間接免疫熒光法在臺(tái)山地區(qū)艾滋病并發(fā)PCP的應(yīng)用

陳達(dá)富，邵筱(、廣東醫(yī)學(xué)院附屬臺(tái)山醫(yī)院，廣東臺(tái)山5900；、廣東醫(yī)學(xué)院，廣東東莞5380)

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間接免疫熒光法在臺(tái)山地區(qū)艾滋病并發(fā)PCP的應(yīng)用

陳達(dá)富1，邵筱2
(1、廣東醫(yī)學(xué)院附屬臺(tái)山醫(yī)院，廣東臺(tái)山529200；2、廣東醫(yī)學(xué)院，廣東東莞523820)

摘要：目的比較間接免疫熒光法（IFA）與瑞-姬氏復(fù)合染色法、熒光實(shí)時(shí)定量PCR法（Real-time PCR）三種方法對(duì)肺孢子菌肺炎的差異，探討實(shí)驗(yàn)室方法IFA在診斷肺孢子菌肺炎的應(yīng)用價(jià)值。方法通過(guò)回顧性分析，收集2013年1月至2015年8月間在我院經(jīng)病原學(xué)及臨床診斷確診的肺孢子菌肺炎（PCP）患者56例作為實(shí)驗(yàn)組，另外收集60例非PCP感染的呼吸道疾病患者作為對(duì)照組，收集兩組患者的痰液和支氣管肺泡灌洗液(BALF)，分別用IFA、瑞-姬氏復(fù)合染色法、Real-time PCR對(duì)兩組的痰液和BALF進(jìn)行檢測(cè)，比較三種方法的檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果通過(guò)比較，IFA檢測(cè)與real-time PCR一致性極高，對(duì)痰液和BALF標(biāo)本陽(yáng)性檢出率均高于瑞-姬氏復(fù)合染色法，P<0.05，差異顯著。三種方法學(xué)對(duì)BALF的陽(yáng)性檢出率明顯高于痰液，P<0.05。結(jié)論瑞-姬氏復(fù)合染色法由于方法學(xué)上的局限性，存在陽(yáng)性率不高的問(wèn)題。IFA無(wú)論對(duì)痰液或BALF的檢測(cè)靈敏度均高于瑞-姬氏復(fù)合染色法，與Real-time PCR一致性極高。IFA可以作為常規(guī)方法用于基層醫(yī)院PCP的檢測(cè)。在本研究中，瑞-姬氏復(fù)合染色法、IFA、Real-time PCR對(duì)BALF標(biāo)本的檢測(cè)率高于痰液標(biāo)本，臨床上建議盡量留取BALF標(biāo)本，條件無(wú)法許可的情況可留取痰液標(biāo)本。

關(guān)鍵詞：艾滋病；肺孢子菌；肺孢子菌肺炎；間接免疫熒光法；熒光實(shí)時(shí)定量PCR

卡氏肺孢子蟲(chóng)(Pneumocystis carinii，PC)，簡(jiǎn)稱肺孢子蟲(chóng)，根據(jù)分子生物學(xué)的研究，其實(shí)是一種特殊的真菌[1]，現(xiàn)在已經(jīng)改稱為肺孢子菌更為恰當(dāng)，它是一種機(jī)會(huì)致病感染病原體，其引起的肺炎稱為肺孢子菌肺炎(Pneumocystis carinii pneumonia，PCP)。PC可在免疫功能低下的人群中誘發(fā)PCP，特別是AIDS患者容易發(fā)生PCP[2-4]。PCP是艾滋病患者最常見(jiàn)的感染和死亡原因之一[5]。目前國(guó)外已對(duì)AIDS患者等易感人群實(shí)施越來(lái)越多的PCP預(yù)防治療，但在國(guó)內(nèi)對(duì)PCP的早期診斷和治療仍然有相當(dāng)?shù)碾y度[6]，由于誤診而延誤治療導(dǎo)致PCP患者病死率極高。現(xiàn)在PCP的確診主要依據(jù)是靠在呼吸道分泌物里找到病原體PC[7]。臺(tái)山地區(qū)一直是我國(guó)AIDS的高發(fā)區(qū)域，在臺(tái)山地區(qū)建立高靈敏度、高特異性的診斷方法有重要意義。本研究對(duì)間接免疫熒光法（IFA）進(jìn)行研究分析，探討其在診斷PCP中的應(yīng)用價(jià)值。

1　資料與方法

1.1一般資料通過(guò)回顧性分析，收集2013年1月至2015年8月間在臺(tái)山市人民醫(yī)院HIV陽(yáng)性合并PCP患者56例作為實(shí)驗(yàn)組，另外收集60例非PCP感染的呼吸道疾病患者作為對(duì)照組，收集兩組患者的痰液和支氣管肺泡灌洗液(BALF)，分別用IFA與瑞-姬氏復(fù)合染色法、Real-time PCR對(duì)兩組的痰液和BALF進(jìn)行檢測(cè)，比較三種方法的檢測(cè)結(jié)果。

1.2標(biāo)本采集

1.2.1痰液的留取能正常留取濃痰患者只需清潔口腔留取，無(wú)痰患者用3%的高滲鹽水超聲霧化吸入誘導(dǎo)排痰，在痰液中加人10%NaOH，于37℃水浴消化1h取出，經(jīng)4500r/min離心5min留取沉淀物。

1.2.2支氣管肺泡灌洗液（BALF）的留取通過(guò)3300型電子纖維支氣管鏡，向肺內(nèi)灌入無(wú)菌生理鹽水，反復(fù)多次回收灌洗液約10~30m l，經(jīng)4000r/ min離心20min，取沉淀物檢查。備注：留取BALF要注意患者是否能夠耐受。

1.3儀器與試劑日本OLYMPUS公司CX40型普通光學(xué)顯微鏡；日本OLYMPUS公司IX81熒光顯微鏡；日本OLYMPUS公司3300型電子纖維支氣管鏡；廣州達(dá)安公司DA7600PCR定量分析儀；珠海貝索生物技術(shù)有限公司瑞特染液和吉姆薩(Giesma)染色液；法國(guó)歐蒙公司間接免疫熒光肺孢子菌試劑盒；上海之江生物科技有限公司肺孢子菌熒光實(shí)時(shí)定量試劑盒。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）或百分比（%）表示。不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換正態(tài)化分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

瑞-姬氏復(fù)合染色法、IFA、Real-time PCR對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組痰液標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，對(duì)BALF的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1　實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組三種方法對(duì)痰液的檢測(cè)結(jié)果

從表1和表2中，IFA、Real-time PCR兩種方法學(xué)對(duì)BALF的陽(yáng)性檢出率均高于痰液。IFA和Real-time PCR一致性高，對(duì)痰液和BALF的陽(yáng)性檢出率均高于瑞-姬氏復(fù)合染色法。

三種方法學(xué)對(duì)痰液、BALF的靈敏度和特異性比較見(jiàn)表3。

表3　三種方法學(xué)對(duì)痰液、BALF的靈敏度和特異性比較

從表3可見(jiàn)，IFA與瑞-姬氏復(fù)合染色法特異性均高于Real-time PCR，靈敏度IFA和Real-time PCR高于瑞-姬氏復(fù)合染色法。三種方法學(xué)BALF的檢測(cè)靈敏度高于痰液的檢測(cè)。

3　討論

艾滋病(AIDS)是獲得性免疫缺陷綜合征的簡(jiǎn)稱，選擇性侵犯帶有CD4分子的T淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致CD4+T淋巴細(xì)胞進(jìn)行性減少。致機(jī)體免疫力下降，常使HIV患者合并各種機(jī)會(huì)性感染[8]。臺(tái)山地區(qū)為HIV的高發(fā)區(qū)域，臺(tái)山市疾病控制中心也對(duì)此進(jìn)行了相關(guān)文獻(xiàn)[9，10]報(bào)道，而PCP是AIDS患者的常見(jiàn)的肺部感染[11]，死亡率高，所以在基層醫(yī)院急需靈敏度更高的方法應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)室診斷。瑞-姬復(fù)合染色法是目前較為公認(rèn)的確診PCP的傳統(tǒng)方法，但由于瑞-姬復(fù)合染色效果的差異及檢驗(yàn)人員主觀判斷的差異，往往存在陽(yáng)性率不高的問(wèn)題。目前，研究較多的PCR方法學(xué)已經(jīng)較多地應(yīng)用到實(shí)驗(yàn)室中，但其靈敏度過(guò)高，容易引起假陽(yáng)性，造成病人的過(guò)度治療。

IFA因其特異性強(qiáng)、靈敏高、速度快等優(yōu)點(diǎn)在國(guó)外已經(jīng)普遍應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室[12]，國(guó)外學(xué)者Hassan等認(rèn)為IFA檢測(cè)PC抗原的敏感性達(dá)100%[13]。但在國(guó)內(nèi)的研究還較少。本研究中，間接免疫熒光法（IFA）對(duì)痰液標(biāo)本和BALF標(biāo)本檢出靈敏度達(dá)到98.29%和94.64%，特異性均達(dá)到100%。通過(guò)對(duì)IFA、瑞-姬復(fù)合染色法與real-time PCR的比較，IFA與real-time PCR均有較高的靈敏度，而且比瑞-姬復(fù)合染色法有更好的靈敏度及更強(qiáng)的特異性。這是因?yàn)榭乖贵w反應(yīng)結(jié)合特異性比較高，而且人眼對(duì)熒光的辨認(rèn)比較敏感，提高了標(biāo)本的陽(yáng)性檢測(cè)率，同時(shí)減少了組（人員）間的主觀差別。總之，本研究證實(shí)IFA操作簡(jiǎn)單，對(duì)痰液和BALF的檢測(cè)均能滿足臨床需求，可以在基層醫(yī)院進(jìn)行推廣應(yīng)用。

通過(guò)本研究可知，縱觀三種方法學(xué)對(duì)痰液和BALF的檢測(cè)，均一致顯示BALF檢測(cè)陽(yáng)性率高于痰液，痰液標(biāo)本容易獲取，而且對(duì)病人創(chuàng)傷性較少，但其有對(duì)PC的檢出陽(yáng)性率低的缺點(diǎn)，而且PCP患者往往存在痰液過(guò)少，難以留取的問(wèn)題。有學(xué)者Gupta[14]就提出用BALF作為首選標(biāo)本，學(xué)者Rodifio[15]也認(rèn)為BALF的診斷率高，本研究基本與相關(guān)的研究相符，所以如果病人能夠耐受，BALF是比較佳的選擇。

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·綜述·

(收稿日期2015-10-26；修回日期2015-12-29)

通信作者：邵筱，男，1976年6月出生，博士，研究生導(dǎo)師，大學(xué)講師，主要研究方向：病原生物學(xué)。

作者簡(jiǎn)介：陳達(dá)富，男，1981年7月出生，主管技師，本科，學(xué)士學(xué)位，主要研究方向：生物化學(xué)檢驗(yàn)與微生物檢驗(yàn)。

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.01.010

中圖分類號(hào)：R512.91，R446.62

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-1129(2016)01-0029-02