睪酮對去勢急性心肌梗死大鼠心肌細胞2型Ryanodine受體磷酸化的影響

李永健，陳康寅，王林（天津市南開醫院，天津30000；天津醫科大學第二醫院）

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睪酮對去勢急性心肌梗死大鼠心肌細胞2型Ryanodine受體磷酸化的影響

李永健1，陳康寅2，王林2
（1天津市南開醫院，天津300100；2天津醫科大學第二醫院）

摘要：目的 探討睪酮對去勢急性心肌梗死（AMI）大鼠左心室功能、心肌細胞2型Ryanodine受體（RYR2）、磷酸化RYR2（RYR2P）及其亞單位鈣穩蛋白2（FKBP12．6）表達的影響。方法 采用去勢術聯合冠狀動脈結扎術建立雄性SD大鼠去勢AMI模型，隨機分為對照組、小劑量組和大劑量組，分別肌注生理鹽水0．4 mL／kg、丙酸睪酮（PT）10 mg／kg、PT 37．5 mg／kg，2次／周，共6周。采用生理記錄儀檢測主動脈收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、左心室舒張末壓（LVEDP）、左心室壓力最大上升和下降速率（LV±dp／dtmax），Western blot法檢測心肌細胞RYR2、RYR2P、FKBP12．6蛋白，計算RYR2相對磷酸化比值。結果 與對照組相比，大、小劑量組LVEDP均顯著降低（P均＜0．01），LV－dp／dtmax無明顯變化；小劑量組LV＋dp／dtmax顯著升高（P＜0．05），大劑量組LV＋dp／dtmax無明顯變化。與對照組相比，大、小劑量組RYR2蛋白均升高，RYR2P蛋白及RYR2相對磷酸化比值降低（P均＜0．05）；大劑量組FKBP12．6蛋白升高（P＜0．01），小劑量組無明顯變化。結論 睪酮治療可抑制去勢AMI大鼠心肌細胞RYR2過度磷酸化，從而改善心臟功能。

關鍵詞：急性心肌梗死；睪酮；2型Ryanodine受體；大鼠

2型Ryanodine受體（RYR2）是心臟興奮收縮偶聯的關鍵環節。研究表明，RYR2過度磷酸化及其亞單位鈣穩蛋白2（FKBP12．6）缺乏可能是導致急性心肌梗死（AMI）后心力衰竭的重要分子機制［1］。雄激素與心血管疾病關系密切［2，3］。冠心病患者補充雄激素可增加冠狀動脈血流，改善心功能［4，5］。2005年5月，我們對雄性去勢大鼠于AMI后應用不同劑量丙酸睪酮（PT）干預，觀察其左心室功能、心肌細胞RYR2、磷酸化RYR2（RYR2P）及FKBP12．6表達的變化。

1　材料與方法

1．1材料 雄性SD大鼠110只，12周齡，體質量250～350 g，常溫、普通飼料喂養，自由飲水。PT注射液購自天津金耀氨基酸有限公司（丙酸∶睪酮＝1 mL∶25 mg）。

1．2模型制備與分組處理 將大鼠用0．4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥固定。于陰囊中部行一2 cm縱行切口，分離雙側睪丸包膜，擠出睪丸，結扎睪丸動脈及輸精管后切除睪丸，縫合皮膚。繼續飼養2周，采用結扎冠狀動脈前降支的方法制作AMI模型。于肺動脈圓錐和左心耳交界處，將縫合線自左心室側穿入，由肺動脈圓錐側穿出，連同心肌結扎。結扎成功后可見前壁運動幅度減弱，顏色由鮮紅變為灰白。將術后6 h存活的36只大鼠隨機分為小劑量組12只、大劑量組13只、對照組11只，分別肌注PT 10．0 mg／kg、PT 37．5 mg／kg、生理鹽水0．4 mL／kg，2次／周，連續6周。

1．3左心室功能檢查 采用MP150 16導生理記錄儀（美國Biopac公司）。分離1段約2 cm長的右側頸總動脈，結扎遠心端。頸總動脈切開1個小口，將Millar導管輸送至左心室內，待屏幕上顯示波形穩定后，記錄主動脈收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、左心室舒張末壓（LVEDP）、左心室壓力最大上升和下降速率（LV±dp／dtmax）。

1．4心肌細胞RYR2、RYR2P、FKBP12．6蛋白檢測采用Western blot法。每組隨機取6份心臟組織標本，稱重、粉碎，裂解液裂解；上樣、10%SDSPAGE電泳后，將蛋白轉印到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉37℃封閉1 h；加相應一抗4℃過夜，加辣根過氧化酶標記的二抗室溫孵育1 h，X線顯影成像，將顯色條帶掃描至計算機中，使用Image J分析軟件分析底片上條帶的光密度值，以靶蛋白／內參βactin光密度比值作為目標蛋白的相對表達量。RYR2相對磷酸化比值＝RYR2P相對表達量／RYR2相對表達量。1．5 統計學方法 應用SPSS17．0統計軟件。計量資料用±s表示，比較采用方差分析；計數資料采用χ2檢驗。P＜0．05為差異有統計學意義。

2　結果

2．1各組左心室功能比較 見表1。

2．2各組心肌細胞RYR2、RYR2P及FKBP12．6蛋白表達比較 見表2。

表1　各組左心室功能比較（珔x±s）

表2　各組心肌細胞RYR2、RYR2P及FKBP12．6蛋白相對表達量比較（n＝6，珔x±s）

3　討論

興奮收縮偶聯是心臟發揮泵功能的生理基礎，其中RYR2是該偶聯的核心環節。RYR2的開放程度和開放數目受其自身磷酸化水平影響。當RYR2磷酸化水平增高時，其對Ca2＋通透性增高；反之，則其對Ca2＋通透性下降［6，7］。另外，RYR2的功能亦受FKBP12．6調節。FKBP12．6與RYR2結合后，可使RYR2通道密閉性增加，減少Ca2＋滲漏。當RYR2磷酸化水平升高時，FKBP12．6與RYR2親和力下降，二者發生解離，RYR2的通透性升高，增加了肌質網Ca2＋外流［6］。FKBP12．6是調控RYR2通道開放和關閉的關鍵分子［1］。AMI后心臟交感神經過度激活可使血漿兒茶酚胺水平增高，導致RYR2過度磷酸化，并使FKBP12．6缺乏，導致RYR2通道間的偶聯程度降低，引發舒張期肌漿網Ca2＋滲漏，心肌收縮功能減低；同時Ca2＋滲漏可引起延遲后除極，容易誘發惡性心律失常［6，8］。

English等［9］報道，睪酮可改善心肌梗死模型大鼠冠狀動脈血流，增加心室縮短分數和心肌耗氧峰值，具有改善心功能的作用；而去勢則可導致心室射血分數和舒張功能降低。臨床研究也發現，補充低劑量睪酮可使心絞痛患者的冠狀動脈血流增加，運動耐量加強［10］。本研究顯示，小劑量PT可顯著降低AMI大鼠LVEDP，升高LV±dp／dtmax，降低左心室負荷，有利于AMI后心臟功能的改善，防止心力衰竭發生。大劑量PT盡管也顯著降低了大鼠LVEDP，但是未顯著升高LV±dp／dtmax，其療效不如小劑量PT顯著。

目前關于睪酮對RYR2磷酸化水平及FKBP 12．6表達影響的研究少見。本研究顯示，去勢AMI大鼠應用大、小劑量PT治療后，RYR2蛋白顯著增加，RYR2P顯著降低，RYR2相對磷酸化比值顯著降低，FKBP12．6蛋白表達增多。表明PT可顯著逆轉去勢AMI大鼠心肌興奮收縮偶聯的結構及功能異常，改善心肌收縮功能。但就具體劑量而言，小劑量PT在改善心功能方面較大劑量PT更具優勢。這可能是由于PT治療不僅僅是通過改善心肌興奮收縮偶聯這一條途徑來改善心臟功能，其他機制有待進一步研究。

參考文獻：

［1］Zalk R，Clarke OB，des Georges A，et al．Structure of a mammalian ryanodine receptor［J］．Nature，2015，517（7532）：44-49．

［2］Haffner SM，Mykkanen L，Valdez RA，et al．Relationship of sex hormones to lipids and lipoproteins in nondiabetic men［J］．J Clin Endocrinol Metab，1993，77（6）：1610-1615．

［3］宋靜，魏毅東，徐亞偉，等．血清睪酮水平與男性冠狀動脈性心臟病的相關性［J］．上海醫學，2010，33（5）：459-461．

［4］Bell JR，Bernasochi GB，Varma U，et al．Sex and sex hormones in cardiac stress--mechanistic insights［J］．J Steroid Biochem Mol Biol，2013，137（9）：124-135．

［5］王琦，吳賽珠，徐阓，等．老年男性慢性心力衰竭患者血漿睪酮與心室重構和氧化應激的關系［J］．中華老年心腦血管病雜志，2012，14（4）：340-342．

［6］Cheung JW，Meli AC，Xie W，et al．Short-coupled polymorphic ventricular tachycardia at rest linked to a novel ryanodine receptor （RyR2）mutation：leaky RyR2 channels under non-stress conditions［J］．Int J Cardiol，2015，180（2）：228-236．

［7］Zhao YT，Valdivia CR，Gurrola GB，et al．Arrhythmogenesis in a catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia mutation that depresses ryanodine receptor function［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2015，112（13）：1669-1677．

［8］Scheuer J，Malhotra A，Schaible TF，et al．Effects of gonadectomy and hormonal replacement on rat hearts［J］．Circ Res，1987，61 （1）：12-19．

［9］English KM，Steeds RP，Jones TH，et al．Low-dose transdermal testosterone therapy improves angina threshold in men with chronic stable angina：A randomized，double-blind，placebo-controlled study［J］．Circulation，2000，102（16）：1906-1911．

［10］Hsu JC，Cheng CC，Kao YH，et al．Testosterone regulates cardiac calcium homeostasis with enhanced ryanodine receptor 2 expression through activation of TGF-beta［J］．Int J Cardiol，2015，190（7）：11-14．

收稿日期：（2015-08-18）

中圖分類號：R542．2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X（2016）02-0026-02

doi：10．3969／j．issn．1002-266X．2016．02．009