尿HCMV-DNA檢測在新生兒疾病中的應用價值*

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·論著·

尿HCMV-DNA檢測在新生兒疾病中的應用價值*

鐘瑞芬1，黎四平1△，梁麗云1，程慶秋2，黃慧萍1，胡勉裕1，陸小梅2

(1.東莞市第八人民醫院檢驗科，廣東東莞 523325；2.東莞市兒科研究所，廣東東莞 523325)

摘要:目的通過比較不同疾病中的新生兒尿人巨細胞病毒DNA(HCMV-DNA)與血HCMV-IgM抗體的結果，評估尿HCMV-DNA在新生兒疾病中的應用價值。方法采集2013年1月至2014年12月在該院新生兒科住院的1 520例嬰幼兒的尿液進行HCMV-DNA熒光定量PCR檢測，同時采集其血液采用化學發光方法檢測HCMV-IgM抗體。結果1 520例嬰幼兒中尿HCMV-DNA陽性者有153例，陽性率為10.07%，血液標本中的HCMV-IgM陽性者僅有4例，陽性率為0.27%，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)。1 520例嬰幼兒的疾病構成中，診斷為肝炎綜合征的HCMV-DNA陽性率為82.6%，HCMV-IgM陽性率為3.85%。出現黃疸癥狀的HCMV-DNA陽性率為8.95%，肺部感染的HCMV-DNA陽性率4.62%。各項疾病或癥狀的HCMV-DNA陽性率比較差異有統計學意義(P<0.05)。結論在診斷嬰幼兒HCMV的感染時，尿HCMV-DNA檢測比HCMV-IgM抗體更為優越，尤其在肝炎綜合征、新生兒黃疸、肺部感染中的應用價值更高。

關鍵詞:巨細胞病毒；人巨細胞病毒脫氧核糖核酸；新生兒；尿

人巨細胞病毒(HCMV)屬于β皰疹病毒亞科，是導致新生兒產后感染的常見病原微生物。HCMV在自然人群中的感染較為常見，通常呈無癥狀的隱性感染[1]。當孕婦感染HCMV后，病毒可通過胎盤使胎兒感染，可導致流產、早產或者引起胎兒生長發育遲緩及畸形等，嚴重者還可導致死胎，嚴重威脅孕婦及胎兒的健康[2]。受到HCMV感染的胎兒在出生后，可能出現黃疸、肝炎、皮膚出血點及淤斑或肺炎等癥狀，還可能會出現耳聾、運動或智力障礙等[3]，如果能對感染的嬰兒進行早期的診斷將對嬰兒的治療有重要的指導意義。嬰兒出生后，還可通過吸食含有HCMV的乳汁而被傳染[4]。本研究采用熒光定量PCR方法檢測有黃疸或肝功能損害等癥狀的新生嬰兒以及早產兒尿液中的HCMV-DNA，再用化學發光方法檢測其血液中HCMV-IgM抗體，比較這兩種檢測方法的檢測陽性率，探討HCMV-DNA熒光定量檢測方法在HCMV感染引起不同的疾病或癥狀中的應用價值。

1資料與方法

1.1一般資料1 520例嬰幼兒來源于本院2013年1月至2014年12月在新生兒科住院的患兒，患兒入住新生兒科的原因有肝炎綜合征，黃疸癥狀，肺部感染癥狀，早產兒等，其中男826例，女694例，年齡從1～15 d，平均年齡為7 d。

1.2標本采集嬰幼兒尿標本的采集：清潔患兒外陰，用一次性潔凈尿袋留取患兒新鮮尿液2～5 mL，置于干凈的無菌管中，立即送檢。標本送達實驗室后置-20 ℃冰箱中保存，集中檢測HCMV-DNA。患兒血液標本的采集：消毒皮膚后，用一性采血管采集靜脈血2 mL，立即送檢。標本送達實驗后立即檢測或離心分離血清后置2～8 ℃冰箱中保存，第2天檢測。

1.3儀器與試劑HCMV-DNA采用中山大學達安基因股份有限公司提供的HCMV熒光PCR定量試劑，檢測儀器采用美國MX3000P實時熒光定量PCR儀對標本進行檢測。HCMV-IgM采用深圳新產業化學發光儀及配套試劑進行檢測。

1.4HCMV-DNA標本處理取晨尿1 mL于1.5 mL的無菌離心管中，12 000 r/min離心5 min，去上清，沉淀(沉淀如不明顯，再加尿液1 mL于以上1.5 mL的無菌離心管中，12 000 r/min離心5 min，去上清)加50 μL DNA提取液混勻，100 ℃恒溫處理10 min(誤差不超過1 min)，12 000 r/min離心5 min，取上清液(含病毒DNA)2 μL做PCR擴增。另外取出陰性質控品加50 μL DNA提取液打勻，100 ℃保溫10±1 min；12 000 r/min離心5 min，取上清液2 μL備用。

1.5PCR擴增從試劑盒中取出HCMV PCR反應管若干,分別加入處理后的上清液各2 μL，8 000 r/min離心數秒。93 ℃：2 min；93 ℃：45 s，55 ℃：60 s，10個循環；93 ℃：30 s；55 ℃：45 s，30個循環。

1.6結果判斷陰性質控品：增長的曲線不呈S型曲線或Ct值等于30；陽性質控品：增長的曲線呈S型曲線，且強陽性質控品檢測值允許范圍1.0×105～2.0×106copies/mL，弱陽性質控品檢測值允許范圍1.0×103～2.0×104copies/mL；陽性定量質控品：增長的曲線呈S型曲線Ct值小于27，且0.97≤|r|≤1。以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，全部實驗應重新進行。若定量數值在線性范圍內：5.0×102≤C≤5.0×108，則樣品中的HCMV-DNA含量=C copies/mL;如果定量數值在線性范圍外，有兩種情況：(1)C>5.0×108，則樣品中的HCMV-DNA的水平大于5.0×108copies/mL。如果需要精確定量結果，可將樣品稀釋至線性范圍內再檢測。(2)C<5.0×102，則樣品中的HCMV-DNA水平小于5.0×102copies/mL。在本研究中，為方便統計，把樣品中的HCMV-DNA水平大于或等于5.0×102copies/mL判斷為陽性，把樣品中的HCMV-DNA的水平小于5.0×102copies/mL判斷為陰性。

1.7HCMV-IgM標本處理及結果判斷血液標本及時分離血清，避免溶血，盡快采用深圳新產業化學發光儀進行檢測，若樣品的檢測結果小于2.0 AU/mL的為陰性，若樣品的檢測結果大于或等于4.2 AU/mL的為陽性。

1.8統計學處理使用SPSS17.0統計軟件對所有數據進行分析，采用χ2檢驗分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1兩種HCMV方法的結果1 520例嬰幼兒的尿液樣本中，HCMV-DNA陽性者有153例，陽性率為10.07%，HCMV-DNA陽性者其水平介于1.037×103～4.966×106copies/mL。1 520例嬰幼兒血液標本中的HCMV-IgM陽性者有4例，陽性率為0.27%，HCMV-IgM陽性者其抗體水平介于5.6～11.2 AU/mL，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)，表明HCMV-DNA的陽性檢出率較HCMV-IgM的陽性檢出率要高。見表1。

2.2HCMV在不同疾病中的陽性率1 520例嬰幼兒的疾病或癥狀構成中，診斷為肝炎綜合征的HCMV-DNA陽性率最高，HCMV-IgM陽性率也最高，出現黃疸癥狀的、肺部感染癥狀HCMV-DNA陽性率也較高。各項疾病或癥狀的HCMV-DNA陽性率比較差異有統計學意義(P<0.05)。表明在新生兒肝炎綜合征、黃疸、肺部感染時，應注意排除HCMV的感染。見表2。

表1　　1 520例嬰幼兒的兩種HCMV方法的結果比較(n)

表2　　1 520例嬰幼兒的疾病或癥狀構成比及HCMV在

2.3HCMV感染的性別分布1 520例嬰幼兒中的HCMV感染的性別分布中，男性嬰幼兒尿HCMV-DNA陽性者有85例，陽性率為10.29%，血液HCMV-IgM陽性者有2例，陽性率為0.24%。女性嬰幼兒尿HCMV-DNA陽性者有68例，陽性率為9.80%，血液HCMV-IgM陽性者有2例，陽性率為0.29%,兩者比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3　　1 520例嬰幼兒中的HCMV感染的性別分布[n(%)]

3討論

HCMV在人群中感染較為普遍，多表現為隱性感染，當個體免疫力低下時，病毒可表現較為活躍而出現癥狀，成為顯性感染[1,5]。嬰幼兒免疫系統發育尚不完全，因此，極易引起HCMV感染[6]，并且嬰幼兒產生IgM、IgG抗體的能力均較弱，血清中HCMV-IgM 抗體不強，檢出率較低[7]。此外，HCMV抗體的產生需一段時間，當患者感染病原體約2周后IgM抗體才達到被檢出的水平，說明IgM檢查不能作為早期診斷的良好指標。本研究中，HCMV-IgM陽性者其抗體水平介于5.6～11.2 AU/mL，抗體水平均不高。最后，從檢測方法學上，熒光定量PCR的準確性和快速性優勢，能更早檢測到感染的病毒，甚至比出現臨床癥狀的時間提前3～10 d[8]。表1的結果顯示，1 520例嬰幼兒中HCMV-DNA的陽性率為10.07%，遠遠地高于血液標本中的HCMV-IgM的陽性率(僅為0.27%)。表明在出生15 d內的嬰幼兒中，HCMV-DNA的陽性檢出率較HCMV-IgM的陽性檢出率要高，HCMV-DNA在診斷嬰幼兒HCMV感染中的價值較高。

HCMV可以侵犯機體的多種器官，肝臟是重要的靶器官，在嬰幼兒感染中可以造成黃疸、肝功能受損、肝脾腫大、肺炎、瘀斑等，還可表現為局限的感染，在孕婦感染中可導致流產、早產或者引起胎兒生長發育遲緩等[3,9]。本研究表2的結果顯示，在1 520例嬰幼兒中，診斷為肝炎綜合征的患兒中，HCMV-DNA陽性率最高，HCMV-IgM陽性率也最高，出現黃疸癥狀的、肺部感染癥狀HCMV-DNA陽性率也較高，此時HCMV-IgM未見陽性。表明HCMV更容易侵犯肝臟和肺臟。表3的結果表明HCMV在嬰幼兒感染中，與嬰幼兒的性別無關。

綜上所述，結合本研究的結果，由于HCMV具有嗜上皮細胞的特性，容易感染腎臟上皮細胞，在尿標本中容易檢出HCMV-DNA[10]，加上尿液標本取材方便、對新生兒無損傷性，更為家長所接受，因此，筆者認為進行尿HCMV-DNA檢測比進行HCMV-IgM抗體檢測來判斷是否感染HCMV更具有快速、準確、可靠、便捷的優勢。當新生兒出現肝炎綜合征、黃疸癥狀、肺部感染癥狀等其他癥狀時，尤其是當出現肝功能受損排除乙肝、丙肝、甲肝、丁肝等肝炎病毒，以及肺部感染排除一般微生物、支衣原體、呼吸道病毒后，也應當提示臨床進行尿HCMV-DNA檢驗以排除巨細胞感染的可能性，而不能只依靠HCMV-IgM抗體的檢測結果來判斷。至于是否在孕期也進行孕婦尿HCMV-DNA檢測或者增加孕期HCMV-IgM檢測頻率來預測新生兒巨細胞感染，以及對于新生兒HCMV-IgM抗體陰性者經過2周至1個月的時間，其HCMV-IgM的陽性檢出率是否會增加來輔助診斷新生兒巨細胞感染，還有待進一步調查研究。

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Application value of the detection of HCMV-DNA in urine in the diseases of neonatus*

ZhongRuifen1,LiSiping1△,LiangLiyun1,ChenQingqiu2,HuangHuiping1,HuMianyu1,LuXiaomei2

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,NO.8HospitalofDongguanCity,Dongguan,Guangdong523325，China;2.DongguanInstituteofPediatric,Dongguan,Guangdong523325,China)

Abstract:ObjectiveTo evaluate the value of detecting HCMV-DNA in urine in the diseases of newborn babies,by comparing the result between HCMV-DNA in urine and HCMV-IgM antibody in blood in different diseases of the newborn babies.MethodsThe urine and blood samples were collected from 1 520 infants who were in hospital of the neonate department from January 2013 to December 2014.The HCMV-DNA in urine was examined by fluorescence quantitative polymerase chain reaction(FQ-PCR).And HCMV-IgM antibody in blood was examined by the method of chemiluminescence(ECL).ResultsIn the 1 520 cases，153 had detectable HCMV-DNA in their urine samples with a positive rate 10.07%,while only 4 cases were positive of the HCMV-IgM antibody in blood with a positive rate 0.27%.The two groups was statistically significant difference (P<0.05).In the infant diseases of 1 520 cases,the positive rate of HCMV-DNA in urine was 82.6% of the hepatitis syndrome while the positive rate of HCMV-IgM antibody in blood was 3.85%.The positive rate of HCMV-DNA in urine was 8.95% in the jaundice symptoms,while the positive rate HCMV-DNA in urine was 4.62% in the pulmonary infection.Each group of disease was statistically significant difference in the positive rate of HCMV-DNA (P<0.05).ConclusionThe detection of HCMV-DNA in urine is more beneficial to the diagnosis of HCMV infection of infants than the detection of HCMV-IgM antibody in blood,especially in hepatitis syndrome,neonatal jaundice and pulmonary infection.

Key words:cytomegalovirus；human cytomegalovirus DNA；neonatus；urine

(收稿日期：2015-10-18)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.04.018

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)04-0475-03

基金項目：東莞市科技計劃醫療衛生類科研重點資助項目(2013108101016)。

作者簡介：鐘瑞芬，女，主管技師，主要從事臨床檢驗研究。△通訊作者,E-mail:lsp020@163.com。