的治療［3］。近年來，研究還發現它具有抗腫瘤作用［4-5］。我們前期研究發現，左金方能誘導體外培養胃腺癌細胞的凋亡，顯著抑制了胃癌裸小鼠移植瘤的生長［6-8］。5-氟尿嘧啶(5-FU)是一種臨床治療胃癌常用的化療藥物，但因生物利用度低，對腫瘤細胞選擇性小、毒副作用大、治療劑量與中毒劑量接近等缺點，限制了其臨床應用。本研究在前期研究的基礎上，采用體外培養人正常胃黏膜上皮細胞GES-1和人胃癌細胞株MCG803的方法，探討左金方和5-FU單獨及聯合用藥對胃癌細胞增殖的抑制作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CO2培養箱(美國Shella公司);DC300型倒置熒光相差顯微鏡(德國Leica公司);超凈工作臺(比利時Esco公司);Rotofix32型離心機(德國Hettich公司);AllegraTM21R型低溫離心機(美國Coulter公司);Epics XL型流式細胞儀(美國 Coulter公司); Polar star Galaxy型酶標儀(德國BMG公司)。

1.2 主要藥物與試劑

黃連、吳茱萸均購自深圳華輝藥業有限公司，由深圳市中醫院中藥科劉志誠主任藥師鑒定，分別為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.的干燥根莖和蕓香科植物吳茱萸 Evodia rutaecarpa(Juss) Benth.干燥近成熟的果實。Cell Counting Kit-8 (CCK-8，日本同仁化學研究所Dojindo)、碘化丙啶(PI)、RNA酶(RNase)均購自美國 Sigma公司; DMEM培養基、胰酶(trypsin，美國Gibico公司);胎牛血清(FBS，美國 Hyclone公司);Hoechst 33258 (瑞士Fluka公司)，5-氟尿嘧啶(5-FU，天津金耀氨基酸有限公司，批號 1412011);Alexa FluorR 488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit (美 國Lifetechnology公司)。

1.3 細胞

人正常胃黏膜上皮細胞株GES-1和人低分化胃腺癌細胞系MGC803購自中山大學醫學院動物細胞中心(細胞源自美國ATCC細胞庫)。

2 方法

2.1 藥物制備

左金方傳統湯劑凍干粉由本實驗室提供，取黃連30 g、吳茱萸5 g加8倍蒸餾水浸泡30 min，加水煎煮3次，每次30 min過濾，合并3次濾液，冷凍干燥，每克干粉含生藥3.98 g。經HPLC法測定，左金方凍干粉中含小檗堿39.85%，巴馬汀9.19%，藥根堿4.86%，吳茱萸堿0.17%，吳茱萸次堿0.19%。將左金方凍干粉溶于去離子水中配置成1 mg/mL的母液，實驗時用細胞培養液稀釋成所需濃度。

5-FU的配制方法:取適量5-氟尿嘧啶注射液原液加細胞培養液配制成1 mg/ml母液，實驗時用細胞培養液稀釋成所需濃度。

2.2 細胞培養

GES-1人正常胃黏膜上皮細胞株、MGC803人胃腺癌細胞株在10%小牛血清DMEM培養液中，于37℃條件下，在濕度為100%、含CO2為5%(體積分數)的CO2培養箱中常規培養。

2.3 觀察指標與方法

2.3.1 CCK-8檢測細胞活性 取人正常胃黏膜上皮細胞GES-1對數生長期細胞，用DMEM培養基制成細胞懸液(5×104/mL)加入96孔板、100 μL/孔，培養12 h后給藥，實驗組分別加入不同濃度的供試藥物，分別培養24、48 h，向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，將培養板在培養箱內孵育4 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度(OD)。其中將未經處理的對照組細胞存活率設定為100%。細胞抑制率=(1－實驗組平均OD值/對照組平均OD值)× 100%。

2.3.2 流式細胞儀檢測 調整人胃腺癌細胞MGC803密度為2×105/mL，以1.5 mL/well種入6孔板，每組6個復孔。藥物作用24 h后，細胞刷刮取細胞，800 r/min離心5 min去上清，加入PBS重懸，調整細胞濃度為1×106/mL。取適量于流式管中，加入工作液500 uL，再加入熒光染料(10 uL Annexin V FITC和5uL PI混合液)，350目尼龍網濾膜過濾去除細胞團塊，室溫避光染色15 min后，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率(激發光波長用488 nm，用一波長為515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大于560 nm的濾器檢測PI)。測定數據按流式細胞儀所配置的軟件進行數據處理，以右下代表的早期凋亡率加上右上代表的中后期凋亡率的總和代表細胞調亡率。

2.3.3 Western blot檢測Bcl-2和Bax的表達

提取蛋白前將PMSF 10 μL加入1 mL細胞裂解液RIPA，取經藥物作用后細胞約2.4×106個加入RIPA，冰上裂解30 min，10000 r/min離心10 min取上清。BCA測定蛋白濃度，酶標儀測定波長為A562，根據標準曲線計算出蛋白濃度。灌制12%分離膠，4%濃縮膠的SDS-PAGE凝膠。吸取80 μg總蛋白，恒壓100 V電泳直到溴酚藍到達分離膠底部。濕法電轉恒壓100 V、120 min，將蛋白從SDSPAGE凝膠轉至PVDF膜。3%的脫脂奶粉/PBS-T封閉，按1∶500稀釋Rabbit anti-Bcl-2/-Bax，4℃孵育過夜。1∶3000稀釋二抗Goat anti-Rabbit IgG，孵育1 h，增強化學法(Enhanced Chemiluminescence，ECL)顯影，UVI凝膠成像系統攝像。

2.3.4 統計學方法 采用 SPSS 1010統計軟件進行統計分析，數據以均數±標準差 (±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 藥物對GES-1細胞存活率的影響

3.1.1 左金方對GES-1細胞存活率的影響CCK-8實驗結果顯示，左金方對GES-1細胞活力的影響很小，即當給藥濃度增加到一定程度后(如10 ug·mL－1)，隨著給藥濃度的增加、作用時間的延長，細胞活力稍有減弱。圖1顯示，小劑量的左金方能促進人正常胃黏膜上皮細胞的增殖和分裂，1.00 ug ·mL－1左金方作用GES-1細胞24、48 h的細胞存活率分別為(107.54±2.25)%和(115.96±2.86)%，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。

3.1.2 5-FU對GES-1細胞存活率的影響CCK-8實驗結果顯示，對照組細胞生長良好，5-FU對GES-1細胞活力的影響呈現“濃度-時間依賴性”的關系，即隨著給藥濃度的增加和作用時間的延長，細胞活力逐漸減弱，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。圖2顯示，小劑量的5-FU會對人正常胃黏膜細胞產生毒性作用，隨著用藥濃度增加其毒性亦增強。

圖1 不同濃度的左金方作用不同時間對GES-1細胞存活率的影響

圖2 不同濃度5-FU作用不同時間對GES-1細胞存活率的影響

3.2 藥物對MGC803細胞凋亡的影響

表1顯示，不同濃度左金方、5-FU作用于MGC803細胞24 h，腫瘤細胞中后期凋亡率隨給藥濃度的逐漸增高，給藥時間的延長而逐漸增大，以中后期細胞凋亡更為明顯，與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。

3.3 聯合用藥對GES-1和MGC803細胞生長的影響

3.3.1 聯合用藥對GES-1細胞存活率的影響 表2顯示，根據左金方與5-FU單獨用藥影響，GES-1和MGC803細胞生長的實驗結果，選定1.00 ug·mL－1為左金方，50.00、100.00 ug·mL－1為5-FU聯合用藥的濃度。聯合用藥的CCK-8結果顯示，1.00 ug·mL－1左金方與50.00、100.00 ug·mL－15-FU聯合用藥，可大幅度降低5-FU對細胞的毒性，提高人正常胃黏膜細胞的存活率，聯合用藥的效果與5-FU單獨用藥組比較差異有統計學意義(P＜0.05)。

3.3.2 聯合用藥對MGC803細胞凋亡的影響 圖3、4顯示，從流式細胞的檢測結果可以看出，1.00 ug·mL－1左金方分別與50.00 ug·mL－1、100.00 ug·mL－15-FU聯合用藥作用于MGC803細胞24 h后，細胞凋亡率大幅度提高(中后期凋亡占主導)，聯合用藥組與左金方和5-FU單獨用藥比較差異有統計學意義(P＜0.05)，即聯合用藥組誘導凋亡的作用優于各單獨用藥組。

表1 不同濃度藥物作用24 h對MGC803細胞凋亡率的影響(n=6)

表2 左金方與5-FU聯合用藥作用不同時間對GES-1細胞存活率的影響

3.4 左金方和5-FU單獨與聯合對人胃癌MGC803細胞BAX/Bcl-2蛋白表達的影響

Western Blot凝膠電泳圖顯示，1.00 ug·mL－1左金方、50.00 ug·mL－15-FU、100.00 ug·mL－15-FU分別作用于MGC803細胞24 h后，Bax的表達增加，而Bcl-2的表達減少;左金方聯合5-FU(1.00+ 50.00)、左金方聯合5-FU(1.00+100.00)用藥24 h后，Bax的表達進一步增加，而Bcl-2的表達進一步減少，與各單獨用藥組比較差異有統計學意義(P＜0.05);圖5顯示，左金方和50.00 ug·mL－15-FU對人胃癌MGC803細胞BAX/Bcl-2蛋白表達的影響。

4 討論

胃癌的發生是一個多因素、多步驟的復雜過程。早期胃癌多無癥狀或僅有輕微癥狀，當臨床癥狀明顯時病變已屬晚期，所以胃癌切除術后化療已成為晚期胃癌的主要治療方法［9］。常用的化療藥物有絲裂霉素(MMC)、順鉑(DDP)、氟脲嘧啶(5-FU)、足葉乙甙(VP-16)、阿霉素(ADM)、優福定(UFT)等。化療藥物在胃癌的治療中有一定的效果，但其具有嚴重的毒副作用，會產生明顯的消化道反應、骨髓抑制、身體虛弱、發熱、脫發、腎毒性、神經毒性和過敏反應等并發癥［10］。大量研究證實，中藥配合化療治療胃癌可明顯改變癥狀、增加有效率、延長生存期，防復發、抗轉移，平衡和調節機體內環境，提高和改善機體免疫能力，保護重要器官功能，減輕化療毒副反應，提高生存質量［11］。

圖3 各組Annexinⅴ/PI凋亡檢測圖

圖4 各組腫瘤細胞凋亡率

圖5 左金方和5-FU對人胃癌MGC803細胞BAX/Bcl-2蛋白表達的影響

本研究CCK-8結果顯示，左金方對人正常胃黏膜上皮細胞株GES-1活力影響很小，而小劑量的5-FU具有很明顯的細胞毒性。左金方與5-FU聯合用藥后，顯著提高人正常胃黏膜細胞GES-1的存活率，大幅降低5-FU的細胞毒性。流式細胞儀結果顯示，左金方與5-FU均能誘導胃癌細胞MGC803的凋亡，二者聯合用藥后，誘導胃癌細胞MGC803凋亡的作用優于左金方或5-FU單獨用藥。

細胞凋亡是目前腫瘤研究中的熱點之一，目前普遍認為凋亡與細胞分裂、細胞分化類似，受細胞內多種基因調控，是一個級聯式(cascade)基因表達的結果，bcl-2和bax的比率就成為細胞是否發生凋亡的關鍵因素［12］和評價藥物抗腫瘤的重要指標。大量的研究表明，抑制腫瘤細胞的凋亡是中藥治療腫瘤的重要機制。本研究中Western Blot凝膠電泳中Bax與Bcl-2蛋白表達的結果表明，左金方與5-FU聯合用藥，促進了MGC803細胞中Bax蛋白的高表達和Bcl-2的低表達，其作用優于單獨用藥。結合CCK-8和流式細胞儀的檢測結果說明，左金方與5-FU聯合用藥顯著提高人正常胃黏膜細胞GES-1的存活率，大幅降低5-FU的細胞毒性作用，并通過促進MGC803細胞中Bax蛋白的高表達和Bcl-2的低表達，促進胃腺癌細胞的凋亡。

臨床上依據腫瘤的組織分化(高分化、中分化和低分化)來判斷其惡性程度，高分化腫瘤惡性程度低、預后較好，低分化腫瘤惡性程度高、預后較差，中分化腫瘤介于二者之間。MGC-803細胞株屬于低分化胃腺癌細胞系，結合前期左金方誘導人胃腺癌細胞株SGC-7901(中分化)的研究［6-8］，本研究不僅為左金方誘導胃癌細胞的凋亡作用增添了新的實驗依據，也為拓展可用于臨床治療胃癌的中藥及其復方制劑、降低抗胃癌化療藥物的毒副作用、提高治療效果提供了新的思路。

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Regulation of Growth and BAX/Bcl-2 Expression of Human Gastric Cancer Cells by Zuojin Decoction and 5-FU

ZHOU Hong-zu1，ZHOU Yu-lian2，YU Hui-min2△
(1.Shenzhen Chinese Medicine Hospital，Guangdong Shenzhen 518020，China; 2.School of Medicine，Shenzhen University，Guangdong Shenzhen 518060，China)

Objective:to study the cell growth of Human Gastric Mucosal Epithelial Cell GES-1，the apoptosis of Human Gastric Carcinoma MGC803 and the changes of Bax/Bcl-2 in the level of protein expression caused by ZuoJinFang and 5-Fu separately and together.Methods:Human Gastric Mucosal Epithelial Cell GES-1 and Human Gastric Carcinoma MGC803 cells were cultured in vitro and treated by ZuoJinFang and 5-Fu with different concentration separately and together，the growth inhibitions of GES-1 cell were analyzed by Cell Counting Kit-8(CCK-8)，the apoptosis rates of MGC803 cell were studied by flow cytometry and the expressions of Bcl-2 and Bax protein were detected by Western blot.Results:After the cells treated by 1.00 ug·mL－1ZuoJinFang，50.00、100.00 ug·mL－15-FU for 24 h separately，the percentage of GES-1 cell viabilities were(107.54±2.25)%，(53.67±1.91)and(47.43±1.35)%，the percentages of apoptosis of MGC803 cell were(45.46±1.66)%、(37.02±1.68)and(45.60±1.14)%;after the cells treated by ZuoJinFang combined with 5-FU(1.00+50.00 or 1.00+100.00 ug·mL－1)for 24 h，the percentage of GES-1 cell viabilities were(81.66±2.22)%and(78.68±2.10)%，the percentages of apoptosis of MGC803 cell were(61.30± 1.71)and(71.30±1.79)%，the differences in comparison with ZuoJinFang and 5-Fu group separately were statistically significant.The Western Blot gel electrophoresis figures show that the expressions of Bax were further increased and the expressions of Bcl-2 were decreased accordingly after the MGC803 cells treated by ZuoJinFang combined with 5-FU(1.00 +50.00 or 1.00+100.00 ug·mL－1)for 24 h，the differences in comparison with ZuoJinFang and 5-Fu group separately were statistically significant.Conclusion:ZuoJinFang combined with 5-FU，greatly reduced the side effects of 5-FU，significantly increased the survival rates of the GES-1 cells，promoted the apoptosis of gastric carcinoma MGC803 cells by promoting high expression of Bax protein and low expression of Bcl-2 protein.

ZuoJinFang;5-FU;GES-1;MGC803;Drug conbibation;Apoptosis

R285.5

B

1006-3250(2016)06-0777-04

2015-10-12

廣東省中醫藥局項目(20141253)

周紅祖(1971-)，女，新疆人，副主任藥師，從事中藥腫瘤藥理學及中藥學基礎研究。

△通訊作者:余惠旻(1972-)，男，新疆人，醫學博士，從事中藥及其復方抗腫瘤的臨床與研究，Tel:0755-86671902，E-mail:yuhuimin@szu.edu.cn。