冰結構蛋白抗凍活性檢測研究進展

陳鳳蓮，鮑　歡，曲　敏，李凌俐（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江省高等學校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱　150076）

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冰結構蛋白抗凍活性檢測研究進展

陳鳳蓮，鮑歡，*曲敏，李凌俐
（哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江省高等學校食品科學與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱150076）

摘要：通過介紹近年來海洋魚類、昆蟲類、植物類及細菌和真菌類冰結構蛋白的抗凍活性檢測研究進展，對利用冰晶和熱滯活性2種檢測方法進行了較全面的闡述，并提出建立對冰結構蛋白抗凍活性的冰晶觀察和差示掃描量熱法測熱滯活性的聯合檢測觀點。

關鍵詞：冰結構蛋白；冰晶；熱滯活性

0　引言

冰結構蛋白（Ice structuring protein，ISP），又稱為抗凍蛋白、不凍蛋白（Antifreeze protein，AFP）、熱滯蛋白，具有控制冰晶生長、修飾冰晶形態和抑制重結晶三大特征[1]。ISPs能修飾冰晶的形態，即通過與水分子的特異性結合，改變冰晶的形態；ISPs能非依數性降低水溶液的冰點，而不影響其熔點，從而產生水溶液冰點溫度和熔點溫度的差異，二者之間的差值被稱為熱滯活性（Thermal hysteresis activity，THA）[2-4]。利用THA系數可以表示其抗凍活性。熔點越高（低）冰點越低（高），即二者差異越明顯，表示ISPs的活性越強，所以通過THA可以評價一種ISPs的抗凍活性。目前，根據其特征，常用ISPs抗凍活性的檢測方法可以歸納為3種[5]：一是冰晶觀察檢測法，該方法使用顯微鏡對冰晶形態進行觀察，操作簡單，冰晶形態直觀性強，但由于是肉眼進行觀察，誤差較大；二是微量滲透壓計法，該方法是根據體系結晶前后的滲透壓變化，通過經驗公式來計算THA，測定結果的精確度和重復性都較高，缺點在于無法精確控制和測定體系的冰晶含量，不利于進一步揭示結晶過程中體系發生的變化；三是差示掃描量熱法（Differential scanning calorimetry，DSC），該方法由于能夠對冰晶含量準確控制，得到結果的精確度和重復性比較高，使其成為目前對ISPs的THA檢測最常用方法。目前，在評價ISPs的抗凍活性時,多數研究通過采用DSC檢測其THA值來確定，沒有全面反應出ISPs的特征。本文綜述了海洋魚類、昆蟲類、植物類、細菌與真菌類的ISPs抗凍活性檢測方法，旨在提出全面檢測與評價ISPs抗凍活性的方法。

1　海洋魚類ISPs的抗凍活性檢測

1969年斯坦福大學Devries在南極Mcmurdo海峽的一種Nototheneniid魚血液中首先發現了具有這種性質的ISPs。接著，Jong Kyu Lee等人[6]提取了南極魚類中的蛋白，將其純化后與大腸桿菌提取液和磷酸鹽緩沖液進行冰晶形態的對比觀察，發現了該蛋白提取液中有六角冰晶形態，而大腸桿菌和磷酸鹽緩沖溶液中只有圓形或不規則形狀的冰晶。蛋白提取液在低質量濃度下，有雙棱錐形狀的冰晶；而在較高質量濃度下，有針狀冰晶。當質量濃度為0.5 mg/mL時，THA值為0.7℃。Type III型ISPs由幾種生活在冰島上的海洋魚類中檢出，Christopher P等人[7]發現野生Type III型蛋白中具有六角形和雙棱錐形狀的冰晶，并且能夠顯著地阻止冰晶的生長。賈弘禔、鞏子路等人[8-10]利用單因素試驗及響應面分析法分別對白斑狗魚魚肉和魚皮進行分離純化，并研究了料液比、pH值、不同提取時間和溫度下，白斑狗魚魚肉和魚皮THA的變化，通過DSC法測得白斑狗魚魚肉的最佳THA達到0.061 2℃，白斑狗魚魚皮的最佳THA達到0.072 0℃。

2　昆蟲ISPs的抗凍活性檢測

昆蟲作為變溫動物，其生長發育要經受冬季低溫的制約。昆蟲在長期的進化過程中，已經形成了一系列的適應對策和抗寒機制。例如，有的昆蟲能夠忍受體內結冰，有的通過降低過冷卻點和體內含水量的方法越冬。其中，ISPs的產生是最為重要的低溫適應策略之一。許多研究已經表明，不僅在昆蟲的體液中，而且在昆蟲的腸液和細胞內液中都有ISPs的產生。劉俊杰等人[11]研究甲蟲抗凍蛋白是一種具有規則結構的昆蟲ISPs，在相同濃度條件下，利用DSC法對其ISPs進行檢測，發現其具有比魚類ISPs更高的抗凍活性。產生ISPs是寒帶昆蟲抵御低溫的重要機制之一，但檢測其活性仍存在一些困難，尤其對個體較小的昆蟲樣品。為了探索DSC法是否適于檢測昆蟲總蛋白的THA，崔寧寧等人[12]利用DSC法對黃粉蟲（Tenebrio molitor）幼蟲的總蛋白和血淋巴分別進行了THA檢測。結果表明，黃粉蟲總蛋白的THA（0.49～0.98℃）要低于血淋巴（2.54～4.34℃）。通過這種方法，進一步檢測了3種在內蒙古大興安嶺林區采集到的越冬昆蟲：稠李巢蛾（Yponomeuta exonymallus）幼蟲、舞毒蛾（Lymantria dispar）卵和落葉松八齒小蠹（Isp subelongatus）成蟲。結果發現，它們體內都存在THA，其中稠李巢蛾的THA為（0.34～0.43℃），舞毒蛾的THA為（0.35～0.42℃），落葉松八齒小蠹的THA為（0.37～0.40℃），說明這3種昆蟲能以產生ISPs的方式作為越冬策略之一。研究表明，通過DSC法檢測昆蟲總蛋白是否存在THA來判斷ISPs的存在是可行的。Graether S P等人[13]研究發現，20 μmol/L的云杉卷葉蛾ISPs能降低冰點1.08℃，而美洲擬鰈（Pleuronectesamericanus）I型ISPs在濃度到達400 μmol/L時，僅使冰點降低0.27℃。Andrew J S等人[14]研究發現，黃粉蟲冰結構蛋白（TmISP）濃度為20 mol/L時能使冰點降低1.4℃，而Ш型魚類（Oceanpout）ISPs的濃度為218 mol/L時才降低相同的冰點。這些差異既存在于分離的天然ISPs中，也存在于純化單一成分的重組ISPs或合成ISPs中，因此排除了在體外昆蟲ISPs活性的提高是由于其他成分加入的解釋[15]。用TmISP與含不同濃度該蛋白的昆蟲體液進行Western Blot試驗，結果表明THA與ISPs濃度之間的關系呈雙曲線型，并且在雙曲線斜率變化最大部分的濃度與昆蟲體內ISPs的生理濃度非常吻合，這提示昆蟲體內ISPs濃度較小的改變就會對其THA造成較大的影響[16]。

3　植物ISPs的抗凍活性檢測

到目前為止，被研究的植物材料多達40余種，現已陸續在冬小麥、燕麥、冬黑麥、黑麥草、歐白英、胡蘿卜、沙冬青、桃樹、唐古特紅景天、甜楊等至少26種高等植物中獲得具有抗凍活性的ISPs[17]。曲敏等人[1]利用磷酸鹽緩沖溶液法提取苜蓿蛋白，經硫酸銨沉淀后，對其透析脫鹽、冷凍干燥復溶后進行冰晶形態的觀察，可以看到冰晶體積小、數量多、形態多樣，說明苜蓿蛋白抑制冰晶生長及對冰晶形態修飾效果顯著，具有較好的抗凍活性，為苜蓿ISPs。Chantelle J等人[18]發現，大多數ISPs表現出2種類型的“防凍劑活動”——熱滯現象（THA）和抑制冰重結晶活動。檢測多年生黑麥草突變體ISPs抑制冰重結晶的活動和熱滯現象的關系，發現抑制冰重結晶的活動和熱滯現象相關，并在突變體中觀察到了形狀各異的冰晶形態，能夠減少冷凍對細胞的破壞。龔束芳等人[19]以野生偃麥草為原料，選取各個季節的偃麥草根莖提取蛋白，在顯微鏡下進行觀察，觀察到冰晶修飾為六角形能力，說明其具有較好的抗凍活性。張超等人[20]以胡蘿卜AFP為研究對象，使用DSC法測定THA，對影響樣品THA的因素進行全面考察，以建立一個有效測定THA的標準方法。其中，主要研究樣品濃度、升降溫速率，冰晶含量等因素對樣品THA的影響，并考察了該方法的穩定性、重復性和精確度。結果表示，DSC法可以有效地用于樣品THA測定。田童童等人[21]在此基礎上，使用DSC法測定胡蘿卜ISPs的THA。分別對樣品質量濃度、升降溫速率、冰晶含量等有可能影響其THA的主要因素進行研究，試驗結果表明，隨著原料質量濃度的升高，THA也逐漸的升高；當質量濃度大于0.5 mg/mL，THA趨向于穩定。緩慢的升溫和降溫過程導致儀器檢測的靈敏度降低，從而導致未能檢出THA，由此確定了測定ISPs的THA升降溫速率為1℃/min。當樣品中冰晶含量的質量分數小于1%時，THA會以冪指函數的形式上升，進一步增加樣品中的冰晶含量，THA將會穩定在某一個數值。因此，原料質量濃度、升降溫速率、冰晶含量等條件的改變對THA的檢測有影響，但目前通過改變條件進行THA檢測的研究較少，只是單一的測定其THA值。劉尚等人[22]根據ISPs與冰結合的特性，利用碎冰從女貞（Ligustrum lucidum）葉提取液中分離出抗凍蛋白，利用DSC法對其進行THA測定。結果表明，在0.5 mg/mL的濃度下，冰晶含量為7%時，THA值為0.678℃，說明冰提法提取的女貞葉ISPs抗凍活性較高，接近于魚類抗凍蛋白。尉姍姍等人[23]利用纖維素DE-52離子柱層析提取分離出了冬季新疆沙冬青（Ammopiptanthus nanus）葉片中的ISPs，用DSC法測定結果表明，當蛋白質量濃度為20 mg/mL時，ISPs的THA為0.46℃。金濤等人[24]利用真空滲透離心法，提取燕麥ISPs工藝的研究，經優化提取工藝所得到的燕麥質外體蛋白質經DSC檢測，THA為2.07℃，證明所得蛋白具有明顯的熱滯活性。

4　細菌與真菌ISPs的抗凍活性檢測

目前，細菌、真菌中分離提純的ISPs種類非常少，僅在南極和北極的少量菌株中發現ISPs。James A.Raymond等人發現香菇、金針菇，以及一些深海冰川中的細菌和硅藻中含有ISPs，并且觀察到了形狀各異的冰晶形態。也有報道稱，冬菇（Flammulina velupites）和牡蠣菇（Pleurotus ostreatus）中存在ISPs[25]。

綜上，冰晶和THA是反映冰結構蛋白抗凍活性的2個重要指標，分別從修飾冰晶形態和降低冰點提高熱滯差值2個不同層面反應了冰結構蛋白的抗凍活性。一種冰結構蛋白的冰晶形態特點和THA相互關聯。對冰結構蛋白的冰晶觀察操作簡單、冰晶形態直觀性強、判斷迅速；而對利用DSC檢測則準確反映其冰點溫度和熔點溫度的差異（THA），冰晶含量分析準確。因此，在研究冰結構蛋白的抗凍活性時應從這2個方面進行檢測鑒定，建立其抗凍活性的聯合檢測機制。

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Advances in Detection of Thermal Hysteresis Activity of Ice Structuring Proteins

CHEN Fenglian，BAO Huan，*QV Min，LI Lingli
（College of Food Engineering，Harbin University of Commerce，College and Vniversties in Heilongjiang Province Key Laboratory of Food Science and Eugineering，Harbin，Heilongjiang 150076，China）

Abstract：In recent years，antifreeze activity detection researched on marine fish，insects，plants，bacteria and fungi.Two kinds of detection method that are ice crystals and thermal hysteresis activity carried on the comprehensive review.Finally，the prospects is put forward to establish joint detection of antifreeze activity of ice structural protein by ice crystal observation and thermal hysteresis activity by differential scanning calorimetry.

Key words：ice structuring proteins；ice crystals；thermal hysteresis activity

中圖分類號：TS255.3

文獻標志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.02.045

文章編號：1671-9646（2016）02b-0056-03

收稿日期：2015-12-21

基金項目：黑龍江省自然科學基金項目（C2011-24）；黑龍江省教育廳科學技術研究項目（12511128）；黑龍江省博士后科研啟動基金項目（LBH-Q13098）；2014年哈爾濱商業大學研究生創新科研項目（YJSCX2014-334HSD）。

作者簡介：陳鳳蓮（1975—），女，博士，副教授，研究方向為糧食谷物及其副產品精深加工。

*通訊作者：曲敏（1966—），女，博士，教授，研究方向為食品蛋白與添加劑。