健脾消癌方對大腸癌肝轉移裸鼠模型肝組織MMP?9、TIMP?1表達的影響*

楊 曉，蔣益蘭，李勇敏，譚小寧，簡小蘭，羅 星

（1.湖南中醫藥大學，長沙 410208；2.湖南省中醫藥研究院附屬醫院，長沙 410006）

健脾消癌方對大腸癌肝轉移裸鼠模型肝組織MMP?9、TIMP?1表達的影響*

楊 曉1，蔣益蘭2△，李勇敏2，譚小寧2，簡小蘭1，羅 星2

（1.湖南中醫藥大學，長沙 410208；2.湖南省中醫藥研究院附屬醫院，長沙 410006）

目的：研究中藥健脾消癌方對大腸癌肝轉移裸鼠模型肝組織中基質金屬蛋白酶?9（MMP?9）及組織金屬蛋白酶抑制劑?1（TIMP?1）表達的影響，探索其防治大腸癌肝轉移的分子機制。方法：建立人大腸癌細胞肝轉移裸鼠模型，將模型按隨機數字表法分為健脾消癌方組、陽性對照組、模型組、空白對照組并觀察各組裸鼠肝轉移情況，測定其肝組織中MMP?9、TIMP?1表達量。結果：健脾消癌方組肝轉移率低于模型組及陽性對照組；健脾消癌方組肝組織中MMP?9及TIMP?1表達低于陽性對照組及模型組，高于空白對照組；健脾消癌方組MMP?9／TIMP?1比值低于陽性對照組及模型組，而與空白對照組間比較差異無統計學意義。結論：健脾消癌方可抗結腸癌肝轉移，其機制可能與下調MMP?9及TIMP?1表達、保持二者間的動態平衡有關。

健脾消癌方；大腸癌；肝轉移；MMP、TIMP表達

大腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其發病率呈逐年上升趨勢。肝轉移是結直腸癌患者預后差的主要原因。前期研究證實，健脾消癌方能降低大腸癌術后患者的復發轉移率，并可降低大腸癌術后裸鼠模型肝轉移率。基質金屬蛋白酶（MMPs）及組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）可通過調節細胞外基質降解及血管生成情況，在一定程度上影響結直腸癌患者的復發轉移率。其中MMP?9能特異性地破壞基底膜的明膠纖維，從而促進結直腸癌轉移尤其受到重視［1］。而TIMPs是MMPs的天然抑制物，其中TIMP?1能抑制絕大多數MMPs活性［2］。因此，本實驗擬從MMP?9及TIMP?1入手，探索健脾消癌方抗大腸癌肝轉移的分子機制。

1 材料

1.1 動物與細胞

BALB／c?nu裸鼠48只，雌雄各半，4～6周齡，體質量16～20 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司（合格證號43004700001492），于 SPF環境中飼養。人結腸癌細胞株HCT116購買于中南大學湘雅醫學院細胞中心。

1.2 主要試劑及儀器

小鼠MMP?9、TIMP?1試劑盒，上海國藥生物有限公司；倒置顯微鏡，德國LEICA公司；CO2恒溫孵育箱，法國Jouan6500系列；電泳儀，Bio?rad公司；手術相關器械由湖南省中醫藥研究院附屬醫院實驗室提供。

1.3 藥物及制備

健脾消癌方由黨參、白術、茯苓、法夏、黃芪、靈芝、炒枳殼、薏苡仁、仙靈脾、郁金、莪術、白花蛇舌草、半枝蓮、重樓、甘草組成。以上藥物依照《中華人民共和國藥典》（2012年版）標準規格采購于湖南省中醫藥研究院附屬醫院中藥房。取以上15味藥，5倍量處方，10倍溫水浸泡0.5 h，加熱煎2 h趁熱過濾。藥渣再加8倍水煎煮2次，每次0.5 h趁熱過濾。將3次水煎溶液混勻、過濾，減壓濃縮至濃度為2.1 g／ml的溶液，0.25 g／支，密封后4℃保存備用。陽性對照藥5?氟尿嘧啶購自北京紫竹藥業有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養

人結腸癌HCT116細胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基于37℃、5%CO2的培養箱中培養，細胞鋪滿80% ～90%時予以傳代。細胞培養至約合80個T25瓶量時（每瓶長滿約2×106個細胞），于對數生長期用胰酶消化后收集細胞，并以2000 r／min離心5 min后，用生理鹽水調整細胞濃度約4× 107／ml，收集好的細胞盡快接種。

2.2 模型制備

隨機選出 38只裸鼠造模，于無菌環境下用2.5%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉裸鼠（40 mg／kg）后，在左下腹切開約2.5 cm切口，使盲腸完全暴露于腹腔外。用100 ul微量注射器吸取50 ul HCT116細胞后，與盲腸壁呈30°角傾斜進針，進針深度約5 mm，將細胞注入盲腸漿膜和肌層之間，注射后用棉簽在距離注射點2mm處輕壓并迅速退針。確保無細胞懸液外滲后，用3%碘酒清潔注射區域以免種植轉移，將盲腸回納腹腔，以3?0絲線間斷縫合腹壁。

2.3 分組給藥

接種細胞15 d后，造模裸鼠存活32只，隨機選擇2只處死后解剖腹腔觀察肝臟表面，均有白灰色轉移結節形成。其余30只按隨機數字表法分為健脾消癌方組、陽性藥物對照組及模型組，10只未接種細胞的裸鼠作為空白對照組，每組10只，雌雄各半。造模后第15天開始給藥。健脾消癌方按70 kg成人320 g／d用量計算，20 g裸鼠每日劑量為320× 0.0026／0.02＝41.6 g／kg，中藥溶液灌胃量按2 ml／100 g計算，每日1次；陽性對照組裸鼠腹腔注射濃度為13 mg／ml的5?Fu（生理鹽水配制），每次給藥10 ml／kg，隔3 d給藥1次；模型組及空白對照組以生理鹽水灌胃2 ml／100 g，每日1次。連續給藥4周，末次給藥2 h后處死。

2.4 觀察指標

2.4.1 肉眼觀察 動物死亡或處死后即刻打開腹腔，充分暴露肝臟，仔細觀察肝臟表面有無轉移結節，同時觀察腹腔淋巴結及其他臟器有無轉移。

2.4.2 形態學觀察 裸鼠死亡后，取裸鼠部分肝臟標本（有轉移結節者以結節為中心取材）以10%福爾馬林固定，24 h后以蘇木精?伊紅（HE）染色制作病理切片，置于顯微鏡下觀察。

2.4.3 肝組織MMP?9、TIMP?1蛋白表達檢測

稱取0.1 g肝組織，用PBS洗滌1次后加入200 ulRIPA裂解液提取細胞總蛋白，經過電泳及轉膜后加入100 ml／L 5%的脫脂奶粉，封閉60 min，加入MMP?9、TIMP一抗（稀釋比例1∶200），4℃過夜，TBS?T洗3次后將稀釋后的二抗（用封閉液稀釋HRP標記的二抗，稀釋比例1∶3000）與膜共同孵育45～60 min。TBS?T洗3次后，采用化學發光試劑曝光顯影，掃描底片。

2.5 統計學方法

采用SPSS 19.0統計軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較符合正態分布，方差齊性采用LSD法，符合正態分布、方差不齊采用Tamhane′s T2法，不符合正態性用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 健脾消癌方對肝轉移的影響

圖1顯示，模型組、陽性對照組及健脾消癌方組可在裸鼠肝臟表面見1個或多個白灰色轉移結節，部分裸鼠可見肺及腹腔淋巴結轉移。

圖2顯示，光鏡下觀察可見空白對照組肝臟細胞生長正常，肝小葉結構完整。健脾消癌方組、陽性對照組以及模型組可見肝小葉結構破壞。部分裸鼠肝臟可見浸潤性生長的癌細胞團，切片染色示分化差的腺癌，部分裸鼠肝臟鏡下可見壞死組織帶。健脾消癌方組中5例未見肝轉移瘤，其中1例可見異常增生的肝細胞，深染，未見細胞漿，肝細胞呈核分裂狀態。

3.2 健脾消癌方對肝組織MMP?9、TIMP?1表達的影響

表1顯示，與空白對照組比較，各組MMP?9及TIMP?1表達均增加（P＜0.05）；健脾消癌方組MMP?9及TIMP?1表達低于陽性對照組及模型組（P＜0.05）。提示結腸癌肝轉移裸鼠模型肝組織中MMP?9及TIMP?1表達升高，健脾消癌方能降低大腸癌肝轉移裸鼠模型肝組織中MMP?9及TIMP?1蛋白表達水平。此外，模型組及陽性對照組MMP?9／TIMP?1比值較空白對照組明顯增加（P＜0.01）；而健脾消癌方組與空白對照組比較，MMP?9／TIMP?1比值差異無統計學意義（P＞0.05）；健脾消癌方組MMP?9／TIMP?1比值低于陽性對照組及模型組（P＜0.01）。提示結腸癌肝轉移裸鼠模型肝組織中MMP?9／TIMP?1有升高趨勢，健脾消癌方能降低大腸癌術后肝轉移裸鼠模型肝組織中MMP?9／TIMP?1比值。

圖1 造模各組裸鼠肝轉移情況肉眼觀察

圖2 各組裸鼠肝臟病理切片鏡下觀察

表1 各組裸鼠肝轉移率及肝組織中MMP?9、TIMP?1蛋白表達比較

4 討論

腫瘤的侵襲轉移是大腸癌患者死亡的主要原因。細胞外基質（ECM）是腫瘤轉移過程中必須克服的生理屏障。大量研究證實，MMPs是降解ECM最重要的酶類。Derek C.Marshall［3］等經研究發現，MMP?9的選擇性抑制劑可減慢外科原位移植結直腸癌模型小鼠腫瘤生長速度，并降低轉移發生率，表明MMP?9可促進結直腸癌轉移。TIMPs作為MMPs的天然抑制物可下調MMPs活性，對于維持ECM的穩態具有重要作用。TIMP?1可通過與MMPs或其前體結合而抑制大多數MMPs活性。本實驗研究發現，結腸癌肝轉移裸鼠模型肝組織中 MMP?9及TIMP?1均有升高趨勢，中藥復方在抗大腸癌肝轉移的同時，二者表達水平均降低。

陶國全［4］研究發現，TIMP?1蛋白在結直腸癌組織中表達增高，此結果與本研究一致。并發現TIMP?1表達高低與腫瘤大小、淋巴轉移、臨床分期呈正相關，下調TIMP?1基因表達能顯著抑制結直腸癌細胞的遷移能力，提示TIMP?1除可通過MMPs途徑抑制ECM降解外，還可能通過其他途徑促進結直腸癌細胞侵襲轉移。維持TIMP?1與其他相關分子間的動態平衡，可能是改善大腸癌患者預后的關鍵。

健脾消癌方是蔣益蘭教授根據多年臨床經驗以“健脾益氣，化瘀解毒”為法創制而成。前期研究表明［5］，該方能在一定程度上降低大腸癌術后復發轉移率，延長患者生存期。本研究結果表明，健脾消癌方可下調結腸癌肝轉移裸鼠模型肝組織中MMP?9、TIMP?1表達，恢復MMP?9／TIMP?1比值，提示健脾消癌方可能通過下調MMP?9及TIMP?1表達，保持二者間的動態平衡，發揮抗結腸癌肝轉移作用，其具體調節機制有待進一步的研究。

［1］ 劉超，仰曙芬，付玉.MMP2、MMP9與結直腸癌的研究進展［J］.中華結直腸疾病電子雜志，2014，3（3）：195?197.

［2］ Visse R，HideakiN.Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases structure， function， and biochemistry［J］.Circ Res，2003，92：827.

［3］ Derek C.Marshall1，Susan K.Lyman1，Scott McCauley，etal.Selective Allosteric Inhibition of MMP9 Is Efficacious in Preclinical Models of Ulcerative Colitis and Colorectal Cancer［J］.PLOS One，2015，10（5）：e0127063.

［4］ 陶國全.TIMP1在結直腸癌中的作用及其調控機制［D］.廣州：南方醫科大學，2013.

［5］ 蔣益蘭，俞天俊，趙曄.健脾消癌方治療老年中晚期大腸癌臨床觀察［J］.中國中醫藥信息雜志，2014，21（3）：94?96.

Effect of Jianpi Xiaoai Prescription on MMP?9 and TIMP?1 Expression in the Liver Tissue on Nude Mice Model of Colorectal Cancer with Liver Metastasis

YANG Xiao1，JIANG Yi?lan2△，LI Yong?min2，TAN Xiao?ning2，JIAN Xiao?lan1，LUO Xing2
（1.Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410208，China；2.The Hospital Attached to Hunan Academy of Chinese Medicine，Changsha 410006）

Objective：To investigate the effects of Jianpi Xiaoai Recipe on Matrix metalloproteinases?9（MMP?9）and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase?1（TIMP?1）expression in liver tissues of nude mice model of liver metastasis of colon cancer.Methods：The HCT116 cells were used to establish the model of colon cancer liver metastasis in nude mice.Then the models were randomly divided into Jianpi Xiaoai Recipe group，positive control group，model group and blank control group.The expression of MMP?9 and TIMP?1 in liver tissues was tested by Western Blot method.Results：The liver metastasis rate and the expression of MMP?9 and TIMP?1 in the liver tissues were significantly lower in Jianpi Xiaoai Recipe group than in the model group and the positive control group；The MMP?9／TIMP?1 ratio was lower in Jianpi Xiaoai Fang group than in the model group and the positive control group，but there was no significant difference between Jianpi Xiaoai Recipe group and the blank control group.Conclusion：Jianpi Xiaoai Recipe could reduce the liver metastasis rate of colon cancer，the mechanism may down regulats the expression of MMP?9 and TIMP?1 in liver tissues，and maintain the dynamic balance between them.

Jianpi Xiaoai Recipe；Colorectal cancer；Liver metastasis；The expression of MMP?9 and TIMP?1

R285.5

：B

：1006?3250（2016）10?1323?03

2016?04?06

國家自然科學基金面上項目（81373602）?結直腸癌轉移狀態與TGF?β調控網絡的相關性及益氣化瘀解毒方干預作用研究；湖南省科技計劃科研條件創新專項（2013TT1004）?SW620型裸鼠結腸癌肝轉移模型及血管生成因子調控的研究

楊 曉（1989?），女，河南商丘人，醫學博士，從事中西醫結合腫瘤防治方法與規律研究。

△

：蔣益蘭（1961?），女，湖南邵陽人，主任醫師，博士研究生導師，湖南省名中醫，從事中西醫結合腫瘤防治方法與規律研究，Tel：15574977175，E?mail：tianshangren624＠163.com。