轉錄組學技術及其在瓜菜作物上的應用

張艷艷，季葦芹，楊玉文，關 巍，趙廷昌

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院 長春 130118； 2.植物病蟲害生物學國家重點實驗室·中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所 北京 100093）

隨著功能基因組時代的到來，轉錄組學、蛋白質(zhì)組學和代謝組學等各種組學技術相繼出現(xiàn)，其中轉錄組學是率先發(fā)展起來以及應用最廣泛的技術[1]。利用轉錄組學技術分析植物對生物脅迫和非生物脅迫的應答機制，成為當前逆境生理研究中的重要課題[2]。Velcuescu等[3]首先提出了轉錄組的概念，它是生物體的特定細胞或組織在某一功能狀態(tài)下轉錄出所有RNA的集合，包括mRNA和各種非編碼RNA，如rRNA、tRNA、還有最近發(fā)現(xiàn)的snoRNA、snRNA、microRNA等。對組織或細胞中的RNA反轉錄為cDNA并利用近幾年興起的轉錄組測序技術（RNA-squencing，RNA-seq）進行測序，可以發(fā)現(xiàn)未知轉錄本、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）以及各種分子標記等基因資源，能夠反映出物種轉錄本的結構和表達水平，并可以揭示逆境脅迫下植物的分子機制，其應用具有遠大前景。目前對于瓜菜作物的遺傳學背景了解甚少，其基因組信息還比較缺乏，對一些關鍵基因以及對生物和非生物脅迫應答的機制也不是很清楚。轉錄組學作為功能基因組學的前沿學科，在弄清楚植物與環(huán)境互作的信息方面發(fā)揮著不可替代的作用，被越來越多地應用到瓜菜作物的研究中來，為獲得瓜菜作物與環(huán)境互作的關鍵基因及重要代謝通路等生物學信息奠定理論基礎，同時對克隆瓜菜作物重要功能基因、遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源鑒定以及分子標記輔助育種均有不可估量的作用。筆者對功能基因組學中的轉錄組學的主要技術方法及在瓜菜作物上的應用予以闡述。

1 轉錄組學的主要技術方法

隨著研究的深入，人們建立了一系列的方法和技術用于轉錄組學的研究，目前研究轉錄組學主要有表達序列標簽（Expressed squence tags，ESTs）、基因表達系列分析技術（Serial analysis of gene expression，SAGE）、大規(guī)模平行測序技術（Massively parallel signature sequencing，MPSS）、基 因芯 片（Microassay）及基于二代測序技術的轉錄組測序分析（RNA sequencing，RNA-seq）等方法。其中，由于RNA-seq能夠較為快速、準確地為人們提供更多的生物體轉錄信息，故成為最新興起的利用深度測序進行轉錄組分析的技術，受到廣泛關注。

1.1 表達序列標簽（Expressed sequence tags，ESTs）

表達序列標簽是從一個隨機選擇的cDNA克隆進行5’端和3’端單向測序獲得長度300～500 bp的cDNA部分序列，攜帶有表達基因的部分遺傳信息[4]。通過將ESTs數(shù)據(jù)庫與基因數(shù)據(jù)庫已知序列進行比對，可以了解到生物生長發(fā)育、繁殖分化、遺傳變異和衰老死亡等一系列生命過程。ESTs已廣泛應用于基因識別、基因圖譜的繪制、基因預測、基因克隆及功能分析等多個方面。在瓜菜作物如黃瓜、甜瓜、番茄、辣椒和西瓜等基因表達研究[5]、構建遺傳學圖譜[6]及分子遺傳標記[7-13]研究中也有相關報道。

1.2 基因表達系列分析技術（SAGE）和大規(guī)模平行測序技術（MPSS）

基于短序列測序的轉錄組研究方法，SAGE是Velculescu等[14]在1995年首次建立的一種高效、快速分析基因表達譜的開放性差異基因表達技術。該技術無需知道物種的基因組信息，便能夠整體地檢測所有轉錄本的表達水平，對發(fā)現(xiàn)低拷貝基因有著重要意義[15]。然而多數(shù)序列標簽為低豐度轉錄本，并不適合對遺傳信息匱乏的瓜菜作物轉錄組研究。

MPSS技術是在SAGE技術上進行改進，由Brenner等[16]2000年建立，成為一種新型基因克隆技術，可以獲得更長的短標簽序列，從而提高轉錄本的精確度。其特有的微球熒光測序還可以直接高通量讀出序列[17-18]，被認為是功能基因組研究的有效工具，可在短時間內(nèi)檢測到細胞或組織內(nèi)幾乎所有基因的轉錄情況。

然而，這2種技術過程中包含了酶切、克隆或雜交等繁瑣步驟，這些步驟可能會導致序列出現(xiàn)堿基偏向性，從而影響轉錄本的正確性[19]。

1.3 基因芯片（Microassay）技術

基因芯片是基于核酸雜交的一種轉錄組研究技術，利用紅、綠熒光染料分別標記實驗樣本和對照樣本cDNA，混合后與基因芯片雜交，可顯示實驗樣本和對照樣本基因的表達強度[20]。目前，基因芯片主要應用于基因表達檢測、尋找新基因、基因突變及基因文庫作圖等方面研究。

基因芯片技術比較成熟，能夠準確地檢測較高表達的基因。但因雜交背景高，受基因拷貝數(shù)的限制無法檢測出低豐度基因，以及數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)有限，可能出現(xiàn)注釋錯誤。

1.4 轉錄組測序技術（RNA-sequencing，RNA-seq）

以雙脫氧終止法核酸技術（Sanger技術）為代表的第一代測序技術完成了人類基因組的繪制，在測序長度（可達 1 000 bp）和堿基準確率（高達99.999%）有著明顯的優(yōu)勢，但因其實驗周期長，花費大和測序通量低，并不能滿足在大規(guī)模測序中應用的需求[21-23]。

隨著生命科學的發(fā)展進入后基因組時代，應運而生的是RNA-Seq技術，它可同時對數(shù)十萬乃至數(shù)百萬條DNA進行測序，也可用于檢測總RNA或mRNA等轉錄本的研究，能夠全面、深入和細致地分析一種生物的組織或細胞的基因組、轉錄組，因此又被稱為深度測序[24]。

RNA-Seq 最初由 Ugrappa Nagalakshmi等[25]和Zhong Wang等[26]分別發(fā)表了利用RNA-Seq技術闡述裂殖酵母（fission yeast）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）轉錄組的研究論文，標志著該技術的建立，極大地推動了許多非模式植物、農(nóng)作物和經(jīng)濟作物的全基因組測序工作。因該技術可以獲得全部轉錄本的豐度信息及具有較高的準確度，故能夠應用于瓜菜功能基因組學研究，且在瓜菜作物抗逆、抗病基因發(fā)掘和種質(zhì)資源評估應用方面前景廣闊。

相較傳統(tǒng)的測序技術而言，RNA-Seq因具有高通量、低成本、對物種遺傳背景和靈敏度要求較低、重復性好、精確度高、不需要太大的RNA量且可檢測到低至幾個拷貝的轉錄本等特點，從而表現(xiàn)出其獨特的優(yōu)越性，日漸成為轉錄組研究的主要方法[27-29]。RNA-Seq已廣泛涉及營養(yǎng)、發(fā)育階段、病原物、非生物脅迫等研究領域，對于獲得物種或組織的轉錄本信息及轉錄本上基因的相關信息、發(fā)現(xiàn)新基因和可變剪切以及進行基因結構優(yōu)化和基因表達差異分析等[30-33]均具有促進作用。

2 轉錄組學技術在瓜菜作物上的應用

轉錄組學技術因具有測序通量高、時間短且成本低、信息量大等優(yōu)勢，現(xiàn)已被廣泛應用于瓜菜作物轉錄組的研究中，如辣椒（Capsicum annuumL.）[34]、南瓜（Semen cucurbitae）[35]、西葫蘆（Cucurbita pepoL.）[36]、西瓜（Citrullus lanatus）[37-38]、黃瓜（Cucumis sativusL.）[39]、甘薯（Ipomoea batatas）[40]、大蒜（Allium sativumL.）[41]、西蘭花（Brassica oleracea）[42]、番茄（Solanum lycopersicum）[43-44]等作物。這些研究運用RNA-seq技術，有助于發(fā)現(xiàn)瓜菜作物轉錄組的重要基因和SSR分子標記。此外，瓜菜作物在受到生物和非生物因素影響后，會引起自身代謝失衡等生理狀態(tài)的變化，而運用轉錄組學方法，可以研究特定時間、特定狀態(tài)下內(nèi)源因子和外源因子調(diào)控的基因表達差異情況，在瓜菜非生物脅迫和抗病機制研究應用方面前景廣闊。

2.1 非生物脅迫條件下轉錄組學技術在瓜菜作物上的應用

非生物脅迫如干旱、高鹽、冷害、高溫、水澇等會影響植物水分、光合、呼吸、物質(zhì)代謝等過程，進一步誘導植物相關基因的表達，最終積累某些物質(zhì)并改變其代謝途徑。而植物為了生存下來，在長期的系統(tǒng)發(fā)育中逐漸形成了對逆境的眾多的適應和抵抗機制，轉錄水平上的基因表達和調(diào)控則在其中發(fā)揮重要作用[45]。研究非生物脅迫條件下植物的基因表達譜也已成為第二代測序技術的重點應用領域，在瓜菜作物的研究上也逐漸廣泛開展起來。

陳嘉貝[46]采用RNA-Seq技術，對鹽脅迫處理前后的甜瓜進行了轉錄組分析，發(fā)現(xiàn)大量轉錄因子表達發(fā)生了顯著變化。通過測定這些轉錄因子表達的特性和規(guī)律，為更好地理解甜瓜對鹽脅迫響應的分子機制以及對作物耐鹽機制的認識提供參考。盧坤等[47]通過Illumina測序技術分析鑒定到3 657個油菜葉片干旱脅迫應答相關基因，經(jīng)過GO（Gene Ontology）和 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析，顯著富集到 ABA（abscisic acid）刺激響應的基因，揭示了油菜抵抗或適應外界干旱環(huán)境在轉錄水平上依賴ABA合成和信號轉導，以提高體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗氧化物質(zhì)合成基因的表達水平，這與Zhang等[48]對其他植物抗旱機制的研究結果一致。證實了ABA信號轉導和次生代謝途徑對油菜干旱脅迫抗性的重要性。尹波[49]借助RNA-Seq技術測定了高溫處理前后的番茄植株轉錄組動態(tài)變化，篩選到大量受高溫脅迫的基因。這些基因參與環(huán)境應答、轉錄調(diào)控、代謝、信號轉導等一系列應答過程，揭示了番茄高溫脅迫下轉錄組水平的復雜的調(diào)控網(wǎng)絡。此外，有關瓜菜作物耐鉀、耐寒的轉錄組研究也有相關報道[50-51]。

瓜菜抗逆轉錄組和表達譜研究表明，參與脅迫響應的基因可通過調(diào)控涉及信號受體、轉導及轉錄調(diào)節(jié)類蛋白編碼的基因表達以及調(diào)節(jié)編碼具有保護功能產(chǎn)物基因的表達，最終合成抗逆代謝物相關蛋白，從而提高作物的脅迫耐受性。

2.2 瓜菜作物與病原菌互作的轉錄組學研究

在與病原菌互作研究領域，轉錄組學技術現(xiàn)已廣泛應用于各種瓜菜作物的病害研究。

Tan 等[52]對黃萎病菌（Verticillium dahliae）誘導的番茄根系中提取到的mRNA建立cDNA文庫進行RNA-seq分析，共篩選到1 953個顯著的差異表達基因，GO、COG（Cluster of Orthologous Groups）和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，這些基因參與生物調(diào)節(jié)、次級代謝、信號轉導、苯丙烷代謝及植物-病原互作途徑，為挖掘防御相關基因及深入解析番茄與黃萎病菌互作機制提供廣泛的數(shù)據(jù)支持。Kong等[53]對灰霉病（Botrytis cinerea）誘導前后的黃瓜轉錄組研究中，發(fā)現(xiàn)了3 512個差異表達基因，經(jīng)過GO功能注釋和KEGG代謝途徑分析，篩選到一些包括參與ABA、ET、生長素以及谷胱甘肽代謝（GSH）途徑的基因，這些基因在黃瓜抗灰霉病中發(fā)揮重要作用，這與前人對番茄灰霉病的抗性機制的研究結果一致[54-59]。Gyetvai等[60]分析了馬鈴薯晚疫病（Phytophthora infestans）侵染寄主后的轉錄組表達譜，發(fā)現(xiàn)在寄主與病原菌親和互作過程中，一些基因出現(xiàn)了不同程度的上調(diào)或下調(diào)，較為明顯的是，病原相關基因上調(diào)表達，光合作用功能基因及CO2固定相關基因下調(diào)表達，這可能是病原菌侵入寄主后，抑制了寄主植物的生長，之前的研究結果也得出較為一致的結論[61]。單春會[62]運用轉錄組學技術對未侵染（0 h）和被青霉菌侵染（48 h和60 h）的哈密瓜果實進行了轉錄組分析，發(fā)現(xiàn)數(shù)個病原菌相關分子受體（PAMP）和抗病相關基因表達量均存在差異，較為深入地揭示了哈密瓜對青霉菌侵染的應答機制。

寄主植物受病原菌脅迫后，寄主細胞利用自身免疫受體（抗病蛋白）能夠識別病原菌效應因子，通過激活一些參與抗病相關途徑基因的表達，誘發(fā)寄主細胞自身抗病反應，進而實現(xiàn)對病原菌脅迫信號的響應、傳遞以及生物學防御。辣椒受黃單胞菌（Xanthomonas vesicatoria）侵染后，其自身可識別黃單胞菌的效應因子，并通過基因Bs4C調(diào)控黃單胞菌類轉錄激活因子效應蛋白AvrBs4的識別，從而對病原菌起到一個防御的效果[63]。Du[64]等通過RNA-seq技術研究了番茄抗感品系接種細菌性瘡痂病（Xanthomonas perforans）6 h和6d的差異表達基因變化，篩選到植物激素信號轉導、植物-病原互作、苯丙氨酸代謝等抗病相關途徑的基因，為充分了解番茄與瘡痂病菌互作機制提供數(shù)據(jù)支持。

瓜菜作物的抗病性由多基因協(xié)同作用，通過一系列基因的表達調(diào)控來實現(xiàn)。瓜菜作物-病原菌互作過程中啟動的差異表達基因體現(xiàn)了作物對病原菌效應子的識別、抗病信號級聯(lián)傳遞及抗病防御系統(tǒng)的激活等關鍵信息，通過獲得這些信息能夠有助于全面深入了解作物的抗病機制。

3 展 望

轉錄水平調(diào)控是生物體最主要的調(diào)控方式，對生物體細胞RNA的調(diào)控機制研究可以從基因組水平上進行。就目前來看，轉錄組測序技術正逐步取代傳統(tǒng)測序方法（如基因芯片技術）而成為研究基因的主要手段。現(xiàn)階段，轉錄組學技術因其低成本和方便性受到廣泛重視和應用。對生物脅迫和非生物脅迫處理后的瓜菜作物進行轉錄組測序，并結合生物信息學方法對轉錄本進行分析，包括基因功能的注釋、特異表達基因的篩選、抗逆代謝通路的研究以及一些新基因的發(fā)掘，便于弄清楚這些基因在瓜菜作物的生理和病理方面擔任的角色以及瓜菜作物對生物和非生物耐受性的分子機制，進一步為瓜菜作物功能基因組學的發(fā)展奠定基礎。

轉錄組學技術的發(fā)展為瓜菜作物轉錄組學研究提供了新的技術手段，使瓜菜作物轉錄組研究進入到一個快速發(fā)展的階段。目前在實際應用中轉錄組學研究面對的主要問題是如何高效的挖掘功能基因。一方面是因為基因的轉錄豐度與基因表達產(chǎn)物的活性沒有必然的聯(lián)系，用基因表達量的變化來反映生理及分子機制不具備十足的嚴謹性，給轉錄組學的應用帶來了挑戰(zhàn)。另一方面是轉錄本所反映的基因信息與基因表達信息的一致性問題。這些問題都困擾著轉錄組學的發(fā)展。因此，通過轉錄組學技術研究的瓜菜基因變化來解釋瓜菜抗逆機制應變得慎重。在研究瓜菜作物抗逆機制方面，有必要將轉錄組學和蛋白組學結合起來，以提高信息分析的準確性和真實性。隨著時代的發(fā)展，轉錄組學技術必將受到廣泛青睞，成為瓜菜作物研究領域比較成熟且比較常規(guī)的分子手段之一。瓜菜作物轉錄組學也會在抗逆、抗病機制研究、品種選育和種質(zhì)資源鑒定方面不斷前進。