EB病毒動物模型的研究進展*

王　芝,祁承林，李　恒，杜　龍 綜　述，唐安洲 審校

(廣西醫科大學第一附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科，南寧 530021)

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EB病毒動物模型的研究進展*

王芝,祁承林，李恒，杜龍 綜述，唐安洲△審校

(廣西醫科大學第一附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科，南寧 530021)

EB病毒；動物模型；鼻咽癌

EB病毒(Epstein Barr Virus，EBV)是1964年首次從Burkitt淋巴瘤細胞中分離得到的具有嗜B淋巴細胞特性的人類皰疹病毒。該病毒在人群中的感染率高達90%，人類通常在嬰幼兒時期就感染了EBV，并終身攜帶[1]。EBV與多種疾病關系密切，包括傳染性單核細胞增多癥、病毒相關性噬紅細胞增多癥、Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)、胃癌、霍奇金淋巴瘤等[2]。其中, NPC是我國華南地區常見的惡性腫瘤，由于其發生的解剖位置隱匿，具有明顯的地域性，且在國際上研究相對較少，目前NPC的研究面臨諸多難題。因此，構建EBV相關的動物模型對于研究EBV與NPC及其他相關疾病之間的關系，以及EBV在疾病發生、發展中所起到的作用具有重要意義。從發現EBV至今，國內外學者為建立其動物模型付出了巨大的努力，但成果并不理想。本文就近年來已報道的EBV動物模型進行綜述，探討目前存在的問題及未來的研究方向，以期為今后研究EBV提供資料。

1　EBV動物模型的研究進展

1.1靈長類動物模型研究表明，許多舊世界猴由于存在對皰疹病毒有交叉反應的抗體，對皰疹病毒不具感染性，EBV的宿主范圍僅為人及新世界猴[包括棉頂狨猴(the cotton-top marmoset)、普通狨猴(the common marmoset)和貓頭鷹猴(the owl monkey)][3]。早在20世紀80年代，陸續有學者研究了EBV對新世界猴等的感染情況。有研究通過靜脈結合腹腔及皮下的方式，對8只棉頂狨猴分別接種EBV誘導的永生化淋巴細胞及EBV懸液，其中各有一半的棉頂狨猴是在免疫抑制之后被接種的[4]。結果接種EBV誘導的永生化淋巴細胞組和EBV懸液組分別有1/4和3/4的動物被誘導出淋巴瘤。值得一提的是，成瘤的4只動物中有3只接受了免疫抑制劑，并且其中2只誘導出多種腫瘤。這些在免疫抑制狀態下的棉頂狨猴感染EBV后均產生了一系列的免疫反應，包括一些不明顯的感染和一些明顯的腫瘤形成，這一現象與免疫系統削弱的人類在EBV感染后被誘導出相關疾病極為相似。Niedobitek等[5]建立了EBV持續性感染棉頂狨猴的模型，并最終發展為淋巴瘤。Cleary等[6]用高滴度的EBV懸液接種棉頂狨猴，結果誘導出多種淋巴瘤，包括淋巴系母細胞腫瘤及漿細胞腫瘤，并用多種方法檢測出這些腫瘤包含了EBV基因、表達了EBV所有的潛伏性蛋白，這與EBVⅢ型潛伏性感染極其相似。EBV誘導的惡性腫瘤通常是致命的，但由于機體的T淋巴細胞免疫應答，其誘導的感染性損傷則多是可逆的，這些實驗中EBV誘導的淋巴瘤在嚴重免疫削弱人群所患惡性淋巴組織增生相關研究中有著重要價值。普通狨猴也曾作為研究EBV的動物模型，有研究者成功建立了EBV持續感染普通狨猴的動物模型，遺憾的是，僅在狨猴體內檢測到不典型的傳染性單核細胞增多及相關的抗體的變化，未能誘導出淋巴瘤[7]。

1.2嚴重聯合免疫缺失(severe combined immune-deficiency，SCID)小鼠模型1988年，Mosier等[8]在體外利用EBV的病毒懸液感染人外周血淋巴細胞(human peripheral blood lymphocyts，huPBLs)建立淋巴系母細胞(lymphoblastoid cell lines，LCLs)，后接種至SCID小鼠腹腔以對其進行人類免疫功能的重建，構建了人源性SCID小鼠(hu-PBL-SCID mice)模型，成功地觀察到B淋巴細胞組織增生及淋巴瘤。國內外陸續有學者在研究中同樣證實了這一結果[9-11]。有研究證明大多數外周血淋巴細胞(peripheral blood lymphocyts，PBL)可在免疫重建的SCID小鼠體內存活2～4周，然后自然死亡[12]。有學者將EBV陽性胃癌細胞移植到SCID小鼠身上，成功誘導出EBV相關胃癌模型[13]。在EBV潛伏基因表達模式等方面，移植胃癌和原胃癌細胞完全一致, 可以作為研究這種特殊類型胃癌的動物模型。另有研究通過建立EBV感染的SCID小鼠模型，證實在小鼠的腫瘤細胞中能檢測出EBV核抗原Ⅰ(EBV encoded nuclear antigen-1，EBNA-1)的mRNA表達，提示EBNA-1可能是臨床EBV相關腫瘤的治療靶點[14]。最近，有研究通過建立SCID小鼠誘發淋巴瘤動物模型，檢測到潛伏膜蛋白(latent membrane protein，LMP)的表達上調，推測其可能是EBV主要的致病因子，在淋巴細胞發生惡性轉化的過程中可能發揮了重要作用[15]。Ma等[16]通過接種CD34+細胞對SCID小鼠進行免疫重建，后接種EBV的病毒懸液建立動物模型，證明了EBV早期裂解蛋白對于淋巴瘤產生的作用。Chijioke等[17]通過建立SCID小鼠感染EBV模型，證明了人類自然殺傷細胞(human natural killer cells，NK細胞)可以抑制EBV裂解性感染，進而降低傳染性單核細胞增多癥及淋巴瘤的發生。Hartlage等[18]通過建立hu-PBL-SCID小鼠模型，研究了EBV相關裂解蛋白(BamH Ⅰ Z left fragment 1，BZLF1)有可能成為研發EBV疫苗的靶向抗原，這項研究對于EBV疫苗及相關疾病的預防控制有著重要的價值。

1.3轉基因動物模型轉基因動物是指用人工的方法將致病基因與啟動子連接后通過顯微注射、逆轉錄病毒載體、胚胎干細胞、精子載體等技術導入宿主動物體內,使之整合到宿主基因組而穩定表達,并具有遺傳功能的一類動物。

目前，EBV轉基因動物模型大多局限于針對EBNA-1或潛伏膜蛋白1(latent membrane protein 1，LMP1)等單個基因而建立的。有研究通過連接EBNA-1基因與免疫球蛋白基因啟動子Eμ制備轉基因小鼠，成功地在這些小鼠身上發現了淋巴瘤[19]。這一團隊還曾用同樣的方法制備Eμ與LMP1基因連接的轉基因小鼠，但除口腔黏膜白斑的上皮增生性病變外，未見其他異常，且小鼠大部分在發育期死亡，未能檢測到腫瘤的發生，但這項研究證明了LMP1可以激活多種關鍵因子并促進新生血管的形成及炎性反應，更進一步地證實了淋巴細胞缺陷能削弱LMP1的促炎性反應及致癌作用。這一研究探索了EBV相關惡性腫瘤及其主要致癌因子，也為治療和干預EBV相關疾病打下了基礎[20]。有研究者通過構建含金屬硫蛋白基因-1(metallothionein-1，MT-l)調控區和LMP基因的pBR322-MT-LMP質粒, 用顯微注射法將MT-LMP轉基因接種于小鼠受精卵內制備轉基因小鼠的動物模型，構建了攜帶LMP基因的轉基因動物，成功率為8%[21]。有學者通過獲得帶有CMV啟動子的EBV膜抗原(membrane antigen，MA)片段，采用顯微注射法將其注入小鼠受精卵的雄性原核中，制備了攜帶LMP1(BLLF1)基因的轉基因小鼠, 并用各種檢測方法分析了BLLF1基因在轉基因小鼠外周血淋巴細胞中的表達及MA在細胞中的表達部位[22-23]，為深入研究EBV感染與自身免疫病的關系提供了有利的動物模型。有研究通過連接免疫球蛋白中的重鏈啟動子和增強子與LMP1基因，成功構建了轉基因小鼠并檢測到B淋巴細胞瘤的發生，致瘤率高達42%[24]。此外，研究者對這批轉基因小鼠進行EBV相關基因檢測，發現只有LMP1表達水平較高,由此證明了LMP1蛋白對于EBV致瘤的作用極其關鍵,是具有致瘤作用的蛋白質。有學者構建了表達EBV潛伏膜蛋白2A(latent membrane protein 2A，LMP2A)的轉基因小鼠, 表明LMP2A可以提供B淋巴細胞受體陰性的B淋巴細胞存活信號, 并發現LMP2A對于淋巴瘤的發生也至關重要[25]。有研究利用ED-L2是存在于EBV基因組內部嗜鱗狀上皮的相對特異啟動子這一特性，構建了周期素D1(Cyclin-D1)的轉基因小鼠, 結果在口腔、食管、前胃等部位的鱗狀上皮發現了異常增生[26]，并導致細胞周期、表皮生長因子受體、p53蛋白活性的異常[27]。有研究者構建了ED-L2、PLUNC-P雙啟動子調控NPC來源的LMP1表達載體,采用受精卵前核顯微注射法構建轉基因小鼠，獲得了58只轉基因鼠，其中4只整合陽性,并發現1只轉基因小鼠的鼻咽、前胃、舌根等部位有外源基因的表達，但在鼻咽上皮細胞未發現明顯的病理改變[28]。有學者采用免疫球蛋白基因啟動子構建了可以表達人補體受體Ⅱ型基因(CR2)的轉基因小鼠,在這些轉基因小鼠體內發現了外周血B淋巴細胞被EBV感染,說明EBV確實可以通過人CR2進入B淋巴細胞[29]。有研究采用SV40啟動子與EBV核抗原2(EBV encoded nuclear antigen-2，EBNA-2)基因連接構建了轉基因小鼠模型,在這些動物體內檢測到EBNA-2的表達，并觀察到腎小管增生性病變, 繼而發展到腎腺癌[30]。馮湘玲等[31]將ED-L2-綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)注射入爪蟾受精卵制備了轉基因蛙,研究了EBV中啟動子ED-L2啟動GFP在爪蟾早期胚胎中的表達情況,為研究和判斷啟動子在體內的組織特異性提供了一種有效的方法。最近，Chang等[32]通過連接C57BL/6啟動子與LMP2A基因，制備出LMP2A的轉基因小鼠，發現表達LMP2A基因的小鼠腦脊髓炎癥較不表達的小鼠加重且發生率更高，說明LMP2A可以提高抗原提呈功能，促進炎癥的發生、發展。此外，還研究了LMP1和LMP2A是否可以在轉基因小鼠體內共表達，以及LMP2A是否可以對LMP1的功能進行調節。這一研究證實，在體外LMP1可以上調B淋巴細胞活化因子并促進其增生，而LMP2A的共表達可以修復B淋巴細胞，表明LMP2A可能通過調控腫瘤壞死因子受體相關因子2A(tumor necrosis factor receptor-associated factor 2A，TRAF2A)來調節B淋巴細胞的功能[33]。黃海城[34]通過連接NPC來源的LMP1(N-LMP1)和CR2，分別利用泛表達啟動子CMV和嗜鱗狀上皮啟動子ED-L2，篩選出整合了N-LMP1和CR2雙基因的細胞系,將其與卵母細胞融合,通過電激活和化學激活后，將產生的重構胚移植到受體母豬的子宮內,受孕3個月后共生產出16頭小豬,其中轉基因陽性豬6頭，但這6頭陽性克隆豬均在2周內死亡,未能檢測RNA和蛋白質水平是否表達,分別解剖出舌、喉咽、會厭等部位，蘇木精-伊紅(HE)沒有發現組織形態有異常，究其原因可能與豬存活的時間太短有關。這項研究雖未能達到預期的效果，但已經將NPC的相關基因運用到除轉基因小鼠以外的動物模型上，進行了有意義的嘗試，同時也為以后構建豬NPC模型提供了一些有價值的參考資料。

1.4兔子、豚鼠EBV動物模型有學者通過口腔接種B95-8細胞的細胞懸液入健康大白兔體內，雖然在接種之后2 h內觀察到抗EBV衣殼抗原(viral capsid antigen，VCA)-IgG及EA-DR IgG水平升高，但由于未能檢測到其他感染跡象，也未見任何腫瘤的發生，尚不能認為這些兔子被EBV的病毒懸液成功感染[35]。有研究通過對7只健康兔子進行靜脈注射接種EBV的病毒懸液，結果在其中6只日本大白兔血清中檢測到抗EBV相關抗體水平的升高；5只外周血中檢測到EBV DNA的存在；組織病理學檢查發現其中2只兔子的脾臟及淋巴組織中的一些淋巴細胞表達了EBV編碼的小RNA1(EBV-encoded small RNA1，EBER1)及EBV相關蛋白，且這些淋巴細胞主要為B淋巴細胞[36]。這一研究表明，EBV可以通過靜脈接種的方式感染兔子，但由于EBV與NPC關系密切，建立鼻腔或口腔接種EBV的動物模型對研究EBV及其致病機制顯然更為必要。該團隊也通過鼻腔結合口腔的方式對大白兔接種EBV的病毒懸液，結果與之前相似，10只兔子中有4只在接種后成功感染了EBV，在外周血單個核細胞(peripheralblood mononuclear cells，PBMCs)中檢測到EBV拷貝數升高及相關基因mRNA的表達，還檢測出相關抗體水平的升高。病理學檢查發現，其中1只兔子脾臟及淋巴組織中的淋巴結表達了EBER1、LMP1及EBNA-2[37]。之后，該團隊又通過培養人EBV陽性的B淋巴瘤細胞(P3HR-1)獲得EBNA-2缺失的EBV，分別通過靜脈注射(n=4)及鼻腔接種(n=8)的方式感染兔子，結果僅2只兔子PBMCs中檢測到EBV DNA的存在及相關基因的表達。進而將這一結果與前期研究結果[36-37]比較，證明從B95-8細胞中獲得的標準EBV對兔子的感染率[91%(10/11 )]比EBNA-2缺失的EBV高[17%(2/12)]。這一研究首次通過建立自然感染EBV的動物模型，闡明了EBNA-2在其感染機體中的作用[38]，具有重要的指導意義。Rajcáni 等[39]通過鼻腔結合口腔的方式對兔子接種EBV，結果顯示感染了EBV的兔子體內相關抗體Zta/BZLF1 IgG、早期抗原(EA)抗體IgG、及VCA IgG水平均有上升，但EBNA-1 IgG水平始終未上升，并且也未能出現傳染性單核細胞增多癥的表現。由此說明，EBNA-1在被感染的兔子體內缺失，并且兔子感染EBV與人類感染EBV所導致的機體反應不同。Khan等[40]通過靜脈注射的方式對6只美國大白兔接種EBV的病毒懸液，結果6只兔子血清中都檢測到抗EBV相關抗體IgG及IgM水平的升高，而PBMCs中EBV DNA只是短暫的被檢測到；接種EBV 10周后，對這6只兔子進行持續15 d的環孢素A(每日20 mg/kg)肌內注射以進行免疫抑制，在免疫抑制后，仍然存活的4只兔子PBMCs中很容易地檢測到EBV DNA的存在及相關基因的表達，并觀察到EBV拷貝數明顯升高。對所有4只兔子進行大體解剖及病理學檢查，發現其中3只兔子出現脾臟腫大，且在這3只兔子的脾臟及肝臟中均能檢測到EBER1、LMP1、EBNA-1及EBNA-2的表達。這一研究再次證實了兔子對EBV的易感性，也表明被感染的淋巴細胞在免疫抑制的狀態下能夠增殖。以上研究分別通過不同的方式接種EBV，靜脈接種較口腔或鼻腔接種感染率更高，免疫抑制則能增加感染率，但無論是何種方式接種EBV的兔子模型，均未能檢測到任何EBV相關惡性腫瘤或淋巴組織的增生。劉國超等[41]分別通過靜脈接種及鼻腔結合口腔接種EBV懸液的方式感染20只豚鼠建立動物模型，結果兩種感染方式均出現抗EBV相關抗體VCA-IgG及EBNA-IgG水平的升高；鼻腔滴鼻結合口腔接種的10只豚鼠有6只檢測到EBV相關基因的表達，而靜脈接種的10只豚鼠均未見相關基因的表達；解剖豚鼠的腮腺、肺、脾臟、肝臟等器官組織進行病理切片分析結果顯示，鼻腔結合口腔的10只豚鼠中有5只發生不同程度的病變，包括肺間質水腫、炎性細胞浸潤等，而靜脈接種的10只豚鼠中僅1只出現輕微的肝組織炎性細胞浸潤。該學者首次應用豚鼠作為研究EBV的動物模型，盡管未能誘導出EBV相關腫瘤，也為研究EBV感染、預防及治療其相關疾病提供了基礎。

2　小結與展望

綜上所述，國內外現有的EBV動物模型包括靈長類、SCID小鼠、轉基因動物，以及兔子和豚鼠4大類，這些動物模型在研究EBV感染、致病機制及預防治療等方面有重要作用，但也存在著一些弊端。以往的實驗中，新世界猴作為最接近人類的EBV動物模型，雖然已經取得了一定的成果，但是其作為EBV動物模型也具有局限性，因為這些動物都未能通過正常的口咽接種感染EBV，或即使感染后也未能在體內病毒的持續存在下誘導出淋巴瘤。再加上新世界猴物種瀕臨滅絕，極其珍貴，以及保護政策、倫理學的要求限制了其在EBV動物模型中的繼續使用，導致自20世紀90年代后EBV新世界猴動物模型的研究停滯不前。SCID小鼠動物模型為EBV的研究提供了良好平臺，尤其在研究EBV對機體免疫系統的影響方面有著重要的意義，但其為嚴重免疫缺陷個體，并不適合研究免疫系統正常個體EBV的感染及致病機制。而轉基因動物模型的優點表現為這類動物模型能夠靶向研究單個易感基因，對研究EBV的致病機制起到不可替代的作用，但直到目前，建立的EBV轉基因動物模型無一例外的是針對局部致病機制及單個易感基因，不能模擬人的整體感染環境，這對研究由多種基因相互作用而致病的人類疾病是遠遠不夠的。而兔子和豚鼠的模型雖然是EBV自然感染的動物模型，但其感染效果比較差，且作為低等哺乳類動物，與人類同源性相差甚遠。雖能在分子細胞層次上對研究EBV提供極大幫助，但在研究人類特有的疾病方面，仍然有著不容忽視的缺陷。未來對于EBV的研究，如能在兔子及豚鼠自然感染EBV的基礎上使用非人靈長類動物，將在整體水平上具有不可替代的優勢。因此，建立一種在遺傳特征、生理解剖及病毒感染特性等方面與靈長類甚至人類之間相似性更高的動物模型，成為近年來研究EBV及其相關疾病的迫切要求。在現有的研究基礎上，建立一種非人靈長類的EBV動物模型，將為研究EBV感染人體的機制、致病機制，以及預防與治療相關疾病打下堅實的基礎。

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·綜述·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.19.040

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，E-mail:anzhoutang@126.com。

廣西科技廳廣西自然科學基金資助項目(11-31-03)。作者簡介：王芝(1989-)，在讀碩士研究生，主要從事EB病毒動物模型的構建研究。

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1671-8348(2016)19-2709-04

2016-01-08

2016-02-22)