自創(chuàng)封閉穿刺技術(shù)應(yīng)用于骨腫瘤診斷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

魏然　孔慶柱　趙景新　金宇

067000 承德，承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨外四科

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自創(chuàng)封閉穿刺技術(shù)應(yīng)用于骨腫瘤診斷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

魏然孔慶柱趙景新金宇

067000 承德，承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨外四科

【摘要】目的探討自創(chuàng)封閉穿刺技術(shù)在診斷骨腫瘤中的應(yīng)用價(jià)值。方法用30只雄性新西蘭大白兔建立兔VX2骨腫瘤動(dòng)物模型，將其隨機(jī)分成VX2實(shí)驗(yàn)組與VX2對(duì)照組各15只，VX2實(shí)驗(yàn)組采用自制封閉穿刺裝置進(jìn)行腫瘤部位的穿刺活組織檢查(活檢)，穿刺后封堵骨孔；對(duì)照組則采用傳統(tǒng)穿刺活檢裝置，穿刺后未封堵骨孔。采用彩色多普勒超聲檢查(彩超)及病理學(xué)檢查對(duì)2組穿刺效果進(jìn)行評(píng)估與比較。結(jié)果穿刺1 h后，彩超顯示VX2實(shí)驗(yàn)組封閉栓均無(wú)脫落，其中2只(13.3%)穿刺孔出血，形成血腫，其余13只穿刺孔周圍無(wú)明顯液體滲出；VX2對(duì)照組14只(93.3%)穿刺孔有出血，形成血腫，剩余1只無(wú)明顯出血，2組出血率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。VX2實(shí)驗(yàn)組穿刺針道軟組織中未發(fā)現(xiàn)瘤細(xì)胞，而VX2對(duì)照組有14只(93.3%)發(fā)現(xiàn)瘤細(xì)胞，2組腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論該自創(chuàng)封閉穿刺技術(shù)安全、并發(fā)癥少，可應(yīng)用于骨腫瘤的診斷。

【關(guān)鍵詞】骨腫瘤；動(dòng)物模型；穿刺；活組織檢查；自制裝置

骨腫瘤的診斷是骨科難題，雖然目前的影像學(xué)技術(shù)中X線、CT、MRI及計(jì)算機(jī)斷層掃描(ECT)等能初步鑒別骨腫瘤的良惡性，但卻很難明確診斷。穿刺活組織檢查(活檢)技術(shù)對(duì)臨床治療前判斷腫瘤組織的良惡性、組織分型、分化程度等都有很大的幫助，對(duì)于治療方案的選擇具有重大意義。因此，穿刺活檢技術(shù)逐漸成為了骨腫瘤診斷、術(shù)前治療的重要手段。目前的穿刺活檢技術(shù)及器械種類繁多，穿刺陽(yáng)性率較高，但尚不能解決穿刺孔出血、局部轉(zhuǎn)移等不足之處，我科總結(jié)大量臨床經(jīng)驗(yàn)，發(fā)明了一種封閉骨孔的器械和穿刺骨組織的裝置，通過(guò)兔VX2骨腫瘤動(dòng)物模型建立了一種封閉穿刺技術(shù)，以助臨床改善穿刺活檢技術(shù)的不足，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下[1]。

材料與方法

一、材　料

本實(shí)驗(yàn)于2014年1月至2015年5月在我院中心實(shí)驗(yàn)室完成。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雄性新西蘭大白兔33只，月齡3～4個(gè)月，體質(zhì)量1.5～2.0 kg，由天津津南區(qū)春樂(lè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，實(shí)驗(yàn)前飼養(yǎng)1周。本實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物的處理方法符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。腫瘤細(xì)胞為兔VX2腫瘤組織塊，由廣州吉妮歐生物試劑公司提供。

二、儀　器

本實(shí)驗(yàn)的儀器包括：封閉穿刺針(實(shí)驗(yàn)中用此針穿刺皮膚、軟組織、骨皮質(zhì)，圖1A、B)、實(shí)驗(yàn)用封閉栓(圖1C) 、超聲診斷掃描儀(GE Medical Systems-LOGIQ9)、光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS-BX53)。

圖1　封閉穿刺裝置

A：套管針；B：穿刺針內(nèi)芯，為實(shí)心；C：封閉栓(箭頭)，穿刺活檢后將封閉栓植入套管尾部，將環(huán)形套安裝入穿刺針內(nèi)芯(使穿刺針內(nèi)芯插入套管后最尖部與套管部平齊)，用穿刺針內(nèi)芯通過(guò)套管將封閉栓頂置，剛好將封閉栓安放置穿刺點(diǎn)

三、方　法

1. 兔VX2肌肉腫瘤模型的建立

將兔VX2腫瘤組織塊復(fù)蘇后離心去除上清液，取沉淀物置于1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中，用眼科剪將組織剪碎為0.5～1.0 mm3大小的組織塊，用1 ml PBS重懸組織塊成混懸液，將其注射到實(shí)驗(yàn)兔(隨機(jī)抽取1只)的大腿肌肉內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，14 d后局部觸及腫塊，大小約4×4 cm2，建立兔VX2肌肉腫瘤模型成功，即獲得大量腫瘤細(xì)胞待用。

2. 種植VX2腫瘤細(xì)胞，建立兔VX2骨腫瘤模型

制備兔VX2骨腫瘤模型前，隨機(jī)挑選出3只兔子作為空白對(duì)照組，與后續(xù)兔VX2骨腫瘤模型共同接受穿刺。

剩余30只兔子于實(shí)驗(yàn)前禁食10 h，于無(wú)菌條件下取出傳種兔腫瘤組織塊，制成0.5～1.0 mm3組織塊，用1 ml PBS重懸組織塊成混懸液。30只實(shí)驗(yàn)兔采用3%戊巴比妥鈉(1 ml/kg)耳緣靜脈麻醉，將其右側(cè)脛骨上段局部去毛消毒，于脛骨近端前緣平面(約為脛骨平臺(tái)下1 cm，偏內(nèi)側(cè)0.5 cm處)進(jìn)行操作，在脛骨干骺端用克氏針(直徑2 mm)鉆洞直至骨髓腔[2]。將腫瘤組織混懸液植入骨髓腔內(nèi)，用骨蠟封口，用醫(yī)用酒精沖洗周圍組織，逐層縫合皮下組織、皮膚。左側(cè)不予處理。標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，4周后將成功建立的兔VX2骨腫瘤動(dòng)物模型作為實(shí)驗(yàn)穿刺對(duì)象[3]。

3. 對(duì)兔VX2骨腫瘤模型進(jìn)行穿刺

對(duì)兔VX2骨腫瘤模型耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(1 ml/kg)將其麻醉后，于其小腿脛骨結(jié)節(jié)表面剃除毛發(fā)，采用俯臥位將其固定于手術(shù)臺(tái)上。常規(guī)碘伏消毒，鋪無(wú)菌孔單。將30只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分成2組各15只，一組為VX2實(shí)驗(yàn)組，另一組為VX2對(duì)照組。對(duì)2組的雙側(cè)小腿背側(cè)進(jìn)行穿刺。VX2實(shí)驗(yàn)組采用自制封閉穿刺裝置及技術(shù)進(jìn)行穿刺，然后縫合。VX2對(duì)照組采用傳統(tǒng)穿刺活檢裝置及技術(shù)，對(duì)穿刺孔不封堵，采用按壓的方式，然后縫合。術(shù)后預(yù)防性使用抗生素。

采用自制封閉穿刺裝置及技術(shù)進(jìn)行穿刺的方法如下：將圖1B的穿刺針內(nèi)芯放入圖1A的套管針內(nèi)，組合式穿刺到達(dá)骨皮質(zhì)，套管針位置不動(dòng)，穿刺針內(nèi)芯旋轉(zhuǎn)式進(jìn)入骨髓腔，套管針保持位置不動(dòng)，拔出針芯，插入病理針，獲取腫瘤組織，取出病理針，保持套管針位置不動(dòng)，將封閉栓從針尾放進(jìn)套管針，用穿刺針內(nèi)芯順套管針?lè)较驅(qū)⒎忾]栓頂置骨孔內(nèi)進(jìn)行封堵，最后取出套管針和穿刺針內(nèi)芯。

4. 術(shù)后評(píng)定

穿刺1 h后，對(duì)實(shí)驗(yàn)兔小腿穿刺部位行彩色多普勒超聲檢查(彩超)，觀察穿刺孔周圍出血情況，比較VX2實(shí)驗(yàn)組與VX2對(duì)照組的出血率。

于穿刺后4周內(nèi)，采用靜脈注射過(guò)量烏拉坦深麻醉法處死3組兔，取空白對(duì)照組小腿近端背側(cè)正常軟組織和VX2實(shí)驗(yàn)組與VX2對(duì)照組穿刺針道軟組織，將所取組織浸泡于4%甲醛溶液中固定，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片并進(jìn)行蘇木素-伊紅染色，將各組軟組織病理學(xué)檢查結(jié)果進(jìn)行比較，分析VX2實(shí)驗(yàn)組與VX2對(duì)照組腫瘤擴(kuò)散情況。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0處理數(shù)據(jù)，2組間計(jì)數(shù)資料的比較采用Fisher確切概率法。P<0.01為比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、VX2實(shí)驗(yàn)組與VX2對(duì)照組的出血率比較

2組均1次成功獲取腫瘤組織。穿刺1 h后，彩超顯示VX2實(shí)驗(yàn)組封閉栓均無(wú)脫落，其中2只(13.3%)穿刺孔出血，形成血腫，其余13只穿刺孔周圍無(wú)明顯液體滲出(圖2A)；VX2對(duì)照組14只(93.3%)穿刺孔均有出血，形成血腫(圖2B)，剩余1只無(wú)明顯出血，2組出血率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，實(shí)驗(yàn)組出血率較低。

圖2　VX2實(shí)驗(yàn)組與VX2對(duì)照組彩超圖

A：VX2實(shí)驗(yàn)組穿刺后1 h，箭頭所指為封閉栓，可見(jiàn)封閉栓封堵穿刺孔，穿刺孔周圍層次清晰，肌肉組織回聲均勻，穿刺孔無(wú)滲漏及出血情況；B：VX2對(duì)照組穿刺后1 h，穿刺孔周圍回聲不均勻(箭頭所指區(qū)域的低密度影)，可見(jiàn)不規(guī)則低回聲，較雜亂，其內(nèi)可見(jiàn)片樣偏高回聲，穿刺孔周圍有滲漏及出血情況

二、VX2實(shí)驗(yàn)組與VX2對(duì)照組的腫瘤擴(kuò)散情況比較

空白對(duì)照組病理學(xué)檢查結(jié)果正常。VX2實(shí)驗(yàn)組穿刺針道軟組織中未發(fā)現(xiàn)瘤細(xì)胞(圖3A、B)，VX2對(duì)照組14只(93.3%)發(fā)現(xiàn)瘤細(xì)胞(圖3C、D)，2組腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，VX2實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散率較低。

討論

近年來(lái)，惡性骨腫瘤已逐漸成為中國(guó)居民死亡的主要原因[4]。骨骼系統(tǒng)中骨骼病變首選最基礎(chǔ)的檢查方法是X線片檢查，此法可以清晰顯示骨結(jié)構(gòu)和骨骼病變的大體范圍、骨質(zhì)破壞情況以及周圍軟組織情況。對(duì)于內(nèi)部結(jié)構(gòu)、周圍軟組織不清等情況，可進(jìn)一步行CT、MRI及ECT檢查。但在骨腫瘤診斷中，若想得到更為確切的結(jié)果，最好行穿刺活檢。

穿刺活檢作為臨床骨腫瘤重要的輔助檢查技術(shù)，具有操作方法簡(jiǎn)便、對(duì)組織損傷小、出血少、感染機(jī)會(huì)小以及不影響二次手術(shù)治療方案的選擇等優(yōu)點(diǎn)。該項(xiàng)技術(shù)缺一不可的材料是穿刺針。穿刺針多種多樣，包括三爪形套管活檢針、組合式穿刺活檢套鉗、恩特利活檢針、自制隧道式穿刺針、彈簧芯狀活檢針、三齒軟組織切割針等[5-10]。穿刺活檢技術(shù)雖然已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，但如何避免穿刺處出血、腫瘤細(xì)胞針道轉(zhuǎn)移、污染周圍組織等并發(fā)癥尚未解決[11-15]。

我科總結(jié)大量穿刺活檢經(jīng)驗(yàn)，在現(xiàn)有穿刺技術(shù)的基礎(chǔ)上自制了封閉穿刺裝置，其能隔絕穿刺孔道與皮質(zhì)外正常軟組織接觸，使骨髓腔與外界形成通道，通過(guò)病理針由此通道中取出腫瘤組織，完成后由封閉栓封閉骨孔。本研究結(jié)果顯示，自制封閉穿刺裝置的出血率明顯低于傳統(tǒng)裝置，也能更好地控制腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散。

圖3　VX2實(shí)驗(yàn)組與VX2對(duì)照組病理圖(蘇木素-伊紅染色，A、C×10，B、D×40)

A、B：VX2實(shí)驗(yàn)組穿刺后病理圖，可見(jiàn)正常疏松結(jié)蹄組織，肌纖維縱切面可見(jiàn)明暗相間的橫紋，核多，且位于細(xì)胞周邊，軟骨囊內(nèi)軟骨細(xì)胞正常，軟骨基質(zhì)內(nèi)有大量彈性纖維，病理診斷為正常骨骼肌組織、正常脂肪組織；C、D：VX2對(duì)照組穿刺后病理圖，骨周圍軟組織可見(jiàn)異性腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，瘤細(xì)胞呈片巢狀排列，細(xì)胞多角形或卵圓形，核大濃染，癌細(xì)胞巢中可見(jiàn)角化珠形成，病理診斷為鱗癌

本課題組在成功建立兔VX2骨腫瘤動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上采用自創(chuàng)封閉穿刺技術(shù)，克服了現(xiàn)有的骨組織穿刺工具難以在穿刺取樣后及時(shí)封閉骨孔的缺陷。封堵骨孔的封閉栓由醫(yī)用高分子聚合物材料制成，人類對(duì)其免疫排斥反應(yīng)較小，而且其為環(huán)狀翅片、有成對(duì)倒鉤，直徑均大于套管針通道的內(nèi)徑，可有效固定并密封穿刺孔。該自制封閉穿刺技術(shù)安全、并發(fā)癥少，值得在臨床推廣應(yīng)用。

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(本文編輯：洪悅民)

Application of home-made puncture technique for diagnosis of bone tumor in animal models

WeiRan,KongQingzhu,ZhaoJingxin,JinYu.

TheFourthEndemicArea,DepartmentofOrthopedics,theAffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the application value of home-made puncture technique in the diagnosis of bone tumors in rabbit models. MethodsThirty New Zealand male rabbits were used to establish VX2 bone tumor models and randomly divided into the experimental (n=15) and control groups (n=15). In the experimental group, puncture biopsy was performed by a home-made puncture device and the bone holes were occluded subsequently. In the control group, puncture biopsy was conducted by using a conventional puncture device whereas the holes were left open. The puncture effect was evaluated and statistically compared between two groups by color Doppler Ultrasound and pathological examination. ResultsAt 1 h after puncture, color ultrasound revealed no signs of device separation. Hemorrhage and hematoma were observed around the puncture hole in 2 animals (13.3%) and no apparent fluid effusion was detected in the remaining 13 in the experimental group, significantly different from those in the control group, 14 animals (93.3%) had hemorrhage and hematoma surrounding the puncture hole and the other 1 had no evident hemorrhage (P<0.001). In the experimental group, no tumor cells were detected in the soft tissue of puncture tract whereas 14 animals(93.3%) in the control group, the dissemination rate of tumor cells significantly differed between two groups (P<0.01). ConclusionsHome-made puncture technique is a safe diagnostic tool of bone tumors and yields slight complications.

【Key words】Bone tumor; Animal model; Puncture; Biopsy; Home-made device

(收稿日期：2015-08-26)

Corresponding author,Jin Yu,E-mail：792027135@qq.com

通信作者，金宇，E-mail：792027135@qq.com

基金項(xiàng)目：河北省省級(jí)重大醫(yī)學(xué)科研課題(zd2013048)

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.02.007

·基礎(chǔ)研究論著·