川芎嗪對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用及其機制

王 娜，許海江，趙春玲

（1.杞縣人民醫(yī)院中藥房，河南杞縣475200； 2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院藥劑科，河南鄭州450002）

川芎嗪對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用及其機制

王 娜1，許海江2，趙春玲2

（1.杞縣人民醫(yī)院中藥房，河南杞縣475200； 2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院藥劑科，河南鄭州450002）

目的：觀察川芎嗪防治急性腎缺血再灌注損傷（RIRI）的作用，探討其損傷保護作用的可能機制。方法：選擇SD大鼠50只，隨機分成假手術(shù)組、對照組、川芎嗪低、中、高劑量組，每組各10只。各組分別于術(shù)前和術(shù)后24 h取血標本，檢測血清肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）含量；各組于術(shù)后24 h再次麻醉，摘取左腎，作組織學分析及檢測組織勻漿中SOD、MDA和TNF-α含量。結(jié)果：與對照組比較，川芎嗪低、中、高劑量組腎組織學評分、血清SCr、BUN含量以及腎組織MDA和TNF-α水平明顯降低，SOD活性升高，并呈劑量依賴關(guān)系。結(jié)論：川芎嗪對急性腎缺血再灌注損傷具有保護作用，提高腎組織SOD活性、降低MDA和TNF-α水平是其減輕損傷的可能機制。

腎臟；再灌注損傷；川芎嗪；超氧化物歧化酶；丙二醛；腫瘤壞死因子

缺血是引起急性腎功能不全的主要原因，在器官移植中腎缺血再灌注損傷（renal ischemia reperfusion injury，RIRI）直接影響著移植腎的存活狀態(tài)。減少RIRI對逆轉(zhuǎn)急性腎衰和提高移植腎長期存活有重要意義。川芎嗪是從傘形科植物川芎的根莖中分離提純的一種生物堿單體，其對心、腦血管缺血的防治作用已被證實［1-2］，但對RIRI的防治效果及其作用機制的研究報道較少。本研究通過建立大鼠RIRI模型，觀察川芎嗪對其腎功能、組織形態(tài)學及腎組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、腫瘤壞死因子（TNF-α）含量及血清肌酐（SCr）和尿素氮（BUN）含量的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量250～280 g，由鄭州大學實驗動物中心提供，標準飼料，自由飲水，普通光照，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備 50只SD大鼠隨機分成假手術(shù)組、對照組、川芎嗪低、中、高劑量組各10只。造模方法：對照組大鼠用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹正中切口，暴露并游離左側(cè)腎蒂，以無創(chuàng)動脈夾夾閉1 h，之后去夾恢復(fù)灌注，腎臟由暗變紅提示灌注成功。同時切除右腎，關(guān)腹放回，安靜飼養(yǎng)。川芎嗪低、中、高劑量組以20 mg/kg、30 mg/kg、40 mg/kg劑量于術(shù)前腹腔注射川芎嗪，每8 h 1次，連續(xù)3次，末次給藥1 h后，同對照組制備動物模型；灌注2 h后再次同劑量腹腔注射川芎嗪，每6 h 1次。假手術(shù)組僅游離左側(cè)腎臟，暴露1 h后，行右腎切除。各組于術(shù)后24 h再次麻醉，活體摘取左腎，一分為二，腹側(cè)一半作組織學分析，背側(cè)一半PBS緩沖液沖洗，即刻制成10%的組織勻漿測定SOD、MDA和TNF-α含量。

1.2.2 血清肌酐和尿素氮含量檢測 各組分別于術(shù)前和術(shù)后24 h取血標本，二乙烯法測血清BUN含量，苦味酸法測血清SCr含量，按試劑盒說明書操作。

1.2.3 腎臟組織學評價 將切取的腎組織甲醛溶液固定，制成石蠟包塊，常規(guī)切片4～6 μm，HE染色。由同一病理醫(yī)師盲法200×光鏡下讀片，每張切片均取10個不重復(fù)視野。根據(jù)文獻［3］進行量化評分：正常腎組織0分；刷狀緣損傷或脫落、輕度水腫變性1分；中度空泡形成2分；核皺縮、重度空泡形成3分；細胞壞死或凋亡，基底膜剝脫4分；腎小管全部壞死5分。

1.2.4 腎組織勻漿中SOD、MDA和TNF-α含量檢測 ELISA法測定TNF-α含量，采用南京建成生物有限公司提供的試劑盒檢測SOD、MDA，按照說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS16.0進行統(tǒng)計分析。將非正態(tài)分布資料進行對數(shù)轉(zhuǎn)換使其服從正態(tài)分布，組間比較采用單因素方差分析，有統(tǒng)計學意義后采用LSD法作組間兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 SCr、BUN變化比較

術(shù)前各組SCr、BUN比較差異無統(tǒng)計學意義。與假手術(shù)組比較，術(shù)后24 h各組SCr（F=152.157，P=0.000）和BUN（F=113.39，P=0.000）顯著升高，川芎嗪低、中、高劑量組SCr、BUN含量均低于對照組，并呈明顯的劑量依賴關(guān)系，川芎嗪用量越大，SCr和BUN水平越低。結(jié)果見表1。

表1 各組Scr、BUN變化比較 （μmol/L）

2.2 腎組織學評分比較

各組腎臟組織學評分：假手術(shù)組（0.24±0.33）分，高劑量組（2.68±0.36）分，中劑量組（2.83±0.45）分，低劑量組（3.42±0.52）分，對照組（3.98±0.62）分。對照組評分顯著高于川芎嗪低、中、高劑量組（P＜0.01）；低劑量組評分高于中、高劑量組（P＜0.05），中、高劑量組腎組織學評分比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 腎組織SOD、MDA和TNF-α水平比較

與假手術(shù)組比較，川芎嗪低、中、高劑量組SOD活性顯著下降，MDA和TNF-α水平明顯增高（P＜0.01）；川芎嗪低、中、高劑量組SOD均高于對照組，MDA和TNF-α均低于對照組（P＜0.01），皆呈劑量相關(guān)關(guān)系。結(jié)果見表2。

表2 術(shù)后24 h腎組織勻漿SOD、MDA、TNF-α水平（±s）

表2 術(shù)后24 h腎組織勻漿SOD、MDA、TNF-α水平（±s）

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.01；與對照組比較，2）P＜0.01；與低劑量組比較，3）P＜0.05

組別 n SOD（U/mg） MDA（μmol/L） TNF-α(ng/L）假手術(shù)組 10 98.36±10.36 83.65±3.94 7.35±0.37對照組 10 40.36±3.651）172.46±5.911）20.39±4.851）低劑量組 10 56.72±4.821）2）145.28±4.271）2）17.84±3.541）2）中劑量組 10 64.17±3.951）2）130.78±3.091）2）3）12.35±2.541）2）3）高劑量組 10 69.88±4.841）2）3）127.46±3.861）2）3）10.81±2.171）2）3）

3 討 論

RIRI是失血、休克、創(chuàng)傷及腎移植過程中常見的病理生理現(xiàn)象，發(fā)生機制迄今仍不完全清楚。在RIRI動物模型的腎組織中有明顯的中性粒細胞和淋巴細胞浸潤、黏著、嵌塞，腎小管上皮細胞壞死脫落和凋亡［4］，不僅使腎臟再灌流恢復(fù)困難，而且還可釋放自由基、細胞因子、溶酶體酶類、黏附分子等多種有害物質(zhì)，從而引起組織細胞損害及內(nèi)環(huán)境的變化［5］。本實驗結(jié)果證實，與假手術(shù)組比較，在腎急性缺血后，4個RIRI模型組SOD活性下降，MDA水平升高，提示氧自由基在RIRI中發(fā)揮了重要的作用，進一步佐證了氧化應(yīng)激介導(dǎo)了RIRI結(jié)論的合理性［6］。SOD是生物體內(nèi)清除O2的主要大分子抗氧化酶，可以歧化O2生成H2O2，保護細胞不受氧自由基的損傷。SOD作為一種內(nèi)源性保護機制，其改變的程度間接反映了機體清除氧自由基的能力。MDA是氧自由基引發(fā)的單位膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物之一，MDA水平可反映組織細胞受自由基攻擊的嚴重程度。因此，SOD和MDA的水平可能決定了缺血后腎組織細胞的命運［7］。本實驗結(jié)果顯示：模型組TNF-α含量高于對照組，支持相關(guān)研究結(jié)果［8］，說明TNF-α也參與了RIRI這一病理生理過程。TNF-α由活化的單核細胞產(chǎn)生，可通過直接的細胞毒性，收縮血管，降低腎臟血流，聚集中性粒細胞和單核細胞導(dǎo)致細胞凋亡、腎小球纖維蛋白沉積、腎小球濾過率下降等加重腎損傷。

SCr、BUN水平是臨床評價腎功能敏感而特異的指標。本實驗觀察到川芎嗪處理組大鼠SCr、BUN水平和腎組織學評分明顯低于對照組，從生理功能和形態(tài)學上證實了川芎嗪對RIRI有一定的保護作用。川芎嗪保護RIRI的機制應(yīng)有多系統(tǒng)、多層面、多環(huán)節(jié)參與，可能與抗脂質(zhì)過氧化、抑制及清除自由基、拮抗Ca2+、下調(diào)Bax蛋白表達、增強Bcl-2蛋白表達［9］、抑制白細胞黏附、調(diào)節(jié)一氧化氮合酶（NOS）mRNA表達、降低一氧化氮（NO）生成［10］、抑制TNF-α mRNA表達［11］、調(diào)節(jié)血紅素氧合酶-1（HO-1）［12］、擴張小血管、改善微循環(huán)［13］等作用有關(guān)。本研究重點觀察了川芎嗪對SOD、MDA和TNF-α含量的影響。結(jié)果顯示川芎嗪干預(yù)組的腎組織SOD活性升高，MDA、TNF-α含量降低。Feng L等［14］研究顯示術(shù)前30 min應(yīng)用80 mg/kg川芎嗪預(yù)處理可以使RIRI大鼠模型24 h后SOD活性提高39.6%，MDA含量下降19.2%，還能抑制TNF-α的過度表達。由此提示，川芎嗪能夠清除氧自由基，抑制過氧化物產(chǎn)生，減少TNF-α水平，這是其腎臟保護作用的可能機制。而且其改善腎功能程度具有明顯的劑量依賴關(guān)系，與對照組相比，當給予20 mg/kg的劑量時，其術(shù)后的組織學評分、血清SCr、BUN含量及腎組織SOD、MDA含量比較差異有統(tǒng)計學意義，已表現(xiàn)出對腎功能的保護效果。當劑量為30～40 mg/kg時，其作用更加明顯，這一結(jié)果為今后進一步探討川芎嗪腎保護最佳有效劑量奠定了理論和實驗基礎(chǔ)。

本研究得出初步結(jié)論：RIRI時，腎功能惡化，腎組織中SOD活性降低，MDA和TNF-α含量升高。川芎嗪能明顯改善腎功能、減輕腎損害，提高腎組織SOD活性、降低MDA和TNF-α水平可能是其主要保護機制，本研究也為臨床上應(yīng)用川芎嗪治療腎臟疾病提供了理論依據(jù)。

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（編輯：梁葆朱）

Effect of ligustrazine on acute renal ischemia reperfusion injury of rats and investigate its mechanisms of protective effect on renal injury

Wang Na1，Xu Haijiang2，Zhao Chunling2
（1.Qixian People's Hospital，Qixian Henan 475200；2.Department of Pharmacy，The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou Henan 450002）

Objective：To observe the effect of ligustrazine on acute renal ischemia reperfusion injury of rats and investigate its mechanisms of protective effect on renal injury.Methods：50 SD rats were randomly divided into sham operation group，control group and ligustrazine group of low，medium and high dosage.Blood samples were taken before operation and 24 h after operation respectively，and contents of serum creatinine（SCr），urea nitrogen（BUN）were detected.All the rats were anaesthetized 24 h after operation again，and left kidney was removed，then the contents of SOD，MDA and TNF-α in tissue homogenate were detected and histological analysis was performed.Results：Compared with control group，contents of SCr，BUN，MDA and TNF-α and renal histology score were decreased and SOD activity was increased in ligustrazine groups of low，medium and high dosage with positive dose-dependent relationship.Conclusion：Ligustrazine has protective effect on acute renal ischemia reperfusion injury of rats through improving SOD activity of renal tissue and decreasing its contents of MDA and TNF-α.

kidney；reperfusion injury；igustrazine；SOD；MDA；TNF-α

R285.5

A

1671-0258（2016）04-0019-03

王娜，E-mail：xuxinxuan65@126.com