家蠶miRNA及其在抗病毒機制中的作用

王雅婷，蔣彩英

（浙江理工大學生命科學學院，浙江 杭州 310018）

家蠶miRNA及其在抗病毒機制中的作用

王雅婷，蔣彩英＊

（浙江理工大學生命科學學院，浙江 杭州 310018）

miRNA廣泛存在于真核生物中，并在多種生理過程中發揮著重要的作用。本文簡要介紹了家蠶miRNA及其在抗病毒機制中功能作用的研究進展。開展家蠶miRNA在家蠶抗病毒作用機制的研究，不僅有助于全面了解家蠶miRNA的功能及其調控機制，而且對于促進家蠶病毒病的早期診斷、防治和抗病育種具有重要意義。

家蠶；miRNA；抗病毒機制

1　引言

miRNA（microRNA、微RNA）是一類長約19～24個核苷酸（nucleotide，nt）的內源性非編碼小分子單鏈RNA。在進化過程中，miRNA高度保守，并能通過與靶基因mRNA特異性的堿基互補配對，引起靶基因mRNA降解或者抑制其翻譯，廣泛地負調控靶基因的表達［1］。據估計，生物體內miRNA數量約占其相應物種全部基因數的1%［2］。生物信息學數據顯示，每個miRNA可以調節數百個靶基因，因此miRNA能調節多種生物學信號通路，進而調控多種重要生命活動，如生長與發育、細胞分化與凋亡、腫瘤發生以及對異源物（xenobiotics）的毒理學反應等［3，4］。越來越多研究發現，miRNA在免疫細胞的分化發育、免疫應答的調控以及免疫系統疾病的發生發展等過程中都發揮重要的作用［5，6］。miRNA因其在細胞基因表達調控網絡系統中的重要作用，已成為當前生命科學研究的熱點。

就昆蟲而言，現已在miRBase數據庫（Release 21：2014年6月）［7］中登錄了26種昆蟲3，824條成熟miRNA序列，其中以家蠶Bombyx mori（563條）、黑腹果蠅Drosophila melanogaster（466條）和赤擬谷盜Tribolium castaneum（430條）等的數量相對較多。至今，有關昆蟲miRNA的研究主要以黑腹果蠅為主，包括miRNA鑒定、結構特征分析、生物合成途徑和作用機制等研究［8，9］。近年來，有關家蠶miRNA研究發展十分迅速，新的miRNA不斷被發現，揭示出不同miRNA在各種生物學功能方面起著非常重要的調控作用。

2　家蠶miRNA研究概況

目前，有關家蠶miRNA的研究主要集中在miRNA鑒定與表達、靶基因預測與驗證、生長發育與絲蛋白合成等功能相關的研究［10］。

2.1家蠶miRNA鑒定與表達

miRNA鑒定主要通過生物信息學預測、miRNA芯片檢測和文庫構建及轉錄組測序等，再利用Northern雜交和RT-PCR等分子生物學技術進行驗證。隨著家蠶基因組測序的完成以及高通量測序技術的發展，越來越多的家蠶新miRNA被發現和鑒定。Tong等［11］率先通過生物信息學方法在家蠶基因組中鑒定出24個保守的miRNA。He等［12］利用芯片和Northern雜交技術鑒定了46個miRNAs、21個可能的miRNA和一個家蠶特有的miRNA，并預測了547個潛在的靶基因。Yu等［13，14］建立了家蠶不同發育時期的小RNA文庫，采用計算機預測和分子克隆的方法，從中鑒定出了118個保守的miRNA和151個可能的家蠶特有的miRNA，并發現家蠶蛻皮期miRNA不但在種類上，而且在表達量上都有明顯增加。根據miRNA序列的保守性，Huang等［15］通過同源性分析鑒定獲得16個家蠶新miRNA，預測的21個潛在靶基因多是編碼轉錄因子。通過芯片技術并結合Northern雜交，Liu等［16，17］研究了100個家蠶miRNA的時空表達情況。Zhang等［18］、Cai等［19］、Jagadeeswaran等［20］和Liu等［21］則分別利用SBS、Solexa和SOLiD等測序技術鑒定出新的miRNA，并根據其表達特征，推測有可能與家蠶的胚胎形成、變態發育和絲腺功能有關。

2.2家蠶miRNA功能研究

研究表明，家蠶miRNA在變態發育、神經發育、免疫反應和絲蛋白合成等多種生物學過程中均有重要作用。盡管通過miRNA芯片檢測和轉錄組測序等技術發現了一大批在家蠶不同發育時期、不同組織器官以及病原物感染后差異表達的miRNA，但其中僅少數miRNA的功能得到了確證。家蠶miRNA功能及其調控機制的研究主要通過人為過表達或抑制表達目的miRNA后，檢測其靶基因的表達水平以及家蠶生物學、生理生化和分子生物學等特征指標的變化，進而推測目的miRNA的功能。其中，采用雙熒光素酶活性試驗鑒定并驗證家蠶miRNA與其靶基因的直接作用是當前研究miRNA功能的常用方法。

在家蠶中，Liu等［22］報道了bmo-let-7在不同發育時期和組織以及卵巢細胞中的表達情況，發現其表達模式與體內蛻皮激素的滴度之間存在一定的相關性。采用轉基因方法降低家蠶體內bmo-let-7的表達水平后，發現轉基因家蠶在蛻皮過程中出現發育停滯，且期間2個與蛻皮激素途徑調控相關的bmo-let-7潛在靶基因FTZ-F1和Eip74EF（E74）的表達水平均有增高，因此推測bmo-let-7能調控家蠶的蛻皮過程［23］。類似地，bmo-miR-281可通過抑制其靶基因——蛻皮激素受體（ecdysone receptor，EcR）BmEcR-B基因的表達而參與馬氏管的發育調控［24］。Chen等［25］報道bmo-miR-1a-3p能與Bm-VMP23基因的3’端非翻譯區（3’UTR）特異性結合而導致BmVMP23基因下調，進而影響蠶卵致死性狀。此外，Bmo-miR-9a可通過下調靶基因Bmase表達水平進而調控家蠶神經發育進程［26］；Bmo-miR-2作用靶基因awd和fng基因而影響蠶蛾翅形態［27］；bmomiR-7作用靶基因Bmyan而調控家蠶光感受器分化和復眼發育［28］。

家蠶miRNA在高齡幼蟲后部絲腺中高水平表達，表明miRNA在絲蛋白合成中具有重要的調控作用［29，30］。Cao等［31］通過異源報告基因系統證實了絲素輕鏈基因（fibroin-L）至少被4個miRNA（miR-33、miR-190、miR-276和miR-7）所抑制；而Chen等［32］采用雙熒光素酶活性試驗證實fibroin-L基因亦能被在5齡幼蟲后部絲腺高水平表達的bmo-miR-0001和bmo-miR-0015所顯著下調。miRNA-2b能與家蠶絲素基因P25的3'UTR互補配對，且兩者在5齡幼蟲后部絲腺中的表達模式表明miRNA-2b可能是P25基因轉錄后水平的微調因子［33］。Wu等［34］預測發現絲素蛋白調節結合蛋白FMBP-1基因3’UTR中存在bmo-miR-2b*、bmo-miR-305和bmo-miR-2758的互補配對位點，經驗證表明在后部絲腺中高水平表達的bmo-miR-2758能顯著抑制FMBP-1基因的表達。

3　家蠶抗病毒研究

眾所周知，家蠶是支撐全球蠶桑絲綢產業的生物學基礎［35］。我國是世界上最大的蠶繭、蠶絲生產國和繭絲綢出口國［36］。蠶桑業在我國農業經濟中占有重要地位，是農民收入的重要來源。然而，我國每年卻因蠶病如病毒病、細菌病、真菌病和微粒子病等流行而造成的損失約占蠶業總收入的20%，由核型多角體病（Nuclear polyhedrosis）、質型多角體病（Cytoplasmic polyhedrosis）和濃核病（Densonuclopsis）等病毒病引發的損失約占蠶病總損失的80%，已嚴重影響到蠶桑產業的可持續發展。其中，家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，BmNPV，一種昆蟲桿狀病毒）所引起的蠶膿病是養蠶業三大病毒病中危害最為嚴重的一種，在世界養蠶業國家常有暴發，并造成巨大的經濟損失。長期以來，盡管在尋找抗病基因、闡明抗性機理培育抗性品種等方面研究己有一定的進展，但仍有較多問題尚未能解決［37，38］。

有關昆蟲抗病毒機制的研究主要集中在RNA干擾和細胞凋亡等方面。研究發現，RNA沉默是昆蟲用來抵御病毒入侵的一種普遍而又進化保守的防御機制［39～41］。由小干擾RNA（small interfering RNAs，siRNA）介導的RNA干擾在黑腹果蠅抗病毒防御機制中發揮重要作用。細胞凋亡（apoptosis）作為昆蟲防衛病毒侵染的另一種重要機制，是通過細胞自殺性凋亡限制病毒感染與復制［42，43］。有關昆蟲細胞凋亡調節分子與調節機制研究多限于果蠅、家蠶、草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda和桿狀病毒等［37］。雖然人們對昆蟲細胞凋亡的分子機制已有大致了解，但與哺乳動物相比，許多細節更待繼續闡明。

在家蠶中，從消化液內分離克隆獲得了多個抗病毒蛋白，其中以中腸特異性表達的家蠶脂酶1（Bmlipase-1）［44］、絲氨酸蛋白酶2（BmSP-2）［45］和還原型輔酶Ⅱ氧化還原酶（BmNOX）［46］等對BmNPV具有較強抗性。Jiang等［47］采用轉基因技術將Bmlipase-1基因轉入家蠶敏感品系體內，獲得的轉基因家蠶對病毒感染后的存活率提高了33%。這在進一步確證Bmlipase-1抗病毒活性的同時，揭示了家蠶轉基因抗病育種的應用前景。此外，采用熒光差異展示PCR技術（FDD-PCR）、芯片技術、酵母雙雜、轉錄組與蛋白組測序等技術比較分析家蠶對病毒抗性和敏感品系、以及在病毒感染過程中差異表達的基因和蛋白，進而篩選家蠶抗病毒相關基因及其相關的信號轉導途徑［48～54］。其中，細胞凋亡可能也是家蠶對抗病毒感染的重要機制。家蠶核糖體S3A基因Bms3a在抗性品系感染病毒后高水平表達，推測該基因可能促進被病毒感染的家蠶細胞凋亡，進而抑制病毒在蠶體內的復制［48］。Qin等［55］采用遺傳雜交和蛋白組測序技術鑒定發現細胞凋亡相關的半胱天冬酶caspase-1在家蠶抗BmNPV感染中具有重要作用。

4　miRNA在家蠶抗病毒機制中的作用

越來越多的研究表明，miRNA參與對病毒侵染免疫反應的調控過程［56～62］。由miRNA進行的轉錄后調控比轉錄調控和翻譯后調控具有更好的精準性（robust）和更快的反應速度，因此在進化上更具優越性［63］。而且，每個miRNA分子通常可以調控數個目標基因，因此不同類型的調控通常交織在一個調控網絡中。此外，病毒自身編碼的miRNA對昆蟲細胞基因表達的調控作用［64］，可能與昆蟲miRNA的調控網絡產生反饋互作，形成更為錯綜復雜的調控網絡。

不同昆蟲及細胞感染不同病毒后，其miRNA表達譜多會發生顯著變化，如棉鈴蟲Helicoverpa armigera幼蟲［65］和草地貪夜蛾Sf9細胞［66］感染桿狀病毒、谷實夜蛾H.zea脂肪體細胞HzFB感染煙芽夜蛾囊泡病毒（Heliothis virescens ascovirus，HvAV3e）［58］、致倦庫蚊Culex quinquefasciatus雌成蟲感染西尼羅病毒（WNV）［61］和埃及伊蚊Aedes aegypti雌成蟲感染登革病毒（DENV）［67］等。miRNA表達譜的變化可能來自寄主本身的抗病毒反應，亦可能受病毒基因的調控而產生。

家蠶幼蟲感染質型多角體病毒（BmCPV）后，在鑒定獲得的316條已知miRNA和90條新miRNA中，有58條miRNA的表達量發生了顯著變化，且這些差異表達miRNA的靶基因多涉及昆蟲對病毒的免疫與應激反應［68］。其中，bmo-miR-278-3p在感染Bm-CPV后表達量顯著下調，而在家蠶幼蟲體內過表達bmo-miR-278-3p可顯著抑制其靶基因——胰島素相關肽結合蛋白（IBP2）基因表達，并促進BmCPV的復制［69］。這表明bmo-miR-278-3p可能參與家蠶對病毒的抗性。目前，家蠶miRNA抗病毒相關的研究盡管仍較為缺乏，但隨著miRNA研究的不斷深入，家蠶miRNA在抗病毒機制中作用會更為明確，并將用于家蠶病毒病的防治。Zhang等［70］利用miRNA的調控機理，構建了以BmNPV基因lef-1為靶基因的人工miRNA（amiRNA）表達系統，轉染昆蟲細胞后能產生具有抑制病毒復制并降低病毒感染的成熟amiR2764和amiR279。

5　展望

miRNA因其在細胞基因表達調控網絡系統中的重要作用，現已成為生命科學研究的熱點。但是，絕大多數miRNA的調控機制及其生物學功能至今尚未明了。有關miRNA免疫調控人類重大疾病如癌癥、糖尿病和心血管疾病以及病毒傳染病等方面的研究雖已有較多積累，但miRNA的功能機制及其調控網絡仍在發掘當中。昆蟲特別是家蠶的miRNA功能研究則相對滯后，有關miRNA抗病毒調控機制的研究尚待加強。

隨著miRNA及其控調網絡在家蠶抗病毒作用機制的闡明，不僅有助于全面了解家蠶miRNA的功能及其調控機制，而且對于促進家蠶病毒病的早期診斷、防治新途徑和抗病育種具有重要意義。

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Research Progress of miRNA in the Silkworm，Bombyx mori and its Roles in Antiviral Mechanisms

WANG Ya-ting，JIANG Cai-ying＊
（College of Life Sciences，Zhejiang Sci-Tech University，Hangzhou 310018，China）

MiRNAs，found in eukaryotes，play important roles in various physiological processes through posttranscriptional regulation of gene expression.The research progress of miRNA in the silkworm，Bombyx mori and its roles in the antiviral mechanisms were introduced briefly in this paper.The research on the roles of miRNA in B.mori against viruses may not only contribute tounderstanding of B.mori miRNA functions，but also be important to promote early diagnosis of virus diseases，new approaches of disease defense and antiviral breeding of B.mori.

Bombyx mori；miRNA；antiviral mechanism

S884.5

A

0258-4069［2016］02-001-06

國家自然科學基金項目（31200974）

王雅婷（1991-），女，浙江臺州人，碩士研究生，從事家蠶miRNA功能研究。E-mail：972099701@qq.com

蔣彩英，女，副研究員。E-mail：jcy@zstu.edu.cn