CD8+ T細胞對胃腺癌細胞雌激素受體表達的影響

劉冠蘭?付濟寧?張龍?劉英

【摘要】 目的 觀察CD8+ T細胞對胃癌細胞增殖及其表面受體雌激素受體α（ERα）的影響。方法 應用健康成人外周血分離得到的CD8+ T細胞與胃腺癌細胞系SGC-7901混合培養?；旌吓囵B96 h后用經流式細胞儀檢查細胞周期；免疫熒光法檢測分析共培養48 h后SGC-7901細胞的凋亡情況及雌激素受體表達情況。結果 經流式細胞儀檢查， 混合培養96 h后CD8+ T細胞與SGC-7901細胞粘附， 大部分SGC-7901細胞滯留在G1期；混合培養組與對照組相比， SGC-7901細胞膜上表達ERα數明顯降低。結論 CD8+ T細胞抑制胃癌細胞增殖的同時降低ERα的表達， 為深入研究胃癌的生物治療及靶向治療奠定了基礎。

【關鍵詞】 CD8+ T細胞；胃癌；SGC-7901細胞；雌激素受體

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.08.019

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一， 全球超過 40%的胃癌病例發生在中國， 死亡率在惡性腫瘤中占第二位[1]。目前對胃癌的治療主要是采用以手術為主的綜合治療， 但總體效果不令人滿意。由于腫瘤患者機體免疫功能低下或缺陷與惡性腫瘤發生發展的各階段關系密切， 而病情發展又進一步加重免疫低下狀態， 惡性腫瘤的免疫治療已成為目前的研究熱點。

CD8+ T 細胞又稱作 T 抑制細胞或細胞毒 T 細胞， 可以特異性識別細胞表面的MHCI 類抗原從而特異性殺死腫瘤細胞， 在抗腫瘤免疫中起到了重要作用。但其作用的相關機制還不清楚。在本研究中， 應用健康成人外周血分離得到的CD8+ T細胞與胃腺癌細胞系SGC-7901共培養， 通過免疫熒光法檢測分析共培養48 h后SGC-7901細胞的凋亡情況及雌激素受體表達水平， 以期為臨床篩選個體化治療方案提供理論依據， 前瞻性指導腫瘤患者的免疫治療， 具體報告如下。

1 材料與方法

1. 1 外周血單個核細胞分離 將10 ml全血（健康志愿者）轉入50 ml離心管中， 加入10 ml PBS溶液稀釋， 輕輕混勻；取兩支15 ml離心管， 先加入5 ml Ficoll溶液。然后將稀釋的血液輕輕加到兩支離心管的Ficoll上層， 每只離心管各10 ml稀釋血液；2000 r/min， 30 min；用1 ml槍頭插到白色云五層， 吸取單個核細胞（PBMC）置另一干凈的15 ml離心管中。加入PBS至10～15 ml， 1500 r/min， 10 min離心后去掉上清， 再加入培養基（RPMI 1640+10% FBS）進行相同操作的清洗2次。

1. 2 外周血單個核細胞培養 分離得到的PBMC用RPMI 1640+10% FBS+異戊烯焦磷酸（IPP） 1 μg/ml+白細胞介素-2 （IL-2） 20萬U/ml培養， 2～3 d換培養基一次， 第五代（P5）用于實驗。

1. 3 流式細胞儀檢查T細胞表型 取100 μl細胞與PBS+2%胎牛血清（FBS）混懸液， 分別加入10 μl CD3、CD4、CD8抗體（貝克曼公司）， 震蕩器充分混勻后， 室溫避光放置10 min；裂解紅細胞：混合液放置10 min后， 加入紅細胞裂解液500 μl （貝克曼公司）， 均勻混合后， 室溫避光放置10 min；離心（2000 r/min， 5 min）后倒掉上清， 上機檢測：加入500 μl的緩沖液， 混勻后上流式細胞儀器檢測（儀器為貝克曼公司FC500型流式細胞儀）。

1. 4 CD8+ T分離 取5個小平皿（60 mm）， 加入10%多聚賴氨酸0.5 ml， 37℃5%CO2培養箱中過夜。4℃加入CD8抗體2 μl 4 h。加入上述單個核細胞混懸液過夜。次晨， 去上清。0.25%胰酶消化貼壁的細胞。細胞計數板計數后， 取10000個細胞進行流式細胞儀檢測， 方法同上。

1. 5 CD8+ T與SGC-7901細胞共培養 SGC-7901細胞計數后， 平均鋪到5個小平皿（60 mm）中， 過夜培養讓細胞貼壁， 融合率到70%～80%。取兩小平皿用胰酶消化， 計數后分別按CD8+ T與SGC-7901細胞1∶10加入成為貼壁腫瘤細胞+T細胞培養組；單獨SGC-7901細胞和單獨T細胞為對照組。SGC-7901細胞與CD8+ T細胞共培養48 h后顯微鏡觀察細胞增殖情況；吸去舊培養基按相同比例換含新CD8+ T細胞的新鮮培養基繼續培養48 h。培養96 h后， 吸去培養基， 進行細胞周期檢測和免疫熒光檢查。

1. 6 細胞周期檢測 CD8+ T與SGC-7901細胞混合培養在96 h后， 0.25%胰酶消化。消化后的細胞經PBS 清洗2次， 加入FITC標記annexin Ⅴ和PI溶液， 輕輕混均。室溫避光放置15 min， 用流式細胞儀檢查DNA含量。所得結果用細胞周期分析軟件（Cell FIT， Becton Dickinson）分析。

1. 7 免疫熒光檢查 將CD8+ T用DAPI染核后與SGC-7901細胞共接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養皿中， 96 h后取出蓋玻片， PBS洗2次。4%多聚甲醛4℃固定細胞過夜。3%小牛血清白蛋白（BSA）封閉30 min， 加入ERα抗體（PE標記） 4℃過夜。PBST漂洗3次， 沖洗5 min/次。加入二抗室溫避光孵育1 h， PBST漂洗3次， 沖洗5 min/次后， 再用蒸餾水漂洗1次。滴加封片劑一滴， 封片， 熒光顯微鏡檢查。

2 結果

2. 1 CD8+ T細胞檢測 經流式細胞儀檢查， 培養得到的CD8+ T陽性率為91.3%。

2. 2 混合培養96 h后細胞周期檢查 經流式細胞儀檢查， 混合培養96 h后大部分細胞滯留在G1期。

2. 3 混合培養96 h后SGC-7901細胞ERα抗體表達情況 CD8+ T細胞用DAPI將細胞核染成藍色， ERα在熒光顯微鏡下呈綠色， 在SGC-7901細胞膜上表達。混合培養96 h后， 可見CD8+ T細胞與SGC-7901細胞粘附?；旌吓囵B組與對照組相比， SGC-7901細胞膜上表達ERα數明顯降低。見圖1。

圖1 混合培養96 h后SGC-7901細胞ERα抗體表達情況

注：A圖， CD8+ T組96 h貼壁增殖情況；B圖， SGC-7901細胞96 h ERα抗體表達；C圖， 混合培養96 h后SGC-7901細胞ERα抗體表達情況

3 討論

現代腫瘤免疫生物學的飛躍發展， 使惡性腫瘤的免疫治療成為目前的研究熱點， 它將成為繼手術、化療、放療之后的第四種腫瘤治療模式。本研究通過CD8+ T細胞與SGC-7901細胞混合培養， 證實CD8+ T細胞對SGC-7901細胞的增殖具有明顯抑制作用；并降低SGC-7901細胞的特異性受體ERα的表達。因此， 本研究結果為腫瘤的生物靶向治療提供了理論依據。

雌激素調節生長、分化和功能多樣化的目標組織內外的生殖系統[2]。雌激素的生物功能大部分是對通過靶細胞的雌激素受體ERα和ERβ， 調節相關基因的表達。盡管胃不是稱為性激素的直接目標器官， 流行病學和動物研究表明胃癌可能對雌激素敏感。胃癌的男女發病比率約為2∶1。因此， 有研究認為雌激素可能對胃癌有保護作用。ERα和ERβ均在胃癌表達[3， 4]。ERα在胃癌發生、發展中的作用研究較多， 大多認為胃癌中ERα的表達較ERβ多， 表達范圍廣泛， 且與胃癌的分化及轉移相關[5， 6]。部分ER陽性的胃癌患者根治切除后對內分泌治療反應良好均說明胃癌的ER與乳腺癌中的ER 一樣具備代謝活性。因此， 對雌激素及其受體的相關研究可能影響胃癌的進展和治療。迄今為止， 有關胃癌ER與預后的關系尚未清楚。

CD8+ T 細胞又稱作T抑制細胞或細胞毒T細胞， 通過穿孔素/顆粒酶途徑和Fas/FasL途徑能夠高效、特異性地殺傷靶細胞， 而不損害正常組織。細胞毒性CD8 T細胞高表達的胃癌通常預后好于低表達的胃癌患者， 表明過繼免疫在腫瘤免疫監視系統的關鍵作用[7]。本研究結果還顯示 CD8+ T細胞抑制胃癌細胞增殖。CD8+ T具有特異性直接殺傷腫瘤細胞的作用， 分化越差的腫瘤往往惡性程度越高， 越容易產生免疫耐受， 導致CD8+ T細胞表達降低。本研究觀察CD8+ T細胞對胃腺癌細胞ERα的表達， 結果顯示， CD8+ T可以降低胃腺癌細胞ERα的表達。

綜上所述， CD8+ T細胞抑制胃癌細胞增殖的同時降低ERα的表達， 為深入研究胃癌細胞的生物治療及靶向治療奠定了基礎。

參考文獻

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[收稿日期：2015-11-09]