啤酒酵母蛋白組學研究進展

郭　璇，欒　波，趙　雪，王　偉，李憲臻，俞志敏（大連工業大學生物工程學院，遼寧大連116034）

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啤酒酵母蛋白組學研究進展

郭璇，欒波，趙雪，王偉，李憲臻，俞志敏
（大連工業大學生物工程學院，遼寧大連116034）

摘要：啤酒酵母是啤酒生產的重要發酵動力。啤酒酵母從未在自然界中分離得到過，而是通過釀酒酵母和其他菌株雜交得到，因此啤酒酵母具有不同于釀酒酵母的獨特性質。隨著基因組時代的到來，對于啤酒酵母的研究已由發酵性能逐步深入到組學研究，蛋白組學是組學研究的重要分支。蛋白組學能夠研究細胞特定狀態下所有蛋白質的特征與功能，目前將蛋白組學應用于啤酒酵母上，主要是以研究啤酒酵母親本的起源與鑒定，不同生長和發酵階段的蛋白變化以及環境脅迫條件下的蛋白表達。隨著啤酒酵母蛋白組學的深入研究將對啤酒酵母的研究和啤酒品質的調控產生重要意義。

關鍵詞：啤酒酵母；蛋白組學分析；研究進展

優先數字出版時間：2015-10-22；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20151022.1508.006.html。

啤酒由于其獨特風味和營養價值而備受人們青睞。啤酒酵母則是啤酒的靈魂，它的生物學特性直接決定了啤酒的風味與品質。因此許多啤酒廠及相關研究人員都對啤酒酵母的研究與調控十分重視。隨著分子生物學技術的不斷發展與進步，對于啤酒酵母的研究不只局限于傳統發酵性能的檢測與控制，而是向蛋白組學、轉錄組學、代謝組學等方面進行探索，力圖從更深層面解讀啤酒酵母的本質[1]。

蛋白組學是后基因組時代主要的研究任務之一，隨著蛋白組學的快速發展，生命科學領域中的許多問題都能通過這個強有力的工具得到解決。蛋白組學技術可以同時測定樣品中的成千上萬種蛋白質，與基因組具有的普遍性和同源性相比，蛋白組學研究在特定的狀態下細胞表達的所有蛋白質的含量、功能特征，并提供系統、全面的細胞動力學過程的信息，同時具有時間性、空間性、動態性和特異性等特征，能夠更好地在細胞整體水平上對生命活動規律和本質進行闡述[2]。

針對于啤酒酵母蛋白組學，許多學者在已有釀酒酵母蛋白組學分析上，將兩者的蛋白質進行比較，發現啤酒酵母獨有的蛋白質及獨特的功能，并研究不同條件下的蛋白質變化，從而為啤酒酵母的深入研究以及啤酒品質的調控起到指導性意義。本文簡述了啤酒酵母和蛋白組學概念及相關技術，并介紹了蛋白組學在啤酒酵母研究上的進展，為今后的有關研究提供參考。

1啤酒酵母簡述

1.1啤酒酵母來源

啤酒酵母（Saccharomyces pastorianus, syn.Saccharomyces carlsbergensis）是啤酒工藝的靈魂，決定了啤酒的質量[3-4]。啤酒酵母在自然界中從未分離得到過，而是通過釀酒酵母（S.cerevisiae）和另一個菌株雜交得到[5-6]。雖然啤酒酵母在親緣性上與釀酒酵母接近，但兩者的物質代謝特別是風味物質代謝上區別較大，而且“非釀酒酵母”（non-cerevisiae）部分的親本是與啤酒風味相關的大部分基因的來源[7]。

1.2啤酒酵母分類

啤酒酵母大致上可分為上面酵母和下面酵母兩類。上面酵母與釀酒酵母（S.cerevisiae）相似，用于生產愛爾啤酒（ale beer）。下面酵母又稱拉格酵母（lager brewer’s yeast），用于發酵拉格啤酒（lager beer），目前市售啤酒大部分采用的都是拉格酵母[8]。

雖然許多愛爾啤酒酵母都是屬于釀酒酵母[9]，但據最近研究顯示，愛爾啤酒酵母（如來自特拉普啤酒）也包括釀酒酵母和Saccharomyces kudriavzevii的雜合子[10]。拉格酵母具有異源多倍體基因，親本分別是S. cerevisiae 和Saccharomyces bayanus[5，11]，而適于麥汁低溫發酵的特性很可能來自于bayanus親本[12]。

1.3酵母基因組建立

1989年，酵母基因組計劃正式啟動，并于1996年完成了第一個真核生物的全基因組測序——釀酒酵母實驗菌株S288c[13]。2009年，第1株啤酒酵母（Weihenstephan 34/70）的全基因組測序完成[6]，從而為啤酒酵母組學的研究提供了極大便利。

2蛋白組學概念及研究內容

2.1蛋白組學概念

1994年，蛋白質組（proteome）的概念首先由Marc Wilkins[1]等人定義為“基因組所表達的全部蛋白質，包括各種亞型及蛋白質修飾”。這個概念的提出標志著蛋白組學的誕生，其本質上是指在整體水平上對蛋白質的特征進行研究，包括蛋白質之間的相互作用及表達修飾等，進而得到蛋白質水平上的整體全面的認識。

2.2蛋白組學研究內容

蛋白組學的研究大致分為3個方面：（1）比較蛋白組學（comparative proteomics）：對人類重大疾病或重要生命過程進行研究，分析其病理/生理過程；（2）表達蛋白組學（compositional proteomics）：根據生物體或細胞/組織的基因組或轉錄組數據庫，建立蛋白表達譜以及蛋白組連鎖群；（3）蛋白質組學和生物信息學相互支撐結合的研究[1]。

3蛋白組學研究技術

3.1雙向電泳質譜(2-DE-MS)技術

蛋白質雙向電泳質譜（2-DE-MS）技術是一種操作方便、靈敏、應用最為廣泛的蛋白質分離方法。雙向電泳分離技術能夠從復雜的樣本中將蛋白質分離出來。雙向電泳包括等電聚焦和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）兩部分。前者根據蛋白質的等電點不同而將其分離，后者則是將不同分子量的蛋白質分開，經過2次電泳后得到的蛋白質圖譜上的點可以視為單一的蛋白質。電泳后需要對凝膠進行染色脫色，使蛋白點顯示出來，染色主要包括考馬斯亮藍染色、銀染、熒光染色等[1]。

應用質譜分析可以對蛋白質的序列進行測定，其原理是將樣品分子離子化后，通過比較其質荷比的差異性，將蛋白質分離出來并確定其相對分子量。目前通過基質輔助激光解吸離子化-飛行時間質譜技術，能夠得到不同酶解肽段的分子量大小，從而獲得該蛋白質的肽質量指紋圖譜（Peptide Mass Fingerprinting，PMF），然后再搜索相應的數據庫來鑒定該蛋白質[1]。

雙向電泳質譜技術的優點是具有很強的蛋白質分離和相對定量能力，并能對蛋白質的翻譯后修飾進行鑒定。缺點則是在電泳過程中一些極端堿/酸性蛋白質丟失情況比較嚴重，堿性蛋白分離效果不佳，不易得到極端分子量蛋白、膜蛋白和低豐度的蛋白、某些疏水蛋白難以檢測，同時難以實現絕對定量和大規模的自動化分析[15]。

3.2多維色譜-質譜聯用(MudPIT)技術

MudPIT技術先用特異性的胰蛋白酶消化蛋白樣品，通過強陽離子交換柱和反相高效液相色譜分離消化產生的多肽，再進行ESI-MS/MS分析。試驗組和對照組樣品的蛋白質可以通過同位素親和標簽來標記，從而獲得蛋白組的相關定量信息。測定樣品制備過程中的肽回收率需要在蛋白質消化混合物中加入經13C標記的多肽。由于MudPIT法采用高靈敏度且高速的色譜分離法，避免了耗時的蛋白質2-DE分離法，因此與經典的雙向電泳質譜法相比，MudPIT法快速靈敏、多肽分離通用性強、樣品需要量較少等，但也存在著不能提供蛋白質翻譯后修飾和異構體的相關信息的不足[16]。

3.3 SELDI-TOF-MS技術

SELDI技術通過液相或離子交換柱分離蛋白質，利用芯片上底物、抗體的親和力的不同從蛋白質混合物中直接獲取單個或多個目標蛋白，然后將蛋白離子化后再進行質譜鑒定。SELDI方法樣品制備簡便，樣品的復雜性低，特別適于迅速檢測表征低豐度蛋白質。然而該方法也存在著不足，目前僅能用于分離鑒定分子量不大于20 kD的蛋白質，而且同經典的2-DE-MS法相比分子量精確度較低[17]。

4蛋白組學在啤酒酵母研究中的應用

據報道，有些細胞是在蛋白質水平調控的生理變化的，而mRNA水平與蛋白表達水平并不總是一致[1，18]，因此，單憑轉錄組學分析往往不能得到全部重要的信息，而這些信息恰恰能通過蛋白組學十分明顯快速地表現出來，因而在啤酒酵母研究中，轉錄組學和蛋白組學相結合已成為組學研究的趨勢。相對于釀酒酵母，啤酒酵母蛋白組學的研究起步較晚，目前主要集中在啤酒酵母親本的起源研究與鑒定，不同生長發酵階段的蛋白組學分析，不同環境條件下的蛋白表達分析等。

4.1啤酒酵母親本的起源研究與鑒定

啤酒酵母并非在自然界中分離得到，而是通過不同酵母雜交得到，不同的親本賦予了啤酒酵母不同的特性，因此研究人員對啤酒酵母的起源和鑒定進行了研究。

Caesar等[11]通過對3株工業啤酒酵母CMBS33、OG2252和A15的蛋白組學分析，發現這3株啤酒酵母蛋白彼此相似，卻與釀酒酵母BY4742差別很大。通過數據庫分析發現3株工業啤酒酵母與非釀酒酵母S.bayanus蛋白組成最為接近。

Joubert等[20]對來自啤酒廠的不同啤酒酵母進行蛋白組學分析，發現拉格酵母不同于S.carlsbergensis、S.monacensis、S.pastorianus。拉格酵母一個親本為近似釀酒酵母，另一親本可視為啤酒酵母，最接近的是啤酒酵母NRRL Y-1551。同時該團隊建立了拉格酵母的蛋白圖譜，用于不同酵母的蛋白分析。

Kobi[9]團隊建立了第一個愛爾啤酒酵母蛋白圖譜，205個蛋白質點中有133個差異點得到鑒定。與拉格啤酒酵母、釀酒酵母S288c相比，愛爾啤酒酵母在蛋白組學上更接近于釀酒酵母，但兩者同時存在Adh4p等基因表達的差異。

Joubert等[21]利用MALDI-TOF、MS/MS和數據庫分析了30種拉格酵母，比較它們的蛋白組學與釀酒酵母的差異，發現在雙向電泳圖譜上，工業啤酒酵母已鑒定的蛋白質點與已知的釀酒酵母的蛋白質點并不完全一致，進而提出了采用MS技術鑒定工業啤酒酵母同源性蛋白的方法。

4.2不同生長發酵階段的蛋白組學分析

隨著啤酒酵母在啤酒發酵過程中的生長代謝，其細胞的蛋白組成也在不斷發生變化。

在拉格啤酒酵母延滯期和對數前期蛋白和基因表達的研究中，J. Brejning等[22]利用轉錄組學和蛋白組學工具檢測早期發酵水平，同Higgins等[22]的觀點一樣，轉錄組學和蛋白質組學是良好的檢測工具。發酵早期誘導的蛋白Ade17p、Eno2p、Ilv5gp、Sam1p、Rps21p和Ssa2p已被成功鑒定。ADO1、ALD6、ASC1、ERG4、GPP1、RPL25、SSB1基因以及YKL056C蛋白不但在釀酒酵母基本培養基的對數前期表達，也同樣在拉格啤酒酵母釀造過程的對數前期表達。

Berner等[23]通過比較愛爾啤酒酵母降解可發酵性糖能力的不同，進而研究從麥汁發酵到生成嫩啤酒（即發酵后尚未成熟的啤酒）過程的蛋白變化。研究人員對嫩啤酒和麥汁進行雙向電泳蛋白組學分析，并通過SELDITOF-MS和MS/MS技術將嫩啤酒和麥汁中的特定蛋白分離出來，例如轉脂蛋白（LTP1和LTP2）、蛋白酶Z和淀粉酶蛋白酶抑制劑。發酵過程中，兩個相對應于LTP2的蛋白質點缺失，同時有3個蛋白質點僅在啤酒中發現。這3個新增加的蛋白全部來自于酵母，而且均與細胞壁蛋白有關，分別是Exg1（一種β-1，3-葡聚糖外切酶），Bgl2（一種β-1，2-葡聚糖內切酶）和Uth1（一種細胞壁生物起源蛋白質）。

許維娜等[24-25]發現在啤酒酵母青2自溶過程中，大量蛋白都被降解，蛋白數目快速減少（由629個蛋白質點減少到296個）早在蛋白提取時這一現象就被發現，要獲得與正常細胞相同數量的蛋白質，需要大約1.5倍體積的自溶細胞。雖然蛋白的種類在自溶前后差異很大，但兩者的蛋白有很高的匹配度（原有的296個蛋白點自溶后能夠匹配270個）。一些蛋白質如Pep4、Adh1、Suc2、Eno2、Tpi1等，同時出現在多個蛋白點中，而這些點的等電點和（或）分子量有差異。其原因可能是在酵母自溶過程中蛋白質發生了翻譯后修飾，例如磷酸化、糖基化、乙酰化等。例如，自溶后的蛋白圖譜中初始有26個點被認為是新出現的，后經過質譜鑒定，其中18個點在自溶開始時就已存在，只是等電點和分子量在自溶過程中發生了變化。

4.3不同環境條件對啤酒酵母蛋白分泌的影響

在不同的環境條件下，如某些脅迫條件也會使啤酒酵母蛋白發生改變，從而適應外界環境對細胞造成的損害，這些蛋白的改變也正是酵母細胞的自我保護方式。

Kobi等[9]研究了生產規模上的愛爾啤酒酵母蛋白動力學，分別測定了第一代、三代酵母發酵初期和末期的蛋白變化。第一代中的蛋白變化與好氧生長到厭氧發酵的過渡有關，在第三代中，雖然這些蛋白很少變化，但與應激反應相關的蛋白如Hsp26p、Ssa4p和Pnc1p卻在后面的傳代中基本上表達出來。

Caesar等[11]發現在各種脅迫條件下，如對不同溫度和高鹽條件的適應上，釀酒酵母蛋白與近似S.bayanus的非釀酒酵母蛋白的調控存在差異，例如Arg1p、Sti1p和dc1p。實驗比較了15℃和30℃培養條件下酵母的指數生長情況，啤酒酵母比釀酒酵母更適于在低溫下生長。低溫生長過程中，2種酵母的蛋白差異很小，2個溫度條件下蛋白表達變化最大的是脅迫應答協同伴侶分子Sti1p，15℃下其表達量遠大于30℃的表達量。Ipp1p和Arg1p 2種蛋白的表達調控均與環境有關，在15℃時Arg1p表達量高于30℃，釀酒酵母變種表達量增加5倍，而近似S.bayanus的非釀酒酵母只增加了2倍。

還有人研究了啤酒酵母對啤酒的影響。如張波[26]等通過雙向電泳分析啤酒蛋白質組，發現除了麥芽溶解度和大麥品種會對啤酒中幾種蛋白質的濃度造成影響外，一些來自酵母的蛋白質也可能影響啤酒的品質。酵母中的四類蛋白質——y-TRx2p、TPl、烯醇化酶和酵母磷酸轉移蛋白Ypd1均在啤酒中被發現。這表明酵母細胞在發酵過程中就已遭到破壞，導致酵母中的這些蛋白質釋放到啤酒中。但是TPl、y-TRx2p，烯醇化酶蛋白質點之間并沒有明顯的相關性。

5　展望

蛋白質組學能夠在蛋白質水平上直接、大規模研究基因功能，是繼生化手段研究蛋白質功能后的重大進展。但蛋白質組學技術仍有許多不足之處，例如對分離鑒定難溶性和極端等電點的蛋白質仍很困難，某些重要蛋白質的信息可能會在檢測過程中丟失。因此不但要綜合應用現有的技術取長補短，還要繼續發展蛋白質組學相關研究技術，增加其敏感性、穩定性、特異性和可重復性[2]。

啤酒由于獨特風味和營養價值而備受人們青睞，其重要部分——啤酒酵母的研究也逐漸深入，從開始的發酵性能的研究，到如今的組學的探索，無不完善著人們對于啤酒酵母的認識與了解，從而更好的為啤酒生產服務。隨著蛋白質組學技術的不斷發展，相關數據庫的不斷充實，蛋白質組學會有更廣闊的發展前景，對啤酒酵母的研究也會做出更具突破性的貢獻。

參考文獻：

[1]龍娟,楊曉紅,于桂寶.微生物蛋白組學的發展及前景[J].生物技術通報, 2006(增刊)：91-99.

[2]李學鵬,勵建榮,于平,等.蛋白組學及其在食品科學研究中的應用[J].中國糧油學報, 2010, 25(2)：77-83.

[3] Powell C D, Quain D E, Smart KA. The impact of brewing yeast cell age on fermentation performance, attenuation and flocculation[J]. FEMS Yeast Res, 2003(2)：147-159.

[4] Liu Z, Zhang G, Liu S. Constructing an amylolytic brewing yeast Saccharomyces pastorianus suitable for accelerated brewing[J]. J Biosc Bioeng, 2004, 98(6)：414-419.

[5] Dunn B, Sherlock G.Reconstruction of the genome origins and evolution of the hybrid lager yeast Saccharomyces pastorianus [J]. Genome Res, 2008(18)：1610-1623.

[6] Nakao Y, Kanamori T, Itoh T, et al. Genome sequence of the lager brewing yeast, an interspecies hybrid[J]. DNARes, 2009 (16)：115-129.

[7] Horinouchi T, Yoshikawa K, Kawaide R, et al. Genome-wide expression analysis of Saccharomyces pastorianus orthologous genes using oligonucleotide microarrays[J]. J Biosci Bioeng, 2010, 110(5)：602-607.

[8] Saerens S M G, Duong C T, Nevoigt E. Genetic improvement of brewer's yeast: current state, perspectives and limits[J]. Appl Microbiol Biot, 2010, 86(5)：1195-1212.

[9] Dominique K, Sandra Z, Serge P, et al. Two-dimensional protein map of an“ale”-brewing yeast strain: proteome dynamics during fermentation[J]. FEMS Yeast Research, 2004, 5(3)：213-300.

[10] Gonzalez S, Barrio E, Querol A. Molecular characterization of new natural hybrids of Saccharomyces cerevisiae and S. kudriavzevii in brewing[J].Appl Environ Microb, 2008, 74：2314-2320.

[11] Robert C, Johan P, John S G, et al. Comparative proteomics of industrial lager yeast reveals differential expression of The cerevisiae and non-cerevisiae parts of their genomes[J]. Proteomics, 2007, 7(22)：4135-4147.

[12] Sato M, Kishimoto M, Watari J, et al. Breeding of brewer’s yeast by hybridization between a top-fermenting yeast Saccharomyces cerevisiae and a cryophilic yeast Saccharomyces bayanus[J].J Biosci Bioeng,2002(5)：509-511.

[13] GoffeauA, Barrell B G, Bussey H, et al. Life with 6000 genes [J]. Science, 1996, 274(5287): 546-547.

[14] Wasinger V C, Cordwell S J, Cerpa-Poljak A, et al. Progress with gene-product mapping of the mollicutes: Mycoplasma genitalium[J]. Electrophoresis, 1995, 16：1090-1094.

[15]何慶華,吳永寧,印遇龍.蛋白組學技術及其在營養學研究中的應用[J].食品科學, 2008, 29(4)：439-442.

[16] Michael PW. Utilization of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (Mud PIT) [J]. Briefings in Functional Genomics and Proteomics, 2004, 3：280-286.

[17] Issaq H J, Veenstra T D, Conrads T P, et al. The SELDITOFMS approach to proteomics: Protein profiling and biomarker identification[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2002, 292(3)：587-592.

[18] Lackner D H, Schmidt M W, Wu S, et al. Regulation of transcriptome, translation, and proteome in response to environmental stress in fission yeast[J]. Genome Biol, 2012, 13(4)：R25.

[19] Karhumaa K, Pahlman AK, Hahn-Hagerdal B, et al. Proteome analysis of the xylose-fermenting mutant yeast strain TMB 3400[J]. Yeast, 2009, (26)：371-382.

[20] Joubert R, Brignon P, Lehmann C, et al. Two-dimensional gel analysis of the proteome of lager brewing yeasts[J]. Yeast, 2000, 16(6)：511-522.

[21] Joubert R, Strub J M, Zugmeyer S, et al. Identification by mass spectrometry of two-dimensional gel electrophoresisseparated proteins extracted from lager brewing yeast[J]. Electrophoresis, 2001, 22(14)：2969-2982.

[22] Brejning J,Arneborg N, Jespersen L. Identification of genes and proteins induced during the lag and early exponential phase of lager brewing yeasts[J]. Journal of Applied Microbiology, 2005, 98(2)：261-271.

[23] Berner T S, Jacobsen S,Arneborg N. The impact of different ale brewer’s yeast strains on the proteome of immature beer [J]. BMC Microbiology, 2013, 13(1)：215.

[24]許維娜.啤酒酵母自溶評價及機理研究[D].無錫：江南大學, 2014.

[25] Xu W N, Wang J J, Li Q. Comparative proteome and transcriptome analysis of lager brewer's yeast in the autolysis process[J]. FEMS Yeast Research, 2014, 14(8)：1273-1285.

[26]張波,管政兵,陸健,等.新的啤酒蛋白質組圖譜的構建及在啤酒質量控制方面的應用[J].啤酒科技, 2011(2)：58-67.

Research Progress in Proteomics of Beer Yeast

GUO Xuan, LUAN Bo, ZHAO Xue, WANG Wei, LI Xianzhen and YU Zhimin
(School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian, Liaoning 116034, China)

Abstract:Beer yeast plays an important role in beer production. However, beer yeast has never been isolated from the nature, it is obtained by a hybrid of S.cerevisiae and other strains. Therefore, beer yeast has unique properties different from S.cerevisiae. With the advent of genome era, the research on beer yeast has gradually come into omics research from yeast fermenting performance research, and proteomics is an important part of omics research. Proteomics is to study all the features and functions of cellular proteins under a given state. At present, proteomics is mainly applied in the research on the origin and identification of beer yeast parent, protein changes in different stages of growth and fermentation, and protein expression under environmental stress conditions and so on. Further research on the protemics of beer yeast is of great significance in beer yeast research and beer quality control.

Key words:beer yeast；proteomics analysis；research progress

作者簡介：郭璇(1990-)，女，在讀碩士。

收稿日期：2015-08-05

基金項目：大連市科學技術基金，編號：2013J21DW007；國家自然科學基金，編號：31401681。

DOI：10.13746/j.njkj.2015333

中圖分類號：TS261.1；TS261.4；TS62.5

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）01-0103-04