異丙腎上腺素聯合腹主動脈縮窄術誘導心力衰竭大鼠模型的建立

劉雪琴　蔣洪強　張金國

250100 濟南，山東大學醫學院(劉雪琴)；272029 濟寧，濟寧醫學院附屬醫院(蔣洪強，張金國)

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異丙腎上腺素聯合腹主動脈縮窄術誘導心力衰竭大鼠模型的建立

劉雪琴蔣洪強張金國

250100 濟南，山東大學醫學院(劉雪琴)；272029 濟寧，濟寧醫學院附屬醫院(蔣洪強，張金國)

【摘要】目的探討異丙腎上腺素(ISO)聯合腹主動脈縮窄術(AAC)誘導大鼠慢性心力衰竭模型的效果。方法將雄性SD大鼠分為5組，每組20只，分別為假手術、手術、聯合A[手術+ISO 1.0 mg/(kg·d)]、聯合B[手術+ISO 2.5 mg/(kg·d)]、ISO組[2.5 mg/(kg·d)]。聯合A、B術后1周后給予相關劑量的ISO，持續4周，假手術組除不結扎外，余與手術組相同。8周后，UCG監測舒張末期室間隔厚度(IVSd)，左心室舒張末期內徑( LVEDd)、左心室后壁厚度(LVPWd)、LVEF，隨后處死大鼠，計算左心質量指數(左心室重量/體質量比，LVW/BW)、全心質量指數(心臟重量/體質量比，HW/BW)，制作病理切片，經蘇木素-伊紅染色觀察心肌組織及纖維化程度。結果 與假手術組比較，聯合A、B組于術后6周出現尿量下降、呼吸急促、毛色暗淡、活動能力下降等表現，且聯合B組死亡率高達85%，其余各組未見明顯異常。術后8周聯合組IVSd、 LVEDd、LVPWd、LVEF指標與假手術組、手術組、ISO組比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。心臟解剖發現聯合A、B組HW/BW、LVW/BW明顯高于其他各組(P均<0.05)。病理結果顯示，聯合A、B組心肌細胞體積增大、排列紊亂，間質出血、纖維化明顯。結論ISO[1.0 mg/(kg·d)]聯合AAC可以在8周內成功建立慢性充血性心力衰竭模型，較單純AAC或ISO藥物造模效果更佳，同時此法簡單易行，為心力衰竭模型的制作提供一種新的思路，對心力衰竭機制的研究具有重大的意義。

【關鍵詞】腹主動脈縮窄術；異丙腎上腺素；慢性心力衰竭；大鼠

慢性心力衰竭是各種心臟疾患的最終歸宿，也是心內科最常見的死亡原因。根據歐洲心臟病學會最新統計，在歐洲47個國家近10億的人口中，至少有1 500萬慢性心力衰竭患者，還有1 500萬無癥狀的心功能不全患者[1]。美國心臟學會統計，當前美國慢性心力衰竭患者高達580萬，每年因心力衰竭而消耗的醫療費用高達390億美元[2]。在中國34～74歲年齡段，有超過400萬的心力衰竭患者，年病死率高達40%，同時心力衰竭的患者不斷增加，年增長率已達2.8%[3]。慢性心力衰竭在世界范圍內呈現擴大的態勢，死亡率不斷升高，給家庭乃至社會帶來巨大的經濟負擔。在研究慢性心力衰竭機制過程中，大鼠心力衰竭模型起到十分關鍵的作用。本研究探討異丙腎上腺素(ISO)聯合腹主動脈縮窄術(AAC)制作大鼠心力衰竭模型的效果，并與既往傳統的兩種常見模型制作方法比較，現將結果報告如下。

材料與方法

一、材　料

1.實驗動物

雄性大鼠100只(SD級，山東魯抗公司提供)，體質量270～310 g。100只大鼠分為5組，每組20只，分別為假手術、手術、聯合A[手術+ISO 1.0 mg/(kg·d)]、聯合B[手術+ISO 2.5 mg/(kg·d)]、ISO組[2.5 mg/(kg·d)]。

2.儀器和藥物

超聲診斷儀；6～12 MHz高頻線陣探頭；電子天平(0～1 000 g)；10%水合氯醛；青霉素(80萬單位/支，山東魯抗)；異丙腎上腺素(1 mg/支，上海禾豐)。

二、方　法

1.動物模型制備

大鼠術前禁食12 h，稱重，采用10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥固定于手術臺，腹中線周圍備皮、消毒、鋪巾，切口起自劍突下1 cm，沿腹中線分層切開皮膚、肌肉約2 cm，將盲腸擠出放在浸有生理鹽水的無菌紗布，保持濕潤。止血鉗鈍性分離腹主動脈、左腎動脈，于左腎動脈上方約1.5 cm處，穿一條4號手術線，用去尖磨鈍的7號針頭與腹主動脈平行放置，手術線將兩者一同結扎，隨后抽出針頭，剪掉線頭，內臟放回，分層關腹，術后給予腹腔注射青霉素(20萬單位/只)，連續3 d，常規喂養[4]。假手術組不結扎腹主動脈，余操作與手術組一樣。聯合組以及ISO組術后腹腔注射給予相應劑量ISO，連續4周，手術組以及假手術組給予相應劑量的生理鹽水。

2.心臟超聲動態監測

術后4周開始，每周利用UCG監測大鼠舒張末期室間隔厚度(IVSd)，左心室舒張末期內徑(LVEDd)、左心室后壁厚度(LVPWd)、LVEF等指標。

3.取材和病理分析

術后8周，大鼠稱重后處死，立即取出心臟，用冷鹽水充分清洗心臟，并用濾紙吸干心臟內外的水分后稱量，稱全心重量(HW)，隨后沿室間隔分離左心室，稱左心室重量(LVW)，計算心臟重量/體質量比(HW/BW)、左心室重量/體質量比(LVW/BW)。稱重后將心肌組織浸泡在多聚甲醛溶液(4%)中，常規固定、脫水、石蠟包埋、切片(厚度5 μm)、蘇木素-伊紅染色，最后放在顯微鏡下觀察。

三、統計學處理

結果

一、各組小鼠死亡數目以及死亡原因

假手術組2只均死于術后48 h，解剖可見腸梗阻。手術組6只死于3 d內，其中3只死于腸梗阻，3只死于急性心力衰竭。聯合A組2只死于麻醉劑量過大，2只死于腸梗阻，2只死于急性心力衰竭，1只死于腹腔感染。聯合B組3 d內死亡3只(腸梗阻)，后期注射ISO死亡15只(急性心力衰竭)，死亡率為85%。ISO組4只死于急性心力衰竭。

二、各組小鼠血流動力學指標比較

術后8周聯合組IVSd、 LVEDd、LVPWd、LVEF指標與假手術組、手術組、ISO組比較差異均有統計學意義(P均<0.05)；聯合B組與聯合A組比較，IVSd、 LVEDd、LVPWd、LVEF差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

注：與假手術組比較，aP<0.01，bP<0.05；與ISO組比較，cP<0.01；與手術組比較，dP<0.01

三、各組小鼠心臟解剖結果比較

聯合組心臟質量增大，左心室肥厚明顯，同時出現心腔擴大，HW/BW及LVW/BW均明顯高于手術組以及ISO組；聯合B組與聯合A組比較，LVW/BW 明顯升高，而HW、BW、HW/BW比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，見表2。

注：與假手術組比較，aP<0.01，bP<0.05；與聯合A組比較，cP<0.01，dP<0.05

四、各組小鼠心肌病理切片結果

聯合A、B組心肌細胞體積增大直徑增寬，著色不均；可見明顯纖維組織，肌纖維間疏松水腫，間隙增寬；手術組以及ISO組心肌細胞輕度增大，血管周圍可見輕微纖維組織，見圖1。

圖1　各組小鼠心肌病理切片形態學檢查(蘇木素-伊紅染色，×100)

討論

目前復制大鼠心力衰竭的模型種類繁多，主要分為壓力超負荷型心力衰竭模型(如AAC)、缺血性心力衰竭模型(如冠狀動脈結扎術)、容量超負荷型心力衰竭模型(如動靜脈瘺)以及藥物心力衰竭模型(如ISO)等[5]。

ISO制作慢性心力衰竭大鼠模型存在著注射部位、劑量、時間等問題，ISO復制心力衰竭模型的作用機制是通過ISO激動心肌β受體，使心肌劇烈收縮、心率加快，增加心肌氧耗，但作用時間相對較短，同時大劑量ISO會引起急性心力衰竭導致死亡，小劑量ISO達不到誘導心力衰竭模型的目的，目前尚無統一的使用劑量指標[6]。本研究ISO組中大鼠LVEDd較正常組低，IVSd、LVPWd以及HW/BW也提示心肌明顯肥厚，但心臟功能LVEF反而輕度升高，考慮是心臟代償性作用。

AAC復制慢性心力衰竭模型的機制是通過縮窄腹主動脈,使心臟后負荷增加,心肌通過神經-體液等機制代償性增厚，隨著后負荷的持續存在，心室容積增大、心臟擴大，最終心肌失代償形成心力衰竭[7-8]。既往多項研究發現，AAC術后8周出現心肌肥厚，此時心臟處于代償階段，未能達到心力衰竭的指標，需要長達12周甚至更長時間達到心力衰竭[9-10]。本研究中手術組大鼠8周LVEDd較假手術組低，IVSd和 LVPWd高，可見心肌肥厚明顯，但是LVEF未見明顯下降，心臟功能尚處于代償期，模型未成功。

本研究采用ISO聯合AAC誘導大鼠慢性心力衰竭模型，模擬臨床慢性心力衰竭的病理變化。通過對比血各組流動力學指標、HW/BW、LVW/BW以及病理切片等，ISO聯合AAC方法制作慢性心力衰竭模型較單純AAC組和ISO組更具有穩定性及有效性，主要機制是在AAC模型的基礎上，連續給予ISO刺激心肌β受體，增加心肌收縮力以及收縮頻率，促進心力衰竭的進一步發生。聯合B組中的大鼠死亡率高達85%，主要是因為ISO的劑量過大導致大鼠發生急性心力衰竭導致死亡，聯合組中高劑量ISO并不適合誘導大鼠心力衰竭模型。聯合組中低劑量組，大鼠死亡率與ACC、ISO組無明顯的差異，血流動力學、心臟超聲等均提示慢性心力衰竭的發生，顯微鏡下可見大量的心肌纖維化，提示心臟功能嚴重受損，LVEF已達小于45%的國際標準[11]。本方法具有操作簡單、死亡率較低、造模效果明確、節省時間等優勢，為研究慢性心力衰竭的發病機制和治療措施提供理想的動物模型。

參考文獻

[1]Guha K, McDonagh T. Heart failure epidemiology: European perspective. Curr Cardiol Rev，2013，9(2): 123-127.

[2]Bui AL, Horwich TB, Fonarow GC. Epidemiology and risk profile of heart failure.Nat Rev Cardiol，2011，8(1):30-41.

[3]邢作英，王永霞，朱明軍.慢性心力衰竭流行病學研究現狀及其病因.中華實用診斷與治療雜志，2012，26(10):937-938.

[4]石巖，梅世昌.醫學動物實驗實用手冊.北京：中國農業出版社，2002:170．

[5]Huang CC, Monte AA, James M, Cook JM, Kabir MS, Peterson KP. Zebrafish heart failure models for the evaluation of chemical probes and drugs. Assay Drug Dev Technol，2013，11(9-10): 561-572.

[6]Ge T，Qin H，Wang X，Yang SS, Guo L, Han W, Chang HY. Effects of thoracic epidural anesthesia on cardiac function and myocardial cell apoptosis inisoproterenol-induced chronic heart failure rats. J Interv Cardiol，2014，27(5):446-455.

[7]Zhang Y, Li B, Wang B, Zhang J, Wu J, Morgan T. alteration of cardiac ace2/mas expression and cardiac remodelling in rats with aortic constriction. Chin J Physiol，2014，57(6):335-342.

[8]Liu S， Zhao C, Yang C, Li X, Huang H, Liu N, Li S, Wang X, Liu J. Gambogic acid suppresses pressure overload cardiac hypertrophy in rats.Am J Cardiovasc Dis，2013，3(4):227-238.

[9]王瑞芳，何昆侖，楊泉，苗冬梅.壓力負荷誘導的大鼠舒張性心力衰竭模型的建立.中華保健醫學雜志，2009，11(2):92-95.

[10]Ibrahim M, Kukadia P, Siedlecka U, Cartledge JE, Navaratnarajah M, Tokar S, Van Doorn C, Tsang VT, Gorelik J, Yacoub MH, Terracciano CM.Cardiomyocyte Ca2+handling and structure is regulated by degree and duration of mechanical load variation. J Cell Mol Med，2012，16(12):2910-2918.

[11]Mpe MT, Klug EQ, Silwa KS, Hitzeroth J, Smith DA. Heart Failure Society of South Africa(HeFSSA) perspective on the European Society of Cardiology (ESC) 2012 chronic heart failure guideline.S Afr Med J，2013，103(9 Suppl 2):660-667.

(本文編輯：楊江瑜)

Establishment of heart failure rat model induced by the combination of isoproterenol and abdominal aortic constriction

LiuXueqin,JiangHongqiang,ZhangJinguo.

MedicalCollegeofShandongUniversty,Ji’nan250100,China

【Abstract】ObjectiveTo establish chronic heart failure rat models by the combination of isoproterenol (ISO) and abdominal aortic constriction (AAC) and assess the rat models with relevant data. MethodsOne hundred male SD rats were randomly divided into 5 groups: sham operation, operation, combination A [AAC+ISO 1.0 mg/(kg·d)], combination B [AAC+ISO 2.5 mg/(kg·d)] and ISO groups [2.5 mg/(kg·d)], 20 rats for each group. At postoperative one week, corresponding doses of ISO were administered in two combination groups for consecutive 4 weeks. Except for ligation, the procedures in the sham operation group were similar to those in the other operation groups. At 8 weeks post-operation, echocardiography was performed to measure interventricular septum thickness at end-diastole (IVSd), left ventricular end-systolic dimension (LVEDd), left ventricular posterior wall diastolic (LVPWd) and left ventricular ejection fraction (LVEF). Then, the rats were executed to obtain and calculate the left ventricular weight/body weight ratio (LVW/BW) and heart weight/body weight ratio (HW/BW). H.E staining was performed to observe the morphologic changes and fibrosis degree of myocardial tissue. ResultsCompared with the sham operation group, the rats in the combination A and B groups presented with decreased urine volume, tachypnea, darkening fur color and decreased mobility at 6 weeks post-operation. The death rate in the combination B group was up to 85%. No evident abnormality was noted among the rest groups. At postoperative 8 weeks, IVSd, LVEDd, LVPWd and LVEF in two combination groups significantly differed from those in sham operation, operation and ISO groups(all P<0.05). Cardiac anatomy showed that both LVW/BW and HW/BW in two combination groups were significantly higher than those in the other groups(all P<0.05). Pathological findings demonstrated that cardiac muscle cells were enlarged and irregularly arranged, and interstitial hemorrhage and evident fibrosis were observed. ConclusionsChronic congestive heart failure rat models can be established by the combination of AAC and ISO at a dose of 1.0 mg/(kg·d)within 8 weeks. This modeling method is simple, feasible, and more effective than AAC or ISO alone, providing a novel approach for heart failure modeling and of significance for elucidating the mechanism of heart failure.

【Key words】Abdominal aortic constriction; Isoproterenol; Chronic heart failure; Rat

(收稿日期：2015-09-06)

Corresponding author, Zhang Jinguo, E-mail: cck112000@aliyun.com

通訊作者，張金國，E-mail:cck112000@aliyun.com

基金項目：山東省中醫藥科學技術研究項目(2013-235)

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.02.006

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