卵巢上皮癌組織中CRM1、P-p27ser10表達及其對癌細胞增殖的影響

高菲菲，薛愷，王酉（上海市第八人民醫院，上海005；復旦大學附屬腫瘤醫院；上海交通大學附屬仁濟醫院）

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卵巢上皮癌組織中CRM1、P-p27ser10表達及其對癌細胞增殖的影響

高菲菲1，薛愷2，王酉3
（1上海市第八人民醫院，上海200235；2復旦大學附屬腫瘤醫院；3上海交通大學附屬仁濟醫院）

摘要：目的 觀察卵巢上皮癌（EOC）組織中出核因子1（CRM1）和10號位絲氨酸（S10）磷酸化p27（P-p27ser10）的表達，并探討二者對EOC細胞株SKOV3增殖的影響。方法 取64例手術切除的EOC組織，采用免疫組化法檢測P-p27ser10、CRM1蛋白表達，分析二者與臨床病理特征的關系。以p27野生型［p27（WT）］為模板，構建S10突變的p27去磷酸化突變細胞［p27（S10A）組］和擬磷酸化突變細胞［p27（S10D）組］，分別轉染S10磷酸化通路相關分子CRM1 siRNA和siRNA陰性質粒到p27（S10D）細胞，建立S10D＋siCRM1組和S10D＋sictrl組，CCK-8法檢測p27 （WT）、p27（S10A）、陰性對照、S10D＋siCRM1和S10D＋sictrl組細胞的增殖情況，流式細胞儀分析各組細胞周期。結果 P-p27ser10和CRM1在卵巢癌組織中的高表達率分別為76．6%、64．1%，其表達升高與卵巢癌的組織學分級、病理分期有關（P均＜0．05），二者表達呈正相關（r＝0．656，P＜0．01）。S10D＋sictrl組較S10A組G1／S期細胞比例明顯減少，S10D＋siCRM1組較S10D＋sictrl組G1／S期細胞比例明顯增多（P均＜0．05）。S10D＋sictrl組細胞增殖較S10A組加快，S10D＋siCRM1組較S10D＋sictrl組減慢（P均＜0．05）。結論 EOC組織中CRM1和P-p27ser10表達升高；CRM1參與了p27 S10磷酸化的出核降解過程，抑制p27 S10磷酸化及CRM1表達均可引起細胞周期阻滯，降低EOC細胞的增殖能力。

關鍵詞：卵巢腫瘤；p27蛋白；10號位絲氨酸；磷酸化；出核因子1；細胞增殖

腫瘤細胞的過度增生與腫瘤細胞增殖周期調控因子紊亂有關。p27蛋白是一種細胞周期激酶（CDK）抑制劑，可負性調控細胞周期，使細胞周期停滯在G1期［1］。p27主要在細胞核內發揮抑癌基因作用，其亞細胞定位在很大程度上影響生物學功能［2］。出核因子1（CRM1）是p27重要的出核蛋白，可以介導10號位絲氨酸（S10）磷酸化后的p27出核轉運，該通路可能與腫瘤的異常增殖及周期調控紊亂密切相關［3～5］。2011～2014年，我們觀察了S10磷酸化p27（P-p27ser10）、CRM1在卵巢上皮癌（EOC）中的表達及與EOC細胞增殖的關系。現報告如下。

1　材料與方法

1．1材料 收集2004～2009年在南京醫科大學附屬無錫婦幼保健院手術切除的EOC標本64例，患者年齡30～74歲。排除其他惡性腫瘤，術前均未行放化療。均經組織病理學檢查確診，根據2000年FIGO公布的手術病理分期標準［5］，Ⅰ～Ⅱ期28例，Ⅲ～Ⅳ期36例。EOC細胞株SKOV3購自中國科學院細胞庫，用RPMI1640完全培養基于5%CO2、飽和濕度、37℃常規培養傳代，收集對數生長期細胞用于實驗。

1．2EOC組織中CRM1、P-p27ser10蛋白表達檢測取手術切除的EOC組織，4%甲醛固定，石蠟包埋、切片，常規脫蠟、水化，微波抗原修復，使用免疫組化試劑盒檢測CRM1、P-p27ser10蛋白表達。顯微鏡下觀察染色情況，每5個視野計數200個細胞，計算陽性細胞所占百分比。CRM1陽性細胞≤10%為低表達，＞10%為高表達［7］；P-p27ser10陽性細胞≤5%為低表達，＞5%為高表達［8］。

1．3抑制p27 S10磷酸化與CRM1表達對SKOV3細胞周期和增殖的影響觀察1．3．1 質粒構建與siRNA轉染 擴增人類p27 cDNA全長序列，將其重組于pcDNA3．1及pEGFPN1載體，構建野生型p27-EGFP融合蛋白表達質粒。以野生型p27基因真核表達質粒pEGFP／N1-p27（WT）為模板，采用重疊延伸特異位點誘變法構建EGFP標記的突變型p27基因表達載體，一為pEGFP／N1-p27（S10A）（絲氨酸突變為丙氨酸，不能發生磷酸化），二為pEGFP／N1-p27（S10D）（絲氨酸突變為天冬氨酸，為擬磷酸化突變體）。用Lipofectamine 2000分別轉染p27（WT）、p27（S10A）、p27 （S10D）質粒進入SKOV3。48 h后，在含G418 500 μg／mL的培養基中進行陽性細胞篩選，獲得穩定表達p27（WT）、p27（S10A）、p27（S10D）細胞。擴增引物：p27（S10A）上游引物S10A＿F為5′-TAGGTGCCCCGTTAGACACTCG-3′，擴增長度為35 bp；下游引物S10A＿R為5′-CGAGTGTCTAACGGGGCACCTA-3′，擴增長度為579 bp；p27（S10D）：上游引物S10D＿F為5′-TAGGGTCCCCGTTAGACACTCG-3′，擴增長度為35 bp；下游引物S10D＿R為5′-CGAGTGTCTAACGGGGACCCTA-3′，擴增長度為579 bp。CRM1 siRNA序列：正義GGCUGCUGAACUCUAUAGA、反義UCUAUAGAGUUCAGCAGCC。分別轉染CRM1 siRNA和siRNA對照質粒到p27（S10D）細胞，建立S10D＋siCRM1組和S10D＋sictrl組，用空載體作為陰性對照。24 h后收集各組細胞進行后續實驗。

1．3．2細胞周期檢測 取細胞用70%乙醇－20℃固定24 h，冷PBS洗滌；50 μg／mL碘化丙啶（PI）和250 μg／mL核糖核酸酶孵育30 min，過濾，流式細胞儀檢測細胞周期分布。

1．3．3細胞增殖檢測 采用CCK-8法。取各組細胞，按2×104／mL接種于96孔板；待細胞完全貼壁后，更換為預先配置好的含10%CCK-8試劑的基礎培養基，37℃孵育1～2 h；用酶標儀在450 nm波長處檢測吸光度OD值，OD值越大，表示細胞增殖能力越強。

1．4統計學方法 采用SPSS15．0統計軟件。計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數資料采用χ2檢驗及Fisher精確概率法；相關性分析采用Pearson相關性檢驗。P＜0．05為差異有統計學意義。

2　結果

2．1CRM1、P-p27ser10蛋白表達及其與EOC臨床病理特征的關系 CRM1和P-p27ser10蛋白主要表達于細胞核內，在胞質中有少量表達。CRM1蛋白高表達49例（76．6%），低表達15例（23．4%）；P-p27ser10蛋白高表達41例（64．1%），低表達23例（35．9%）。CRM1及P-p27ser10蛋白表達與臨床病理特征的關系見表1。CRM1高表達與腫瘤FIGO分期、組織學分級及淋巴結轉移情況有關，P-p27ser10高表達與腫瘤FIGO分期及組織學分級有關（P均＜0．05）。

表1　CRM1和P-p27ser10蛋白表達與臨床病理特征的關系（例）

2．2CRM1與P-p27ser10表達的相關性 Pearson相關性分析表明，CRM1與P-p27ser10的表達呈正相關（r＝0．656，P＜0．01）。

2．3抑制p27 S10磷酸化與CRM1表達SKOV3細胞周期和增殖的影響

2．3．1各組G1期和S期細胞所占比例比較 見表2。

表2　各組G1期和S期細胞所占比例比較（%）

2．3．2各組細胞增殖情況比較 p27（WT）、p27 （S10A）、陰性對照、S10D＋siCRM1、S10D＋sictrl組培養72 h的OD值分別為0．75±0．15、0．70± 0．10、1．23±0．16、1．32±0．08、1．80±0．21，S10D＋sictrl組較其他四組增殖明顯加快（P均＜0．05），S10D＋siCRM1組較S10D＋sictrl組增殖明顯減慢（P＜0．05），p27（WT）和p27（S10A）組較陰性對照組增殖加快（P均＜0．05）；陰性對照與S10D＋si-CRM1組相比差異無統計學意義。

3　討論

研究表明，大部分腫瘤的發生是由于癌基因和抑癌基因調控的細胞增殖、分化以及細胞周期調控信號的通路改變所造成的。細胞周期抑制因子p27具有調節細胞周期、細胞增殖、凋亡及分化等多種生物學功能，p27相關調控機制異常與許多細胞的惡性轉化有關［6，7］。作為細胞周期的“制動”因素，細胞核內p27蛋白的降解速度直接決定其絕對數量［8］。p27翻譯后蛋白的調控主要通過蛋白修飾（如磷酸化）來進行［9］，這種翻譯后蛋白修飾決定了蛋白質的穩定性和亞細胞定位。目前已發現至少三條不同的途徑參與p27蛋白的降解，其中最主要的是p27 S10磷酸化位點依賴的p27磷酸化出核－泛素／蛋白酶體途徑［10，11］，S10磷酸化對于p27和CRM1之間的連接是必不可少的［12］。

研究顯示，CRM1參與介導蛋白質和信使RNA的核轉運，是一種重要的亞細胞調節因子。很多穿梭于核膜的腫瘤相關蛋白，如腫瘤抑制蛋白和致癌蛋白，均需要CRM1作為核轉運分子。研究發現，CRM1與p27的出核轉運有關［13］，CRM1可以識別磷酸化的p27，從而介導p27的出核降解。CRM1表達升高可促進p27降解，提示CRM1可能通過促進p27的凋亡來控制p27的活性［14，15］。

本研究顯示，CRM1和P-p27ser10在EOC組織中呈高表達，CRM1高表達與腫瘤FIGO分期、腫瘤分級及淋巴結轉移情況相關，P-p27ser10高表達與腫瘤FIGO分期及組織學分級有關。相關性分析顯示，P-p27ser10與CRM1在EOC組織中的表達呈正相關。研究顯示，P-p27ser10與CRM1是p27出核轉運通路上的關鍵分子，它們與p27的生物學功能密切相關。本研究構建了p27（WT）、p27（S10A）、p27（S10D）細胞，用空載體作為陰性對照組，觀察各組細胞周期及細胞增殖情況。由于只有p27（S10D）擬磷酸化細胞才能發揮類似p27磷酸化的過程，因此我們分別轉染CRM1 siRNA和siRNA陰性質粒到p27 （S10D）細胞，結果顯示，與p27擬磷酸化組（S10D ＋sictrl組）比較，p27（S10A）組增殖減慢。沉默CRM1的表達后，p27（S10D）組的細胞周期進程明顯減慢，S10D＋siCRM1組較S10D＋sictrl組細胞增殖明顯減慢。表明抑制p27 S10磷酸化和抑制CRM1表達可引起SKOV3細胞周期阻滯，降低癌細胞的增殖能力。CRM1可通過抑制p27 S10磷酸化來影響SKOV3的細胞周期進程及增殖。

綜上所述，CRM1相關的p27 S10磷酸化通路可能是導致EOC細胞內p27出核降解的重要機制之一，p27 S10的異常磷酸化和CRM1的表達變化都可能引起細胞周期調控紊亂，最終可能導致癌細胞的惡性增殖及EOC的惡性進展。

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Expression of CRM1 and P-p27ser10in epithelial ovarian cancer tissues and their influence on proliferation of cancer cells

GAO Feifei1，XUE Kai，WANG You
（1 Shanghai Eighth People Hospital，Shanghai 200235，China）

Abstract：Objective To observe the expression of chromosome region maintenance 1（CRM1）and P-p27ser10in epithelial ovarian cancer（EOC）tissues，and to discuss their influence on the proliferation of EOC SKOV3 cell line．Methods We analyzed the association between the expression of CRM1 and P-p27ser10and clinical-pathological characteristics by using immunohistochemical method in 64 EOC samples．Using p27 wild type［p27（WT）］as the template，we established the p27 dephosphorylated mutants with S10 mutation［p27（S10A）group］and with mimic phosphorylated mutation［p27 （S10D）group］．In the p27（S10D）group，SKOV3 were respectively transfected by CRM1-targeted siRNA（S10D＋si-CRM1 group）and siRNA negative plasmid（S10D＋sictrl group）．CCK-8 and flow cytometry were respectively used to detect the proliferation and cell cycle in the p27（WT）group，p27（S10A）group，negative control group，S10D＋siCRM1 group and S10D＋sictrl group．Results In 64 EOC samples，the high expression rates of P-p27ser10and CRM1 were respectively 76．6%and 64．1%，whose high expression rates were associated with histological grade and clinical stage（all P ＜0．05），and they were positively correlated with each other（r＝0．656，P＜0．01）．As for cells in the G1／S phase，the percentage of cells in the S10D＋sictrl group was significantly lower than that of the p27（S10A）group and the percentage of cells in the S10D＋siCRM1 group was significantly higher than that of the S10D＋sictrl group（all P＜0．05）．CCK-8 showed that cell proliferation was significantly faster in the S10D＋sictrl group than in the p27 S10A group while the cellbook=2,ebook=7proliferation was significantly slower in the S10D＋siCRM1 group than in the S10D＋sictrl group（all P＜0．05）．Conclusions The expression of CRM1 and P-p27ser10was increased in EOC．CRM1 participated in the process of p27 S10 phosphorylated nuclear export degradation．The inhibition of both p27 S10 phosphorylation and CRM1 expression leaded to cell cycle arrest and decreased cell proliferation in EOC．

Key words：ovarian neoplasms；p27 protein；ser10；phosphorylation；chromosome region maintenance 1；cell proliferation

收稿日期：（2015-01-28）

通信作者簡介：王酉（1982-），女，主治醫師，主要研究方向為婦科腫瘤的基礎及臨床治療。E-mail：hanghangwang＠hotmail．com

作者簡介：第一高菲菲（1981-），女，主治醫師，主要研究方向為婦科腫瘤的臨床治療。E-mail：ffhigh＠sina．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81001160；81400161）。

中圖分類號：R737．3

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X（2016）02-0001-04

doi：10．3969／j．issn．1002-266X．2016．02．001