晚期糖基化終末產物受體基因p．82G＞S多態性與炎癥性腸病易感性的關系

畢云天，金捷，閆峻（溫州醫科大學，浙江溫州505；溫州市中心醫院；溫州醫科大學第二附屬醫院）

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晚期糖基化終末產物受體基因p．82G＞S多態性與炎癥性腸病易感性的關系

畢云天1，金捷2，閆峻3
（1溫州醫科大學，浙江溫州325035；2溫州市中心醫院；3溫州醫科大學第二附屬醫院）

摘要：目的 探討晚期糖基化終末產物受體（RAGE）基因p．82G＞S多態性與炎癥性腸病（IBD）易感性的關系。方法 選擇IBD患者211例（IBD組），其中潰瘍性結腸炎（UC）160例、克羅恩病（CD）51例，另選擇健康查體者177例作為對照組。采集患者靜脈血，采用聚合酶鏈反應－限制性片段長度多態性方法檢測RAGE基因p．82G ＞S等位基因頻率和基因型頻率。結果 IBD組RAGE S等位基因頻率為22．51%，高于對照組的16．95%；GS基因型頻率為29．86%，高于對照組的16．95%（P均＜0．05）。IBD組中，UC患者S等位基因頻率為23．44%，GS基因型頻率為34．38%，均較對照組顯著升高（P均＜0．05）。CD患者與對照組的等位基因和基因型頻率比較差異均無統計學意義（P均＞0．05）。結論 RAGE基因p．82G＞S多態性與IBD中UC的易感性有一定相關性，攜帶GS基因型者更易患UC。

關鍵詞：炎癥性腸病；潰瘍性結腸炎；克羅恩病；晚期糖基化終末產物受體；單核苷酸多態性

晚期糖基化終末產物受體（RAGE）屬于細胞表面免疫球蛋白超家族一員［1］，RAGE基因的啟動子、外顯子和內含子區域內存在多處多態位點，包括374T／A、429T／C、p．82G＞S、1704G／T和2184A／G等［2，3］。其中p．82G＞S多態性與糖尿病、類風濕關節炎等免疫炎癥反應密切相關［4］。研究顯示，正常腸道上皮細胞中RAGE表達較低，而炎癥狀態下RAGE表達顯著升高［5］，提示RAGE可能對炎癥性腸病（IBD）的發生起重要作用。本研究通過檢測IBD患者RAGE基因p．82G＞S多態性，探討其與IBD易感性的關系。

1　資料與方法

1．1臨床資料 選擇2004年1月～2012年12月溫州醫學院附屬醫院收治的211例IBD患者（IBD組），男112例、女116例，年齡（38．6±14．3）歲。其中潰瘍性結腸炎（UC）160例，克羅恩病（CD）51例。另擇177例健康體檢者作為對照組，男、女各80例，年齡（39．4±9．8）歲。兩組性別、年齡具有可比性。

1．2RAGE基因多態性檢測 采用聚合酶鏈反應－限制性片段長度多態性方法。采集受試者靜脈血1 mL，應用GFX小量血液基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，紫外分光光度計檢測DNA表達。正向引物5′-GTAAGCGGGGCTCCTGTTGCA-3′；反向引物5′-GGCCAAGGCTGGGGTTGAAGG-3′；擴增目的基因片段為含p．82G＞S多態位點的397 bp片段。PCR反應體系：50 ng基因組DNA，1×NH4緩沖液，1 mmol／L MgCl2，0．2 mmol／L dNTPs，6．3 pmol／L引物，0．5 U Taq酶，1 mmol／L甜菜堿。反應條件：95 ℃2 min，95℃30 s、52℃30 s、72℃30 s，35個循環；最后72℃延伸5 min。用5 U內切酶AluI切割擴增片段，瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，等位基因82G酶切片斷為248、123、26 bp；等位基因82S酶切片斷為181、123、67、26 bp。

1．3統計學方法 采用SPSS11．5統計軟件。基因型頻率分布的比較采用χ2檢驗，并進行Hardy-Weinberg平衡檢測，應用OR以及95%可信區間（CI）計算和評估相對風險。P＜0．05為差異有統計學意義。

2　結果

兩組RAGE G82S等位基因頻率和基因型頻率分布達到Hardy-Weinberg平衡。兩組等位基因頻率比較差異有統計學意義（χ2＝4．086，P＝0．043，OR ＝1．439，95%CI為1．010～2．049），基因型頻率比較亦有統計學差異（χ2＝9．404，P＝0．003，OR＝1．960，95%CI為1．271～3．021）。IBD組中，UC患者的S等位基因頻率高于對照組（χ2＝4．417，P＝0．036，OR＝1．500，95%CI為1．026～2．192），GS基因型頻率高于對照組（χ2＝8．832，P＝0．002，OR ＝2．007，95%CI為1．264～3．188）。CD患者的等位基因和基因型頻率與對照組比較差異均無統計學意義（P均＞0．05）。見表1。

表1　IBD組與對照組RAGE　G82S等位基因和基因型分布比較［例（%）］

3　討論

RAGE屬于細胞表面免疫球蛋白超家族成員，其分子結構分為細胞膜外區、一個跨膜結構域和一個細胞內結構域。細胞膜外區有3個免疫球蛋白樣結構，即一個Vd區和兩個C區，RAGE與配體的結合主要發生在Vd區［1，3］。RAGE基因的啟動子、外顯子和內含子區域內存在多處多態位點，包括374T／A、429T／C、p．82G＞S、1704G／T和2184A／G等。p．82G＞S是位于RAGE配體結合域Vd區的功能性氨基酸變異［4］。RAGE基因p．82G＞S多態性與糖尿病、類風濕關節炎等免疫炎癥反應密切相關。腸道免疫反應異常所致的炎癥反應在IBD發病中起重要作用，炎癥因子表達升高是腸黏膜出現炎癥反應的重要特征［6］。RAGE能與多種配體結合，激活胞內多條信號轉導途徑，產生炎癥因子，導致持久的炎癥反應發生［7～9］。研究發現，配體S100A12與RAGE的結合介導了腸道的促炎反應過程［10］，誘發了核轉錄因子-κB依賴性的細胞因子的分泌［11］。RAGE基因p．82G＞S多態是影響血液中可溶性RAGE（sRAGE）水平的重要遺傳因素，與82G等位基因攜帶者相比，82S等位基因攜帶者會出現血液sRAGE顯著降低的現象［12］。我們的前期研究也發現，攜帶RAGE 82S等位基因的個體會出現血液sRAGE表達水平顯著下降的現象，而且這種基因型依賴的sRAGE表達下降在病理條件下（如多發性硬化）更加突出。較低的sRAGE水平可導致患者中和RAGE有害配體（如S100A12）能力的下降，增加與RAGE受體結合的配體數量，最終導致RAGE介導作用增強，產生更多炎癥因子。

近年研究發現，RAGE基因變異會放大配體與RAGE結合后下游炎癥因子的表達。體外實驗顯示，在中國倉鼠卵巢細胞和人類單核細胞中，RAGE p．82G＞S多態可以顯著影響RAGE與配體結合的親和力，表現為82S等位基因編碼的RAGE受體與S100／calgranulin的親和力強于82G等位基因編碼的RAGE受體蛋白，且RAGE受體被配體激活后產生的TNF-α、IL-6、MMP-9表達增加，具有放大免疫、炎癥反應的作用［2］。韓國的一項大樣本人群研究發現，RAGE基因p．82G＞S多態性對人體TNF-α表達、氧化應激及胰島素抵抗等均有顯著影響［12］。本研究結果顯示，IBD組RAGE S等位基因頻率和GS基因型頻率均高于對照組；IBD組中，UC患者S等位基因頻率和GS基因型頻率均高于對照組，CD患者各等位基因和基因型頻率與對照組比較差異均無統計學意義。表明RAGE基因p．82G＞S多態性與UC的易感性有一定相關性，攜帶GS基因型者更易患UC。

綜上所述，RAGE基因p．82G＞S多態性與IBD易感性有關。這將為IBD的治療策略和方法提供幫助，為IBD的治療提供新的靶點，并有助于指導IBD個體化的抗炎治療。

參考文獻：

［1］Neeper M，Schmidt AM，Brett J，et al．Cloning and expression of a cell surface receptor for advanced glycosylation end products of proteins［J］．J Biol Chem，1992，267（21）：14998-5004．

［2］Hofmann MA，Drury S，Hudson BI，et al．RAGE and arthritis：the G82S polymorphism amplifies the inflammatory response［J］．Genes Immun，2002，3（3）：123-135．

［3］Yonekura H，Yamamoto Y，Sakurai S，et al．Novel splice variants of the receptor for advanced glycation end-products expressed in human vascular endothelial cells and pericytes，and their putative roles in diabetes-induced vascular injury［J］．Biochem，2003，370 （3）：1097-1109．

［4］Hudson BI，Stickland MH，Futers TS，et al．Effects of novel polymorphisms in the RAGE gene on transcriptional regulation and their association with diabetic retinopathy［J］．Diabetes，2001，50（6）：1505-1511．

［5］Zen K，Chen CX，Chen YT，et al．Receptor for Advanced Glycation end products Mediates Neutrophil Migration across Intestinal Epithelium［J］．Immunol，2007，178（4）：2483-2490．

［6］Reinecker HC，Steffen M，Witthoeft T，et al．Enhanced secretion of tumour necrosis factor-alpha，IL-6，and IL-1 beta by isolated lamina propria mononuclear cells from patients with ulcerative colitis and Crohn′s disease［J］．Clin Exp Immunol，1993，94（1）：174-181．

［7］Liu R，Mori S，Wake H，et al．Establishment of in vitro binding assay of high mobility group box-1 and S100A12 to receptor for advanced glycation end products：heparin′s effect on binding［J］．Acta Med Okayama，2009，63（4）：203-211．

［8］Bierhaus A，Stern DM，Nawroth PP．RAGE in inflammation：a new therapeutic Target［J］．Curr Opin Investig Drugs，2006，7 （11）：985-991．

［9］Chavakis T，Bierhaus A，Al Fakhri N，et al．The pattern recognition receptor（RAGE）is a counterreceptor for leukocyte integrins：a novel pathway for inflammatory cell recruitment［J］．J Exp Med，2003，198（10）：1507-1515．

［10］Hofmann MA，Drury S，Fu C，et al．RAGE mediates a novel proinflammatory axis：a central cell surface receptor for S100／calgranulin polypeptides［J］．Cell，1999，97（7）：889-901．

［11］Yeh CH，Sturgis L，Haidacher J，et al．Requirement for p38 and p44／p42 mitogen-activated protein kinases in RAGE-mediated nuclear factor-kappaB transcriptional activation and cytokine secretion ［J］．Diabetes，2001，50（6）：1495-1504．

［12］Jang Y，Kim JY，Kang SM，et al．Association of the Gly82Ser polymorphism in the receptor for advanced glycation end products （RAGE）gene with circulating levels of soluble RAGE and inflammatory markers in nondiabetic and nonobese Koreans［J］．Metabolism，2007，56（2）：199-205．

Correlation between p．82G＞S polymorphisms of receptor for advanced glycation end-product gene and susceptibility to inflammatory bowel diseases

BI Yuntian1，JIN Jie，YAN Jun
（1 Wenzhou Medical University，Wenzhou 325035，China）

Abstract：Objective To investigate the correlations between p．82G＞S polymorphisms of receptor for advanced glycation end-product（RAGE）gene and susceptibility to inflammatory bowel diseases（IBD）．Methods Genomic DNA from IBD patients（n＝211）with Crohn′s disease（CD，n＝51）and with ulcerative colitis（UC，n＝160）and from healthy controls（control group）（n＝177）was extracted to detect the allele frequencies and genotype frequencies of RAGE gene p．82G＞S polymorphisms by restriction fragment length polymorphism assay（PCR-RFLP）．Results The RAGE S allele frequencies（22．51%）of the IBD group was higher than that of the control group（16．95%），P＜0．05．The GS genotype frequencies（29．86%）of the IBD group was higher than that of the control group（16．95%），P＜0．05．In the IBD group，UC patients also had higher S allele frequencies（23．44%）and GS genotype frequencies（34．38%）than those of the control group（all P＜0．05）．However，no significant differences were found in the allele frequencies and genotype frequencies between CD patients and healthy controls（all P＞0．05）．Conclusion RAGE gene p．82G＞S polymorphism has certain association with susceptibility to UC，and patients with GS genotype are more susceptible to UC．

Key words：inflammatory bowel disease；ulcerative colitis；Crohn′s disease；receptor for advanced glycation endproduct；single nucleotide polymorphism

收稿日期：（2015-09-30）

作者簡介：第一畢云天（1969-），女，副教授，主要研究方向為疾病的遺傳分析。E-mail：642274912＠qq．com

基金項目：浙江省自然科學基金資助項目（LY12H03004）。

中圖分類號：R394．3

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X（2016）02-0008-03

doi：10．3969／j．issn．1002-266X．2016．02．003