熱休克蛋白27、60和90在胃癌中的表達及其臨床價值

周高見（中信湘雅生殖與遺傳專科醫院，湖南長沙410078）

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熱休克蛋白27、60和90在胃癌中的表達及其臨床價值

周高見
（中信湘雅生殖與遺傳專科醫院，湖南長沙410078）

摘要：目的探討熱休克蛋白（HSP-27）、HSP-60和HSP-90在胃癌中的表達及其臨床意義。方法采用免疫組織化學法檢測66例胃癌組織HSP-27、HSP-60和HSP-90的表達，并結合臨床病理特征、腫瘤增殖能力和患者生存期，分析3種熱休克蛋白（HSPs）表達的臨床意義。結果HSP-27、HSP-60和HSP-90在胃癌組織中異常高表達。HSP-27表達與腫瘤大小、器官轉移及病理分期相關，而HSP-27染色強度與淋巴轉移顯著相關。HSP-60表達與患者性別相關，而HSP-60染色強度與患者年齡和腫瘤病理組織學分級相關。HSP-90染色強度與腫瘤大小顯著相關（P=0.020）。單因素分析表明，HSP-90高表達與生存期更長顯著相關，多因素分析證實HSP-90高表達是胃癌獨立預后因素。結論HSP-27、HSP-60和HSP-90與具有治療胃癌療效評估價值的臨床病理參數相關。HSP-90高表達是胃癌的獨立預后指標。

關鍵詞：胃癌；熱休克蛋白；預后

熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）是在所有物種中廣泛存在、高度保守的蛋白，通常由熱休克、環境變化及生理病理壓力誘導引起，HSPs由幾種不同基因產物組成，通常根據其分子質量命名[1]。HSPs的主要功能是作為分子伴侶，能夠維持其他多肽穩定性和轉移功能，熱休克蛋白的這一功能在保持正常細胞完整性和在惡性細胞生長中的作用十分重要。沒有外界壓力時，HSPs與熱休克轉錄因子形成復合物，維持失活狀態[2]；壓力狀態下，HSPs抑制分子伴侶，與錯誤折疊蛋白質連接，通過蛋白激酶C和絲氨酸/酪氨酸激酶等蛋白激酶磷酸化使熱休克轉錄因子激活[3]。由此，熱休克轉錄因子在胞漿內形成同源三聚體結構，并與熱休克元素結合，激活熱休克誘導基因。

除了應答熱休克、化學或物理因素刺激，HSPs在乳腺癌、子宮內膜癌、宮頸癌、結腸癌、肺癌和前列腺癌等多種人類腫瘤中過表達[4]。多種HSPs表達與腫瘤細胞增殖和分化、多種類型腫瘤中凋亡相關分子調控密切相關。目前，已有數種針對HSPs的抗腫瘤藥物在進行臨床前期實驗。例如，靶向HSP-90藥物17AAG和SNX2112能夠選擇性抑制表達HSP-90的腫瘤細胞，而影響正常細胞功能[5]。

胃癌是中國及其他亞洲國家發病率較高的消化道惡性腫瘤。幽門螺旋桿菌感染和吸煙被認為是胃癌發生的環境因素。近來有研究表明，HSPs與胃腫瘤密切相關[6]。但是關于HSPs表達與胃癌治療和患者預后相關性的研究較為少見。

本研究主要評估胃癌組織中HSP-27、HSP-60 和HSP-90的表達，并探討其與胃癌患者臨床參數和生存期的相關性。

1　資料與方法

1.1研究對象

選取2007年1月-2008年12月于湘雅醫院普外科接受外科手術治療的66例原發性胃腺癌患者納入本研究。其中，男性47例，女性19例；年齡34～86歲，中位年齡56歲。患者術前經胃鏡活檢病理、CT或MRI檢查確診，臨床和病理資料完整。接受胃癌根治術者31例，接受非根治性手術者35例。同時選擇胃癌組織和癌旁正常胃黏膜組織作為對照組。

1.2免疫組織化學法檢測HSP-27、HSP-60和HSP-90表達

HSP-27、HSP-60和HSP-90抗體購自美國Santa Cruz公司，免疫組織化學試劑[PV6000和二氨基聯苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色液]購自北京中杉金橋生物技術有限公司。主要實驗步驟：石蠟切片常規脫蠟、水化，用3％雙氧水H2O2。去離子水孵育10 min阻斷內源性過氧化物酶。微波抗原熱修復后，滴加一抗，置入4℃冰箱保存過夜。滴加二抗，37℃保溫箱孵育15 min。滴加DAB溶液顯色、復染、脫水、封片，光鏡下觀察。以磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）代替一抗為陰性對照，以出現棕黃色或棕色顆粒的細胞作為陽性細胞，HSP-27、HSP-60和HSP-90陽性部位在細胞漿。陽性強弱的標準判斷按光鏡下觀察陽性染色的細胞比例（5個高倍視野下的均數）：①染色細胞數<10％為陰性；②染色細胞數10％～50％為陽性；③染色細胞數>50％為強陽性。顯微攝像并用圖像分析儀進行光密度值檢測。

1.3統計學方法

采用SPSS 18.0統計軟件進行數據處理，用單因素方差分析（One-way，ANOVA）HSP-27、HSP-60和HSP-90蛋白表達水平與性別、年齡、癌細胞分化程度及臨床分期等各臨床病理參數間的相關性；對胃癌HSP-27、HSP-60和HSP-90表達進行分層比較，用單因素和多因素分析研究各因素對預后的影響，P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1免疫組織化學結果

HSP-27、HSP-60和HSP-90在胃癌中的表達明顯高于正常組織。HSP-27、HSP-60和HSP-90典型免疫染色見圖1A～C。

2.2HSP-27、HSP-60和HSP-90表達的臨床意義

HSP-27表達平均值為52％，而在胃癌組織中HSP-27高表達（50％）。HSP-27的免疫染色強度分為輕度20例（30％）、中度40例（61％）及重度6例（9％）。HSP-27表達與腫瘤大小、器官轉移及病理分期相關（P=0.026、0.046和0.041）。HSP-27染色強度與淋巴結陽性顯著相關（P=0.042）。見表1。

HSP-60表達平均值為52％，而在胃癌組織中HSP-60高表達（55％）。HSP-60免疫染色強度分為輕度21例（32％）、中度32例（48％）及重度13例（20％）。HSP-60表達與患者性別（P=0.011）相關。HSP-60染色強度與患者年齡及腫瘤組織學分級顯著相關（P=0.027和0.031）。見表2。

圖1　HSP-27、HSP-60和HSP-90在胃癌組織中的表達（×200）

表1　66例胃癌患者HSP-27表達、染色強度和臨床病理特點　例（％）

表2　66例胃腺癌患者的HSP-90表達、染色強度和臨床病理特點　例（％）

續表1

HSP-90表達平均值為48％，而胃癌組織中HSP-90高表達（55％）。HSP-90免疫染色強度分為輕度30例（45％）、中度31例（47％）及重度5例（8％）。HSP-90表達與本研究所分析的臨床病理參數無關。HSP-90染色強度與腫瘤大小顯著相關（P= 0.020）。見表3。

表3　66例胃癌患者的HSP-90表達、染色強度和臨床病理特點　例（％）

2.3胃癌HSP-27、HSP-60和HSP-90表達的相關性

本研究采用斯皮爾曼等級相關系數評估HSP-27、HSP-60和HSP-90表達的相關性，結果表明，HSP-27表達與HSP-60和HSP-90表達呈正相關（rs1=0.47，P1=0.000；rs2=0.32，P2=0.008），HSP-60和HSP-90表達程度也呈正相關（rs=0.25，P=0.044）。見表4。

表4　66例胃癌患者的HSP-27、HSP-60和HSP-90蛋白質表達程度的斯皮爾曼等級相關性

2.4胃癌中HSP-27、HSP-60和HSP-90表達的預后意義

Kaplan-Meier生存曲線分析表明，胃癌中HSP-27、HSP-60表達與患者總體生存期無關（P =0.478和 0.953），而單因素分析表明，HSP-90高表達與低表達胃癌患者生存率比較差異有統計學意義（P=0.033）（見圖2A），多元回歸分析也證實HSP-90表達具有預后意義（P=0.026）。HSP-27、HSP-60和HSP-90免疫染色強度與患者生存率無關（P=0.577、0.094和0.299）。多元回歸分析還發現，淋巴結陰性胃癌患者（pN0）HSP-90高表達與生存率相關（P =0.042）（見圖2B）；高度及中度分化（G1/G2）胃癌患者HSP-90高表達與較長整體生存時間顯著相關（P =0.036）（見圖2C）。未發生臟器轉移的胃癌患者（pM0）HSP-90高表達與較長生存時間顯著相關（P=0.027）（見圖2D），多因素分析證實HSP-90高表達是胃癌患者獨立預后因素（P=0.032）。

圖2　HSP-90表達對胃癌患者生存期的影響

3　討論

HSPs在多種人類腫瘤細胞中過表達，本研究進一步證實HSP-27、HSP-60和HSP-90表達在胃癌發展中的臨床意義。本研究結果表明，HSP-27、HSP-60和HSP-90在胃癌組織中陽性表達。TAKANO[7]和KAPRANOS等[8]研究表明HSP-27的發生率分別為52.4％（22/42）和62.7％（54/86）。另外，HSP-70和HSP-40在胃癌中陽性染色百分率分別為67.9％（55/81）和22.2％（18/81）。

本研究發現，胃癌組織中HSP-27、HSP-60和HSP-90的陽性表達率分別52％、52％和48％。一項僅含10例胃癌標本的蛋白質組學研究分析表明，HSP-60、HSP-70及含TCP1伴侶蛋白亞基1（chaperonin containing TCP1，CCT）在胃癌組織中呈過表達，CCT屬于HSP-60家族成員。該研究表明，HSP-60、HSP-70和CCT過表達可能是由惡性轉化期間細胞的脅迫應答和自我保護機制引起[9]。

研究發現，HSP-27表達程度與HSP-60和HSP-90蛋白質的表達程度呈正相關（斯皮爾曼等級相關），并得出HSP-60與HSP-90的表達有較低的相關性（斯皮爾曼等級相關）。本研究發現，HSP-27表達及免疫染色強度與患者治療時重要臨床病理特征存在相關性。本結果與之前的一項證據一致，該研究在86例人類胃癌樣本中證實HSP-27表達與淋巴轉移存在相關性[8]。本研究也發現，HSP-27強度與免疫染色表達和淋巴腺狀態分別存在著顯著及邊界相關性。另外，HSP-27表達與器官轉移的出現、腫瘤大小和病理分期顯著相關。然而，HSP-27表達和染色強度與患者生存不相關。Isomoto[10]和Maehara等[11]也都未發現HSP表達與患者生存的任何相關性。事實上，組織病理分化與HSP-70的表達顯著相關，然而HSP-70和HSP-40表達對任何推測預后及生存的因素都沒有影響。

HSP-60表達與患者性別顯著相關，而與Ki-67標記指數反映的腫瘤病理組織學分級和增殖能力僅有邊界相關性。事實上，女性患者體內發現的HSP-60表達要高于男性患者，而不良分化腫瘤中HSP-60的表達頻率則高于高度和中度分化腫瘤。另外，HSP-60的染色強度與患者年齡及腫瘤病理組織學分級顯著相關。

根據本研究結果，HSP-90與臨床病理特征無關。然而，HSP-90免疫染色強度與腫瘤大小顯著相關，與病理組織學類型邊界相關。總體來說，已經在幾種類型癌癥中對HSP-90表達值進行檢測；關于胃癌，Flandrin等[13]報告HSP-90α與淋巴轉移有顯著相關性。

目前，尚無關于胃癌中HSP-90表達預后價值的研究報道。本研究為檢查胃腺癌患者預后方面HSP-90表達的臨床意義的第一份報道。單因素生存分析中，較高的HSP-90蛋白質表達與較長的整體生存時間相關。另外，單因素生存分析顯示，HSP-90蛋白質表達對于胃腺癌患者是一個重要并獨立的預后因素。在淋巴結陰性的不同臨床亞組中，高度和中度分化、器官轉移陰性和HSP-90高蛋白質表達與預后良好相關。此外，HSP-90表達和免疫染色強度顯示出在腸型中與整體生存時間相關的趨勢，但該趨勢并不存在于彌漫型胃癌病例中。彌漫型和腸型胃癌患者之間對立的HSP-90過表達預后值可以歸因于腫瘤微環境和每個腫瘤病理組織學類型的個體細胞特點所產生的不同信號。這樣明顯的不同能夠觸發腫瘤樣細胞來上調或下調與腫瘤病理組織學類型相關的HSP-90信號。總之，HSP-27、HSP-60和HSP-90與部分胃癌臨床病理參數有關，該參數對評估胃腺癌患者的療效具有重要價值。HSP-90高表達是胃腺癌患者的獨立預后指標。

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（申海菊編輯）

Expression of HSP-27, 60 and 90 in gastric cancer and its clinical significance

Gao-jian Zhou
(Reproductive and Genetic Hospital of China International Trust and Investment Company-Xiangya, Changsha, Hunan 410078, China)

Abstract:Objetives To evaluate the clinical significance of heat shock protein (HSP)-27, HSP-60 and HSP-90 expression in gastric carcinoma.Methods HSP-27, HSP-60 and HSP-90 expression was assessed immunohistochemically in tumoral samples of 66 gastric adenocarcinoma patients and was statistically analyzed in relation to various clinicopathological characteristics, tumor proliferative capacity and patients' survival.Results HSP-27, HSP-60, HSP-90 were abundantly expressed in the gastric adenocarcinoma tissues.HSP-27 expression was significantly associated with tumor size, the presence of organ metastases and pathological stage, while HSP-27 staining intensity was significantly correlated with nodal status.HSP-60 expression was significantly correlated with patients' sex, while HSP -60 staining intensity with patients' age and tumor histopathological grade.HSP-90 expression was not associated with any of the clinicopathological parameters examined; however, HSP-90 staining intensity was significantly associated with tumor size.High HSP-90 expression was significantly associated with longer overall survival time in univariate analysis, and was also identified as an independent prognostic factor in multivariate analysis.Conclusions HSP-27, HSP-60 and HSP-90 are correlated with certain clinicopathological parameters which are crucial for the management of gastric adenocarcinoma patients.HSP-90 expression may also be an independent prognostic indicator in gastric adenocarcinoma patients.

Keywords:gastric cancr; heat shock protein; prognosis

收稿日期：2015-10-16

文章編號：1005-8982（2016）01-0069-07

中圖分類號：R735.2

文獻標識碼：A