豬傳染性胸膜肺炎的實驗室診斷方法研究進展

文/山東綠都生物科技有限公司　張文通

豬傳染性胸膜肺炎的實驗室診斷方法研究進展

文/山東綠都生物科技有限公司張文通

山東綠都生物科技有限公司 山東省濱州畜牧獸醫研究院 魏 鳳 王金良 沈志強

豬胸膜肺炎是引起呼吸系統疾病的重要傳染病之一，嚴重危害養豬業的健康發展。正確診斷豬胸膜肺炎病對防制本病極為關鍵。文章就本病病原學診斷、血清學診斷、分子生物學診斷3方面展開闡述。

豬胸膜肺炎；診斷方法；研究進展

豬傳染性胸膜肺炎（Porcine infectious pleuropneumonia）是由胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）感染引起的豬的、以急性出血性和慢性的纖維素性胸膜肺炎病變為特征的一種嚴重的呼吸系統傳染病［1］。本病廣泛存在于全世界所有的養豬國家，特別是對現代集約化養豬危害更大，是影響現代養豬業發展的重大疫病之一。本病可依據流行病學調查、臨床癥狀及剖檢時病理變化做出初步診斷。但隨著集約化養豬業的發展，豬病越來越復雜，僅靠傳統診斷方法對該病診斷已顯得較為困難，進一步確診必須依靠實驗室診斷。自1978年首次分離該病的病原以來，國內外學者對本病的診斷方法進行了大量研究，取得了顯著的成績。本文就本病實驗室診斷方法進展方面，進行了如下綜述。

1　細菌分離鑒定

無菌采取病死豬的肺臟病變組織塊或急性死亡豬的心血、胸水以及鼻腔血色分泌物，立即接種培養基［2］。37℃培養過夜，觀察結果。典型的胸膜肺炎放線桿菌菌落為黏液型蠟樣菌落。革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性，兩極著染略深的小球桿菌。胸膜肺炎放線桿菌對葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和果糖發酵產酸，尿酸酶試驗為陽性［3］。胸膜肺炎放線桿菌在金黃色葡萄球菌菌株培養物接種可形成衛星現象，即NAD生長依賴株。胸膜肺炎放線桿菌為典型的β溶血。將待檢菌株培養物直接與標準分型血清做活菌凝集檢查，可進行菌株血清定型。

細菌分離鑒定方法優點為病原學診斷最可靠，缺點是耗時長。

2　補體結合試驗（Complement Fixation Test， CFT）

1971年Nicolet建立了CFT方法，該方法在國際上被公認為檢測APP的標準方法［4］。

Lombin等于1982年改良了Nicolet的方法。其基本操作程序為：超聲波處理細菌，收集上清作為抗原；待檢血清56℃滅活后加入補體，再加入抗原，反應過夜；第2d加入小牛血清（溶血素）和綿羊紅細胞（SRBCs）。如果被檢血清中含特異抗體，則抗原抗體復合物結合補體而不出現溶血，呈陽性反應；反之，補體和溶血素與SRBCs結合，則出現溶血，呈陰性反應。

1990年朱士盛等通過將多種血清型抗原以一定比例混合成全細胞抗原凍干后應用，其抗原穩定，改良補體結合試驗更適合豬胸膜肺炎放線桿菌病的診斷。

CFT的優點是敏感性高和特異性強，缺點是操作繁鎖、費時、成本高，且檢測樣品不易標準化，一般只能在實驗室進行。

3　酶聯免疫吸附試驗（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）

自Nicolet等于1981年首次建立檢測APP的ELISA方法以來，隨后以不同抗原（如莢膜、脂多糖、外膜蛋白等）包被建立的ELISA方法也得以應用。國外已有商品化的ELISA試劑盒，敏感性和特異性較高。該方法可替代CEF作為APP的分型方法。

4　凝集試驗 （Agglutination Assay， AA）

凝集試驗是一種簡單快速檢測APP，并可用于血清型分型的方法。凝集試驗包括試管凝集、玻片凝集、協同凝集等。

Rapp等比較玻片凝集試驗與間接熒光抗體試驗發現，玻片凝集試驗比間接熒光抗體試驗的特異性和敏感性高。Mittal等比較了各種凝集試驗發現，協同凝集試驗和2-巰基乙醇試管凝集試驗的特異性與敏感性均優于玻片凝集試驗和試管凝集試驗。Habrun等比較2-巰基乙醇微量凝集試驗與ELISA試驗發現，2-巰基乙醇微量凝集試驗適合于早期感染檢測，ELISA試驗對老齡豬群的檢測較2-巰基乙醇微量凝集試驗敏感性高。

雖然快速平板凝集試驗和協同凝集試驗的敏感性不及酶聯免疫吸附試驗，但它們快速、簡便，因而也成為實驗室劃分APP的常規方法。

5　間接血凝試驗（Indirect Hemagglutination Test，IHA）

Mittal等建立了IHA用于檢測APP并對其進行血清分型。Nielson報道，IHA在血清型6和8之間有交叉反應，但能區分4型和7型。Pat Blackall應用本方法發現，仍不能區分血清型6和8及血清型9和11。然而，由于此方法操作簡便，目前已成為主要的檢測和分型方法。

6　間接熒光抗體試驗 （Indirect Fluorescence Antibody Test， IFA）

Rosendal等用IFA對APP進行檢測與血清學分型。試驗發現，除血清型6與非對應的抗血清發生交叉反應外，血清型4與7之間及血清型4與5之間均發生交叉反應。另外還發現，IFA試驗不能檢測血清型1。總之，間接熒光抗體試驗的敏感性和特異性相對較低，在實際中應用也較少。

7　乳膠凝集試驗（Latex Agglutination Test， LAT）

LAT是一種簡捷快速的檢測方法，不僅可用于檢測，亦可用于血清分型。

Inzana用同型無莢膜突變菌對有莢膜菌的抗血清進行吸附，然后用處理過的抗血清致敏乳膠。試驗結果表明，該方法特異性好、敏感性高，且簡捷、快速，適合在生產中應用。

8　免疫擴散試驗（Immunodiffusion Test，IDT）

這是一種經典的免疫學方法。1979年，Gunnarsson等將這種方法用于APP檢測，并用于血清分型。該試驗有較好的型特異性，是1986 年國際嗜血桿菌胸膜肺炎研究協作組推薦的方法之一。

李開玉等用酚水抗原檢測血清，發現特異性最高，但仍不能區分血清型1和9，血清型3、6和8。Blackall等用該方法檢測APP時，血清型15與7之間也有交叉反應。

該方法雖然簡單，但耗時較長，在孔周圍的沉淀線有的很難解釋，并且結果可能不明顯。Gunnarson等建議用試管凝集試驗代替免疫擴散試驗來確定APP的血清型。然而，由于每種特異的抗原-抗體復合物均可形成明顯的沉淀線，所以免疫擴散試驗是研究APP出現附加抗原的有效方法。

9　沉淀試驗 （Precipitation Test）

Mittal等建立了環狀沉淀試驗，用于檢測APP及血清分型，結果穩定，重復性較好，而且該方法可以對凝集試驗不能確定血清型的APP進行分型。Mittal等建議環狀沉淀試驗可取代試管凝集試驗作為常規的實驗室確定APP血清型的方法。但Mittal等認為環狀沉淀試驗所需試劑較多，應用不便。Hommez等用APP的可溶性抗原建立了玻片沉淀試驗，這種方法具有與環狀沉淀試驗相同的特異性，但操作上比環狀沉淀試驗簡單。

10　聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction， PCR）

隨著分子生物學的發展，PCR技術越來越多地應用于疾病病原地診斷。目前國內外已經建立了多種用于診斷APP的PCR方法，這些方法的敏感性和特異性均較高，且耗時短。國外已研制了一種商品化的APP PCR診斷試劑盒，可以直接用于病料中APP的檢測。

PCR方法除應用于感染動物的快速診斷外，還可用于APP的分型。與常規的血清學分型方法相比，這種分子生物學的分型方法快速、簡便，但也存在交叉反應［6］。因此，將分子生物學的分型方法與常規血清學方法相結合，無疑會提高分型的速度和準確性［7，8］。■

［1］ 白文彬，于康震.動物傳染病診斷學［M］.北京：中國農業出版社，2002，476～482.

［2］ 杜宗沛，解慧梅，吳植，等.豬放線桿菌性傳染性胸膜肺炎的診斷與預防［J］.中國獸醫雜志，2010，46（11）：78～79.

［3］ 陳慧.錦州地區豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離與鑒定［J］.安徽農業科學，2012，40（6）：3366～3367.

［4］ 余燕，馬金友，王天有，等.豬接觸傳染性胸膜肺炎的診治［J］.河南農業科學，2007（8）：107～112.

［5］ 陳小玲，楊旭夫，朱士盛，等.豬傳染性胸膜肺炎的流行現狀和防制措施［J］.中國獸醫雜志，2001（7）：33～35.

［6］ 呂素芳，郭廣君，唐娜，等.豬胸膜肺炎放線桿菌分子生物學研究進展［J］.中國人獸共患病學報，2011（27）：574～577.

［7］ 徐公義，王海麗，刁有祥，等.豬傳染性胸膜肺炎血清型與溶血毒素型的調查［J］.中國獸醫雜志，2008，44（6）：37～38.

［8］ 華云龍，張應國，鐘南，等.云南豬傳染性胸膜肺炎血清抗體調查［J］.動物檢疫，1992，9（3）：27.

山東省現代農業產業技術體系生豬產業創新團隊SDAIT-06-011-14。