魚類皮膚免疫應答及蛋白質組學

呂愛軍，胡秀彩，孫敬鋒，石洪玥，陳成勛，李 莉，孔祥會

( 1．天津農學院 水產學院，天津市水產生態及養殖重點實驗室，天津 300384；2.河南師范大學 水產學院，河南 新鄉 453007 )

魚類皮膚免疫應答及蛋白質組學

呂愛軍1，胡秀彩1，孫敬鋒1，石洪玥1，陳成勛1，李 莉2，孔祥會2

( 1．天津農學院 水產學院，天津市水產生態及養殖重點實驗室，天津 300384；2.河南師范大學 水產學院，河南 新鄉 453007 )

魚類；皮膚；免疫應答；蛋白質組學

S94

魚類皮膚作為黏膜免疫系統的重要組成部分，也是阻止病原微生物進入體內的第一道防線[1]。魚類皮膚黏膜免疫系統不僅對宿主防御病原侵入是必要的，而且對水產養殖疫苗應用也十分重要[2-3]。近年來，與系統免疫相比而言，魚類皮膚黏膜免疫應答研究備受關注[4-6]。筆者針對魚類皮膚免疫應答的分子機制及蛋白質組學研究進行簡要綜述，以期為魚類病害的預防和治療提供科學參考。

1 魚類皮膚免疫應答

1.1 皮膚抗體與免疫應答

魚類皮膚上皮組織中含有大量的黏液細胞、巨噬細胞和各類淋巴細胞，與其他活性物質組成了抵御病原微生物感染的有效防線[7-8]。魚類皮膚分泌的抗體可以參與保護機體，并防御病原的感染[9-11]。最近相繼從草魚(Ctenopharyngodonidellus)、斑點叉尾(Ictaluruspunctatus)、斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)等魚類的皮膚培養液中檢測到特異性抗體[10-12]。研究發現魚類皮膚黏液中不僅存在免疫球蛋白，而且一些魚類的皮膚中含有抗體分泌細胞[13-14]。除IgM外，已報道IgT是一種黏膜免疫抗體，認為在魚類皮膚、腸道抗感染免疫中起重要作用[15-16]。更直接的證據來自對免疫后斑點叉尾的皮膚進行離體培養試驗[17-18]，結果表明,皮膚黏液中的抗體是由上皮組織內的細胞合成并釋放，能固化和殺死多子小瓜蟲(Ichthyophthiriusmultifiliis)，阻止其連續入侵。Shoemaker等[19]報道從腹腔注射免疫的斑點叉尾皮膚培養液中檢測到抗柱狀黃桿菌(Flavobacteriumcolumnare)抗體，并且尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)注射佛氏完全佐劑和福爾馬林滅活的柱狀黃桿菌后，具有皮膚黏膜抗體的免疫應答[20]。最近報道石斑魚在注射或浸泡免疫刺激隱核蟲(Cryptocaryonirritans)1周后，通過酶聯免疫吸附試驗能夠檢測出血清和皮膚培養上清液的抗體滴度[10]。目前已經建立了斑點叉尾離體皮膚抗體的檢測方法[17-18]。Xu等[11]研究報道在小瓜蟲幼蟲感染斑點叉尾皮膚培養液中的抗體水平不斷升高。研究表明，魚類皮膚抗體的免疫應答在抵抗寄生蟲病原的獲得性免疫中具有重要作用[11，17-18]。Saha等[21]研究表明，IgM輕鏈基因型在紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)皮膚和鰓中有表達，認為黏液免疫球蛋白在體表的免疫保護中起重要作用。研究表明魚類皮膚局部不僅可以產生分泌抗體，還可能存在獨立的皮膚免疫應答機制[22-23]。盡管對魚類皮膚免疫應答取得初步了解，目前對皮膚相關細胞因子的來源尚不清晰。

1.2 皮膚免疫應答的分子調控

對人和哺乳動物的研究表明，皮膚不僅具有非特異性免疫防御功能，而且參與機體特異性免疫的抗原識別、免疫細胞激活及皮膚免疫應答等過程[8，24]。與哺乳動物相比，關于魚類皮膚免疫應答的分子調控機制，目前仍不十分清楚[25-26]。Karsi等[27]最早進行斑點叉尾皮膚表達轉錄組分析獲得1909 ESTs片段，鑒定為496個皮膚相關基因。此后，陸續報道體表寄生蟲感染虹鱒(Oncorhynchusmykiss)皮膚免疫相關基因表達調控的研究[28-32]。研究表明，白介素(IL-1β)是鯉魚(Cyprinuscarpio)皮膚炎癥應答中最重要、反應最快的介導物之一[33]。IL-1β是一種多功能細胞因子，其不僅在魚類皮膚免疫應答的起始階段起重要作用，而且在皮膚炎癥反應過程中與免疫相關基因的表達有關[28，33]。Gonzalez等[34]發現，寄生蟲感染的鯉魚皮膚中IL-1β表達在36 h達到峰值，這與由機械損傷的皮膚而誘導的表達模式一致，說明IL-1β轉錄水平上調很可能是由于體外寄生蟲穿透皮膚上皮屏障造成機械損傷引起。Matejusová等[35]采用抑制性差減雜交技術對三代蟲(Gyrodactylussalaris)感染誘導大西洋鮭(Salmosalar)皮膚基因表達譜進行分析，結果篩選獲得162個克隆，其中免疫相關基因約占12.5%。三代蟲感染虹鱒皮膚中IFN-γ上調表達，B細胞、嗜中性粒細胞等參與皮膚免疫應答[36]。采用多子小瓜蟲感染鯉魚皮膚模型進行研究，結果表明在2個皮膚cDNA文庫共計3500 ESTs序列中發現82個免疫相關基因，主要有補體系統基因表達(C7，FP，FD)、干擾素和CC趨化因子等，提示這些細胞因子在魚類皮膚免疫系統中起重要調節功能[37-38]。最近，利用基因芯片結合qRT-PCR技術等對寄生蟲感染的大西洋鮭皮膚進行基因表達譜分析，主要包括免疫應答、氧化應激、蛋白折疊和細胞骨架蛋白相關基因發生變化[39-40]。Caipang等[41]采用qRT-PCR方法對26個大西洋鱈(Gadusmorhua)皮膚免疫相關基因轉錄譜進行分析，發現皮膚相關高表達基因主要參與抗菌活性、抗病毒應答、細胞因子、應激反應以及抗調亡活性等。Lü等[42]采用斑馬魚(Daniorerio)基因芯片技術等進行弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)感染誘導斑馬魚皮膚的基因表達譜分析，結果表明斑馬魚皮膚差異表達基因229個，其中有196個上調表達基因和33個下調表達基因；進一步通過Gene Ontology和KEGG信號通路分析表明，88個差異表達基因與皮膚免疫應答顯著相關，主要包括補體激活、急性期反應、應激防御反應、抗原加工提呈、細胞遷移黏附、凝血因子和血小板激活、細胞調亡和自噬調節等免疫應答過程。與鯉魚皮膚轉錄譜[37]比較分析，發現魚類存在一個類似的非特異性免疫應答機制(如干擾素、凝集素、熱休克蛋白、補體等)，同時在斑馬魚皮膚中檢測到一些不同的急性期反應相關基因(轉鐵蛋白、銅藍蛋白、卵黃原蛋白和α-1-微球蛋白等)。近幾年基于魚類皮膚免疫應答相關文獻報道轉錄組分析[27-42]，研究揭示了病原體感染誘導魚類皮膚局部產生釋放IL-1β，從而促使皮膚杯狀細胞分泌黏液(包含溶菌酶、蛋白酶、凝集素等)、巨噬細胞激活以及一些TLR、MAPK等信號通路相關基因上調表達，其中TNF-α上調表達可能與皮膚中肥大細胞激活與脫顆粒有關，通過吸引巨噬細胞、中性粒細胞至皮膚上皮組織，并且導致皮膚中氧自由基、活性氮的生成和補體成分的分泌，最終啟動激活魚類皮膚免疫應答反應。也有報道認為TGF-β、前列腺素等細胞因子在魚類皮膚應答反應中可能起抑制調節作用[1]。因此，魚類皮膚免疫應答的分子調控機制仍不十分清楚，進一步詮釋“魚類皮膚免疫分子的調控機制”，在蛋白質水平上尚需進行大量試驗研究驗證。

筆者對嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)感染的斑馬魚皮膚轉錄組研究表明，斑馬魚感染36 h后基因表達發生明顯差異表達，檢測到222個皮膚免疫相關基因，包括補體活化(c3、c3b、c8a、c8g、c9、cfb和c6)，急性期反應(載脂蛋白ApoA-I、ApoA-II、卵黃蛋白原)，應激反應(熱休克蛋白hsp70、hsp90a.1、hsp90a.2)，趨化因子(ccl1、cxcl14、ccl-c5a和cxl-c24a)和細胞凋亡，KEGG分析顯示這些基因參與了MAPK、p53、Wnt、TGF-b、Notch、ErbB、JAK-STAT、VEGF、mTOR和鈣信號等免疫信號通路[26]。以上研究提示魚類皮膚免疫相關基因在機體抗感染免疫中發揮重要作用，這有助于理解魚類皮膚免疫應答的分子調控機制。

2 魚類皮膚免疫蛋白質組學

2.1 皮膚黏液蛋白質組學

魚類皮膚黏液成分比較復雜，主要由黏液細胞產生并分泌到皮膚表面，其主要成分為黏蛋白，它是一種分子量約106 ku的糖蛋白[7-8]。此外，黏液中含有多種酶和免疫因子，包括溶菌酶、組織蛋白酶、酯酶、金屬蛋白酶、免疫球蛋白、凝集素、干擾素、鈣調素、補體、抗菌肽、組蛋白和核糖體蛋白等[1，8]。近幾年，隨著蛋白質組學技術的發展成熟，開始應用雙向凝膠電泳、質譜技術等開展魚類黏液蛋白質組學相關研究[43-44]。Rajan等[43]采用雙向凝膠電泳結合液相色譜—質譜聯用技術對大西洋鱈皮膚黏液的蛋白質組學分析，發現皮膚黏液中存在凝集素、g型溶菌酶、絲氨酸蛋白酶抑制劑/半胱氨酸蛋白酶抑制劑B、親環素A、FK-506結合蛋白、蛋白酶體亞基(α-3和α-7)和泛素等免疫功能分子。通過MS技術鑒定牙鲆(Paralichthysolivaceus)皮膚黏液中存在轉鐵蛋白，IgM水平、溶菌酶活性較高，對遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)、創傷弧菌(Vibriovulnificus)等多種魚類病菌有較強抗菌活性[45]。研究表明，柱狀黃桿菌、殺鮭弧菌(V.salmonicida)對魚類皮膚黏液具有趨向性，其中熱休克蛋白DnaK、分子伴侶GroEL和鞭毛蛋白等上調蛋白參與細菌運動性和氧化應激反應[46-47]。Ma等[48]對不同水溫度下大菱鲆(Scophthalmusmaximus)皮膚黏液的差異蛋白質組進行研究，篩選6個差異蛋白進行質譜鑒定，結果表明凝集素和細胞角蛋白在黏液抗熱脅迫中可能是潛在的生物標志物，這為進一步研究魚類皮膚黏液的環境脅迫機制提供參考。Valdenegro-Vega等[49]采用蛋白質組學和基因組學技術，研究患阿米巴鰓病大西洋鮭鰓和皮膚黏液的差異蛋白質組學，發現42個皮膚黏液相關蛋白，其中包括C反應蛋白、載脂蛋白1、顆粒體、組織蛋白酶、血管生成素-1等參與細胞信號轉導和炎癥途徑，結果表明,黏液中的補體C3、前梯度蛋白-2和膜聯蛋白A-1等蛋白可能是魚類皮膚感染相關蛋白標志物。最近，Jurado等[50]采用液相色譜—質譜聯用技術和2-DE-PMF-MS/MS技術首次成功構建了金頭鯛(Sparusaurata)皮膚黏液蛋白質組學圖譜，進行GO聚類分析將其分成4類蛋白，其中參與應激反應的蛋白有WAP65、熱休克蛋白70、銅鋅氧化物歧化酶和PRDX1、PRDX2等；信號轉導蛋白有PP2A 65 ku調節亞基、14-3-3蛋白β/α、酪氨酸3單加氧酶/色氨酸5單加氧酶激活蛋白、RhoGDI和PEBP1。Rajan等[51]對鰻弧菌(V.anguillarum)感染的大西洋鱈皮膚黏液蛋白質組進行研究，發現一些顯著差異表達的黏液免疫相關蛋白，主要涉及鈣蛋白酶小亞基1、谷胱甘肽-S-轉移酶ω1、蛋白酶體26S亞基、14 ku載脂蛋白、β2-微管蛋白、冷誘導RNA結合蛋白、蘋果酸脫氫酶2和Ⅱ型角蛋白，鰻弧菌浸泡感染試驗表明，β2-微管蛋白、冷誘導RNA結合蛋白、鈣蛋白酶小亞基1、谷胱甘肽-S-轉移酶ω1等差異蛋白的mRNA在早期感染的皮膚組織中高表達。Sanahuja等[52]報道，采用2D技術在金頭鯛皮膚黏液中發現1300個蛋白點，進一步采用液相色譜—質譜聯用方法對其中100個高豐度蛋白進行鑒定分析，結果表明62個蛋白分屬于12個GO類別，主要涉及一些結構、代謝和保護蛋白等生物學過程，包括熱休克蛋白、轉鐵蛋白、血紅素結合蛋白等。最近，通過對魚類皮膚黏液的蛋白質組學研究，除發現黏蛋白、溶菌酶、補體等皮膚免疫相關蛋白外，其中轉鐵蛋白、熱休克蛋白、C反應蛋白、載脂蛋白等在魚類皮膚黏液中可能發揮重要作用[45，49，52]，但是這些蛋白在魚類皮膚免疫應答過程中的作用機制尚未見文獻報道。而且，從國外學者對魚類皮膚黏液蛋白質組學的研究報道來看，在分子水平上試圖闡明魚類皮膚黏液的蛋白質組學機制尚存在爭議[43，45]。目前，針對不同魚類黏液的蛋白質組學研究，包括大西洋鱈、金頭鯛、鯽魚(Carassiusauratus)等獲得皮膚黏膜免疫相關蛋白鑒定仍存在一定差異，研究結果顯示參差不齊[43-51]，有待于進一步深入開展研究工作。盡管如此，魚類皮膚黏液的蛋白質組學以及建立黏液蛋白圖譜研究，將有利于發現更多皮膚黏液中的免疫相關蛋白，為魚類皮膚黏膜免疫應答機制奠定理論基礎。

2.2 皮膚蛋白質組學

魚類皮膚不僅維持魚類體內穩態的物理屏障，而且是機體抵抗病原體入侵的有效防線之一[1，8]。因此，研究魚類皮膚免疫應答相關蛋白，有助于了解魚類皮膚對病原體的防御機制，對魚類疾病的防治具有重要意義。盡管魚類皮膚是黏膜免疫系統的重要組成部分，但關于皮膚免疫應答的蛋白質組學研究起步相對較晚，目前鮮有文獻報道[44，52]。Lü等[44]采用雙向電泳結合質譜技術，檢測嗜水氣單胞菌感染斑馬魚皮膚的差異表達蛋白，其中免疫相關蛋白包括MHC Ⅱ類DRa1域、肌球蛋白重鏈V區、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、轉錄因子AP-2α和肌動蛋白等，再運用基因芯片進一步證實蛋白質組學的結果，分別從蛋白質水平和轉錄水平，對細菌感染斑馬魚皮膚免疫應答機制進行探討。Ibarz等[53]運用等離子分析、雙向凝膠電泳和液相色譜—質譜聯用等技術，研究金頭鯛在雌激素刺激下再生皮膚與正常皮膚的差異蛋白質組學，結果表明，在皮膚再生階段初期，細胞增殖相關蛋白包括骨甘氨酸、脂質運載蛋白2、核纖層蛋白A和轉錄因子等呈現上調表達，提示他們可能參與皮膚組織形成、再生過程，并且雌二醇-17β(E2)與皮膚傷口愈合有一定關系。最近，筆者采用嗜水氣單胞菌浸泡感染鯽魚皮膚的差異蛋白質組學分析，發現皮膚免疫相關蛋白包括肌動蛋白、肌酸激酶M型、角蛋白、熱休克蛋白同源71 ku等，對鑒定蛋白進行GO分析和KEGG信號通路分析，將差異蛋白分為15種生物學功能，主要參與吞噬體、緊密連接、Wnt等19種免疫相關信號通路(待發表)。以上研究報道，不僅為解釋魚類皮膚組織的生理功能和黏膜屏障提供科學依據，而且為進一步探索皮膚的病理蛋白質組學及分子免疫機制奠定基礎。但是，與皮膚免疫應答的轉錄組學研究相比[27-42]，針對魚類皮膚的蛋白質組學分析還非常薄弱[44，53]，亟待今后研究解決。

3 研究展望

近年來，魚類皮膚黏膜免疫應答的分子機制是魚類免疫學研究熱點問題之一[1-6]。綜上所述，魚類除了具有機體系統免疫應答外，針對病原可能還有其他的免疫保護機制，還存在獨立的皮膚免疫系統。研究表明魚類皮膚已具備免疫系統的構成要件，皮膚作為最大的免疫器官含有大量的免疫細胞與免疫分子[1，7-8]，其中諸多皮膚免疫分子仍需要在蛋白質水平上研究驗證其確切功能。目前國外的已有報道建立了斑馬魚轉基因品系，可用于皮膚細胞凋亡的相關研究，而且鑒定獲得一些斑馬魚皮膚免疫相關基因蛋白[54-55]，為今后系統地研究魚類皮膚免疫應答的分子調控機制奠定基礎。迄今為止，針對魚類皮膚免疫應答的蛋白質組學研究尚處于起步階段[44，51]，還有許多問題有待研究解決。例如：對魚類皮膚免疫相關分子細胞學基礎及分子機制仍不清晰；此外，魚類皮膚免疫應答的蛋白質組學與轉錄組學、代謝組學等關聯分析研究，亟待研究解決。近幾年，筆者較早進行了模式生物斑馬魚皮膚免疫應答的蛋白質組學方面研究工作，值得進一步深入開展相關研究。

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ProteomicsandImmuneResponsesinSkinofFish

Lü Aijun1, HU Xiucai1, SUN Jingfeng1, SHI Hongyue1, CHEN Chengxun1, LI Li2, KONG Xianghui2

( 1. Tianjin Key Lab of Aqua-Ecology and Aquaculture，College of Fisheries，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384, China; 2. College of Fisheries, Henan Normal University, Xinxiang 453007, China )

fish; skin; immune response; proteomics

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.03.020

C

0302-06

1003-1111(2016)03-

2015-07-20；

2015-11-10.

國家自然科學基金資助項目(31272692)；天津市應用基礎與前沿技術研究重點項目(15JCZDJC34000).

呂愛軍 (1973—)，男，教授；研究方向：水產動物微生物及免疫學.E-mail：lajand@126.com.