葫蘆科蔬菜單倍體育種技術研究進展
——花粉輻射和離體胚挽救技術

黃金華，董彥琪，劉喜存，王文英,王玲艷，朱紅彩

（河南省新鄉市農業科學院 河南新鄉 453000）

輻射花粉授粉和離體胚挽救技術是用射線輻射瓜類即將開花或正開花的雄花花粉，然后給去雄的雌花授粉影響其受精進而誘導其產生單倍體胚，再通過離體胚挽救獲得單倍體植株[1-6]。輻射花粉授粉和離體胚挽救技術是獲得葫蘆科作物單倍體（Haploid）和雙單倍體（Double haploid，DH）的主要途徑之一。利用該技術可快速獲得純系、縮短育種周期、加速育種進程。本文側重綜述了該技術的一些重要影響因素，如基因型、輻射劑量、輻射劑量率、植株生長環境、花粉發育階段、離體胚挽救時間、胚發育時期、染色體加倍、倍性鑒定和植株再生技術等，為該技術的開展和應用提供可行的理論依據。

1 基因型

基因型是影響輻射花粉授粉和離體胚挽救的關鍵因素之一。Lofti[7]和裴曉利等[8]研究表明，不同黃瓜基因型輻射花粉誘導單倍體產率有差異。雷春等[9]進一步研究發現不同基因型花粉授粉要比同一基因型花粉授粉誘導的單倍體產率高。當黃瓜母本為‘JL4’、父本為‘CC3（200）’和‘JL4（200）’時，坐果率分別50%和12.5%，并且只有以‘CC3（200）’為父本時才有單倍體產生，表現出一定的父本基因型差異；當父本均為‘Y2A（300）’，母本分別為‘SL4’和‘Y2A’時，坐果率分別為37.5%和62.5%，單倍體產率（單倍體數/胚培養種子數）分別約為1.1%和0.4%，表現出一定的母本基因型差異。謝淼等[10]研究認為，黃瓜基因型對植株再生率及單倍體再生率均有影響。而Caglar等[11]研究表明，黃瓜27種基因型對單倍體的誘導率沒有很大差別，每個果實中獲得的單倍體胚均約為3.8個，每個果實中獲得的單倍體植株數均約為1.1個；Faris等[12]試驗了8種黃瓜基因型，進一步證明同一劑量下的單倍體發生率同黃瓜基因型無關。

此外，Sestili等[13]研究表明不同的甜瓜正反交組合對單倍體誘導率的影響差異顯著。張永兵等[14]研究表明，甜瓜母本基因型對坐果和單倍體胚的形成都有一定的影響。

2 輻射劑量

常用的輻射源有放射性元素（35P，32S），離子束（X和γ射線）和非離子束（UV）。Faris等[12]認為60Co-γ射線是誘導單倍體的有效輻射源。

確定適宜的輻射劑量是誘導雌核發育單倍體成敗的關鍵，實踐中大多以臨界劑量或半致死劑量作為適宜劑量的標準。花粉管的生長與輻射劑量有顯著的相關性（R=0.97）[15]。輻射劑量同植物的倍性及花粉粒大小有關，倍性越高，花粉粒越小，越耐輻射[16]。西葫蘆上推薦劑量為25～50 Gy[4]；黃瓜和西瓜常用的推薦劑量為 200～300 Gy[3，17]；甜瓜上推薦劑量為 500～2 500 Gy[1，15]。

也有一些學者用X射線輻射花粉的報道，如Yashiro等[18]利用 X 射線（67.08 C·kg-1）輻射花粉，在5 個甜瓜基因型‘Earl＇s red’‘Carol’‘Quincy’‘Rupia red’和‘View red’上單倍體胚的誘導率分別為0.16%、0.03%、0.03%、0.13%和0.17%；查丁石[19]利用軟X射線以650 Gy的總輻射劑量照射獲得了甜瓜單倍體植株。

3 輻射劑量率

單倍體誘導頻率還受輻射劑量率的影響。Deunff等[20]研究發現高劑量會使黃瓜花粉管生長減慢，但是在授粉6 d之后，2種不同劑量率照射下的花粉管都已到達胚囊。許利彩等[21]研究表明，輻射劑量率對西葫蘆胚的誘導率、植株再生率及植株成活率均影響極顯著。輻射劑量率為45.19 Gy·min-1時獲得的不飽滿種子或不同形態胚的數量最多，為61個，植株再生率和植株成活率也最高，分別是91.80%和49.18%，與其他2個處理差異極顯著；25 Gy·min-1時獲得的不飽滿種子或不同胚狀體數量次多，為56個；而5 Gy·min-1最低，僅為26個，植株再生率和植株成活率也最低，分別是76.92%和26.92%。而 Cunny 等[15]研究表明，18 Gy·min-1和79 Gy·min-1（總劑量為500～3 600 Gy）對甜瓜花粉萌發率和活力沒有影響。

4 生長環境

環境因子對單倍體誘導率同樣有重要影響，適宜的溫度和濕度下單倍體發生率較高。6—9月甜瓜單倍體發生率[22]較高，秋季單倍體誘導率相對較低[15]。黃瓜也是在氣溫高的6—9月（地中海海洋性氣候）可得到較高單倍體發生率[17]。

5 花粉發育階段

花藥、花序、花芽及整朵花都可以進行輻射處理，通常用開花前1 d的雄花進行輻射處理，次日給母株授粉。Yanmaz等[23]研究表明，輻射劑量為350 Gy的黃瓜花粉活力最高，但花粉活力喪失最快，120 h之后花粉活力為0，最終得到0株單倍體。所以，盡量選用開花當天的花粉立即輻射授粉，否則單倍體誘導率會大大降低；且每朵雌花需用3～4朵經射線處理的雄花授粉，增加花粉管到達胚囊的數量，有效的促進雌核發育[1，24]。開放當天和開放前1 d的黃瓜雄花經過不同劑量輻射后授粉，對坐果率影響不大，但是單倍體胚產率以輻射開放前1 d雄花授粉效果更好[25]。

6 離體胚挽救

由于輻射花粉誘導雌核發育過程中敗育胚的比例相當高，所以常利用離體胚挽救技術提高誘導率。

Sauton等[1]發現，甜瓜幼胚在 MS+0.2 mg·L-16-BA+0.15 mg·L-1活性炭的培養基上進行胚搶救更容易發育成胚狀體。孫玉宏等[26]在甜瓜離體胚挽救試驗中也得到相同結論，同時研究表明，輻射授粉后12 d左右的甜瓜果實中的可搶救的胚的數量較高。Custer等[27]研究發現，幼胚發育到心形胚階段在適宜的培養基（E20A培養基含0.01 mg·L-1IAA）上進行胚珠離體挽救，可以提高單倍體胚的誘導率。Kurtar等[4]在西葫蘆離體培養中發現球形胚、箭狀胚和桿狀胚可以發育形成單倍體，僅有53.8%魚雷形胚和23.1%的心形胚發育成單倍體，其余的魚雷形胚、心形胚及子葉形胚及畸形胚則發育成雙單倍體。Sari等[3]研究表明，西瓜離體胚挽救的最佳時間為輻射授粉后3～4周，即多數胚為心形胚時單倍體誘導率高。裴曉利等[8]研究表明，黃瓜適宜的離體胚挽救時期也為授粉后3～4周，此時單倍體胚誘導率較高，且單倍體再生植株生長發育正常。

7 倍性鑒定與植株再生

7.1 染色體加倍

秋水仙素（秋水仙堿）是染色體加倍的常用試劑，Sari等[28]用質量分數0.5%和1.0%秋水仙素處理西瓜單倍體植株 1、2、4、6 h，結果表明 0.5%秋水仙素處理4 h或1.0%秋水仙素處理2 h均可獲得二倍體植株。

7.2 倍性鑒定

瓜類二倍體植株與單倍體、三倍體、四倍體在形態上有比較明顯的差別[29]。主要表現在子葉、真葉的形狀和顏色，花的形狀和顏色，果實形狀以及種子的形態，這些形態差異是從外觀上用目測法鑒別瓜類多倍體的較為可靠的指標。Sari等[30]研究比較了2個西瓜品種二倍體及其單倍體植株的田間表現，發現單倍體植株的葉面積、莖長度、莖粗度顯著低于二倍體，單倍體植株的雌、雄花也明顯小于二倍體，單倍體雄花中沒有花粉粒，而二倍體則有。

Sari等[30]研究表明，單倍體西瓜植株的氣孔長度、直徑和保衛細胞中葉綠體的數目分別為17～18、10～12 μm 和 6～7 個，而二倍體約為 23～24、18 μm和11～12個。根據保衛細胞的大小、單位面積上的氣孔數及保衛細胞中葉綠體的數目，可以有效區分倍性。

流式細胞測定法采用掃描細胞光度儀（也叫倍性分析儀）迅速測定葉片單個細胞核內DNA含量，根據DNA含量的曲線圖推斷細胞的倍性。特別是在離體培養過程中，試管中的芽或小植株很小和很嫩時，僅用l cm2的樣品就能鑒定出材料倍性[28，31]。

7.3 植株再生

查丁石[19]將萌發的12個甜瓜幼胚移植到MS+20.0 mg·L-1葡萄糖+3.0 mg·L-1瓊脂固體培養基上培養，獲得4株單倍體植株幼苗。單倍體植株通過莖節切段進行增殖培養，10周后獲得54株生根再生植株。張永兵等[14]研究表明，甜瓜單倍體幼苗的頂芽或腋芽分化增殖最適培養基為MS+0.5 mg·L-16-BA，生根最佳培養基為1/2 MS+0.5 mg·L-1IBA。

8 問題與展望

利用花粉輻射和離體胚挽救技術獲得瓜類單倍體植株是一個較為成功的途徑，眾多國內外學者研究了一些影響因素，如基因型、輻射劑量、輻射劑量率、植株生長環境、花粉發育階段、離體胚挽救時間、胚發育時期、染色體加倍、倍性鑒定和植株再生技術等，并取得了一些重要進展，如親本基因型和輻射劑量是決定花粉輻射技術的關鍵因素；不同作物的適宜輻射劑量有差異，因此，選擇合適的基因型和適宜的輻射劑量是誘導單倍體胚成敗的關鍵。植株生長環境和花粉發育階段對單倍體誘導率同樣有重要影響，6—9月單倍體誘導率高于秋季；開放當天和開放前1 d的雄花輻射授粉較好。輻射劑量率也極顯著影響單倍體誘導率，如用輻射劑量率為45.19 Gy·min-1處理西葫蘆時獲得的不飽滿種子或不同形態胚的數量最多，為61個；植株再生率和植株成活率也最高，分別是91.80%和49.18%。

采用離體胚挽救技術是因為輻射花粉誘導雌核發育過程中敗育胚比例高，所以通過離體培養技術將幼胚轉移到培養基上促進進一步發育，從而提高單倍體胚誘導率。因此，適宜的胚挽救時間和幼胚發育時期是離體胚挽救技術成敗的關鍵，胚挽救搶救時間因作物種類而異，但幼胚發育適期是心形胚和子葉形胚。

常用的加倍試劑是秋水仙素，一般濃度以0.5%～1.0%為宜。常用的倍性鑒定方法有：形態鑒別法、氣孔保衛細胞葉綠體數目鑒定法和流式細胞測定法等，可根據自身實驗室建設條件選擇應用。常用瓜類作物單倍體植株頂芽或腋芽分化增殖培養來建立植株再生體系。

利用花粉輻射和離體胚挽救技術已在黃瓜、西瓜、甜瓜、西葫蘆、南瓜、冬瓜等多種瓜類作物上獲得了單倍體植株。但目前輻射花粉誘導技術機制還不完全清楚，一種觀點是雙核花粉被射線照射時，生殖核尚未有絲分裂，受照射損傷生活力喪失，而此時如果營養核仍然有機能時，花粉仍能萌發，花粉管也能在花柱上生長，但因生殖核已無生活力，故只能刺激卵細胞分裂發育，而不能起到受精的作用；另一種觀點是雙核花粉被射線照射時，生殖核染色體異常分裂，造成2個精核之間染色體的不均衡分配，但是生活力并未喪失，仍可與卵細胞或者其他單倍體細胞結合，但是由于染色體的數目異常，不能與卵細胞或者其他單倍體細胞配對，導致無法正常受精，卻刺激了卵細胞或者其他單倍體細胞分裂產生單倍體。目前國內外學者僅對胚挽救的時間、幼胚發育時期進行了研究，對于影響離體胚挽救技術的其他因素如培養基、激素、溫度、活性炭、培養方式等有待于進一步深入研究，以提高單倍體胚誘導率。