食用油中反式脂肪酸的氣相色譜檢測法研究

孫慧珍，曲賽男，裘立群，宋少芳山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山東泰安271018

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食用油中反式脂肪酸的氣相色譜檢測法研究

孫慧珍，曲賽男，裘立群*，宋少芳*
山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山東泰安271018

摘要：食用油中反式脂肪酸的檢測是控制其含量的先決條件。食用油樣品經(jīng)適當(dāng)萃取劑處理后，利用正交試驗(yàn)法確立兩步甲酯化條件，其中反式脂肪酸可順利地轉(zhuǎn)化為反式脂肪酸甲酯。兩步甲酯化條件為：經(jīng)0.4 mol·L-1氫氧化鈉-甲醇中40℃下酯化30 min后，0.5 mol·L-1硫酸-甲醇中70℃下酯化50 min。在極性DB-23毛細(xì)管柱上利用三階程序升溫氣相色譜法可分離、檢測轉(zhuǎn)化后的反式脂肪酸甲酯。三階升溫程序?yàn)椋合仍?40℃時保持1 min，然后以10℃·min-1的速度升高至180℃，接著以2℃·min-1的速度升高至220℃，在220℃時保持20 min后再以5℃?min-1的速度升高至230℃，最后在230℃時保持16 min。本氣相色譜法分析法能檢測食用油中常見的8種反式脂肪酸，其線性相關(guān)性、檢出限和回收率均能滿足定性和定量分析的要求。

關(guān)鍵詞：食用油；反式脂肪酸（FTA）；氣相色譜法；兩步甲酯化

反式脂肪酸（TFA）是一類含有反式構(gòu)型雙鍵的不飽和脂肪酸，是油脂和含油脂食物中常見的成分[1-3]。研究表明，反式脂肪酸對人體健康有一系列不利影響，過多食用會引起心血管疾病、糖尿病等。歐美各國都對食品中反式脂肪酸的含量作了限定。許多國家對反式脂肪酸進(jìn)行了深入的研究，并采用各種方法檢測食品中的反式脂肪酸含量。氣相色譜分析法（GC）由于檢測限低、靈敏度高成為目前檢測脂肪酸的最為有效的方法之一。借鑒國標(biāo)中食用油脂肪酸的氣相色譜分析方法，反式脂肪酸的氣相色譜分析的基本步驟也是先采用適合的萃取劑將食用油中的反式脂肪酸甘油三酯釋放成游離脂肪酸，再進(jìn)行衍生甲酯化處理后，再用GC進(jìn)行檢測[4]。因此，確立高效、簡便的反式脂肪酸前處理過程和氣相色譜分離條件是氣相色譜法分析反式脂肪酸的兩大重要任務(wù)。本實(shí)驗(yàn)首先通過設(shè)計正交實(shí)驗(yàn)對多種前處理方法包括萃取劑、酯化劑、酯化時間及溫度等進(jìn)行對比、優(yōu)化，然后對色譜條件進(jìn)行了摸索和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，最終確定了簡便而有效的食用油中反式脂肪酸檢測方法。該方法能檢測食用油中常見的8種反式脂肪酸，其線性相關(guān)性、檢出限和回收率均能滿足定性和定量分析的要求。

1　材料與方法

1.1儀器與材料

島津GC-2010氣相色譜分析儀，配備氫火焰離子化檢測器（FID）及GCsolution2.3版工作站（日本株式會社島津制作所）；CP-Sil 88毛細(xì)管色譜柱（100 m×0.25 mm ID，0.2 μm）、DB-23毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm i.d.，0.25 μm）（美國Agilent公司）；QL-300氫氣發(fā)生器（山東賽克塞斯氫能源有限公司）；QL型純凈空氣泵（山東賽克塞斯氫能源有限公司）；TGL-20M臺式高速冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

反式脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品：反式肉豆蔻酸甲酯（C14:1n9t）、反式棕櫚油酸甲酯（C16:1n9t）、反式巖芹酸甲酯（C18:1n6t）、反式油酸甲酯（C18:1n9t）、反式異油酸甲酯（C18:1n11t）、反式亞油酸甲酯（C18:2n9t，12t）、反式二十碳烯酸甲酯（C20:1n11t）、反式二十二碳烯酸甲酯（C22:1n13t）（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；甲醇（色譜純，天津永大試劑公司）；氫氧化鈉、硫酸等分別為國產(chǎn)分析純；市售食用油。

1.2色譜檢測條件

載氣：高純氮?dú)?，流?.5 m·min-1；進(jìn)樣量：1.0 μL，分流比10:1，進(jìn)樣口溫度：250℃；程序升溫控制柱溫；FID檢測器：260℃，氫氣流量40 mL·min-1，空氣流量400 mL·min-1，尾吹流量30 mL·min-1。

1.3樣品前處理

稱取約0.05 g樣品于20 mL具塞試管中，首先加入2 mL萃取劑，振蕩30 min；然后加入2 mL酯化劑，充入高純氮?dú)饷芊猓谠O(shè)定溫度水浴中恒溫振搖反應(yīng)一定時間。反應(yīng)完成后水浴冷卻，加入10 mL飽和食鹽水進(jìn)行淋洗，振蕩后靜置分層，收集上層有機(jī)相，再加入2 mL正己烷，重復(fù)萃取兩次；后加入適量無水硫酸鈉，離心，取1 mL上清液進(jìn)行GC分析。處理液于-20℃下保存[5，6]。

樣品前處理時，其中反式脂肪酸甲酯化反應(yīng)越完全，反應(yīng)產(chǎn)率就越高，GC分析結(jié)果就會越精確。故可用單一樣品GC色譜圖中相應(yīng)反式脂肪酸甲酯的峰面積的大小表示甲酯化反應(yīng)產(chǎn)率高低。

2　結(jié)果與討論

2.1氣相色譜條件的確定

2.1.1色譜柱的選擇反式脂肪酸與順式脂肪酸互為異構(gòu)體，弱極性的色譜柱很難將兩者分開，極性毛細(xì)管柱DB-23和CP-Sil 88是氣相色譜法分析食用油脂肪酸常用的色譜柱[7]。DB-23（30 m×0.32 mm ID，0.25 μm）和CP-Sil 88（100 m×0.25 mm ID，0.2 μm）毛細(xì)管柱對8種反式脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品的GC分離色譜圖見圖1。

圖1　8種反式脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品分別在DB-23細(xì)管柱（a）和CP-Sil 88毛細(xì)管柱（b）上的譜圖Fig.1　The chromatogramsofeightkindsoftransfattyacid methyl estersbyDB-23capillary column（a）and CP-Sil88capillary column（b）Peaks: 1-C14:1n9t；2-C16:1n9t；3-C18:1n11t；4-C18:1n9t；5-C18:1n6t；6-C18:2n9t，12t；7-C20:1n11t；8-C22:1n13t

將混合標(biāo)品與單一標(biāo)品的色譜峰保留時間對比之后，依據(jù)碳數(shù)遞增規(guī)律，確定了出峰順序[8-11]。相同碳數(shù)的不飽和脂肪酸甲酯（如C18:1n6t、C18:1n9t、C18:1n11t、C18:2n9t，12t））烯鍵少的先出峰，即C18:1n6t、C18:1n9t和C18:1n11t應(yīng)位于C18:2n9t，12t之前；同一異構(gòu)體的不飽和脂肪酸（如C18:1n6t 和C18:1n9t），烯鍵碳數(shù)大的色譜峰比烯鍵碳數(shù)小的先出峰，即C18:1n9t位于C18:1n6t之前。比較圖1中a和b可以看出，在相同色譜條件下，CP-Sil 88毛細(xì)管柱經(jīng)過較長的分析時間能將C18:1n11t與C18:1n9t分開，但后者基線漂移比較嚴(yán)重。DB-23毛細(xì)管柱雖然無法將其分離，但對標(biāo)樣的響應(yīng)值明顯較高，并且實(shí)際中只需用到反式C18:1的總含量，最終確定的是總的TFA含量，因此采用分析時間較短的DB-23毛細(xì)管柱更適合對樣品的中反式脂肪酸的測定。

2.1.2程序升溫條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)比較了不同程序升溫條件對反式脂肪酸甲酯的分離效果。較為合適的升溫程序?yàn)椋合仍?40℃時保持1 min，然后以10℃·min-1的升溫速度升高至180℃，接著以2℃·min-1的升溫速度升高至220℃，在220℃時保持20 min后以5℃·min-1的升溫速度升高至230℃，最后在230℃時保持16 min。在此條件下，8種反式脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖2。

2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限先將反式肉豆蔻酸甲酯（C14:1n9t）、反式棕櫚油酸甲酯（C16:1n9t）標(biāo)準(zhǔn)對照品用正己烷配成濃度分別為2 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、0.5 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后在確定的氣相色譜條件下進(jìn)行檢測。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積作縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸，并根據(jù)S/N＝3確定檢出限[12，13]，所得線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)以及檢出限見表1。由此可見，確定的氣相色譜分析條件下，方法具有較好的線性和較低的檢出限。

圖2　8種反式脂肪酸甲酯混合標(biāo)品色譜圖Fig.2　The chromatogram of the mixture of eight kinds of trans fatty acid methyl esters

表1　線性回歸方程和檢出限Table 1Linear regression equations and detection limit of GC

2.1.4回收率測定準(zhǔn)確稱取玉米油樣品，加入反式肉豆蔻酸甲酯（C14:1n9t）標(biāo)準(zhǔn)對照品，每次檢測重復(fù)3次取平均值，如此測定6組，計算對照品的回收率（結(jié)果如表2）。結(jié)果表明本氣相色譜分析法的回收率在83.0%～91.2%之間，基本能滿足實(shí)際測定需要。

表2　回收率實(shí)驗(yàn)Table 2The recovery experiment

2.2樣品前處理條件的確定

2.2.1萃取劑的確定食用油中的反式脂肪酸主要成分是甘油三酯（TAG）。由于甘油三酯極性弱，因此必須采用合適的萃取劑將其變成游離脂肪酸再進(jìn)行甲酯化衍生方可用GC分析[14-16]。萃取率的高低直接影響甲酯化反應(yīng)產(chǎn)率，進(jìn)而影響整個測定方法的準(zhǔn)確性。因此選擇合適的萃取劑顯得尤為重要。常見的萃取劑有正己烷、二氯甲烷、苯、石油醚、氯仿、甲醇、環(huán)己烷等，酯化劑有氫氧化鈉-甲醇、三氟化硼-甲醇、濃硫酸-甲醇、甲醇鈉-甲醇等[17，18]。

本實(shí)驗(yàn)首先以玉米油甲酯化產(chǎn)物中反式油酸甲酯C18:1n9t為指標(biāo)，比較了二氯甲烷、氯仿、石油醚、苯/石油醚、正己烷/二氯甲烷/甲醇（3/2/1，V/V/V）、氯仿/甲醇（2/1，V/V）分別作為萃取劑時對甲酯化反應(yīng)產(chǎn)率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)石油醚、氯仿/甲醇（2/1，V/V）作為萃取劑時的酯化產(chǎn)率較高，但是氯仿相對毒性要高些，因此采用低毒性、低沸點(diǎn)的石油醚。

2.2.2酯化條件的確定酯化效果主要由酯化劑類型和濃度、酯化時間和溫度等因素決定。酯化劑主要有酸性酯化劑和堿性酯化劑。酸性催化劑能使游離脂肪酸進(jìn)行酯化，但是不一定能夠發(fā)生酯交換。堿性酯化劑能夠使酯化反應(yīng)順利向正向進(jìn)行。通過參考國標(biāo)中推薦使用的酯化劑[19]和本實(shí)驗(yàn)室之前的研究，設(shè)計了9組正交實(shí)驗(yàn)對酯化劑類型和濃度、酯化溫度和時間進(jìn)行了優(yōu)化（見表3和表4），并設(shè)計了單因素濃度梯度實(shí)驗(yàn)（見表5）。

表3　正交設(shè)計影響因素及水平Table 3 Factors and levels of orthogonal design

表4　正交設(shè)計實(shí)驗(yàn)結(jié)果表L9（34）Table 4 Table of orthogonal design experimentresult L9（34）

表5　單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5Single factor experiment result

由表4可以看出，在一定范圍內(nèi)，酯化劑的類型和濃度對酯化效率影響最大，其次是酯化溫度，再次是酯化時間。結(jié)合表5的單因素實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)采用兩步酯化法，即先堿催化酯化后再酸催化酯化，酯化效果增加明顯。通過分析、對照，最終確定最佳酯化條件是：于萃取劑處理后的樣品中先加入2mL0.4mol·L-1氫氧化鉀-甲醇，40℃下酯化反應(yīng)30min，然后再加入2mL0.5mol·L-1硫酸-甲醇溶液，70℃二次酯化反應(yīng)30min。

2.3食用油樣品中反式脂肪酸的GC分析

以購買的經(jīng)常食用的玉米油、人造奶油、黃油以及收集的油炸食品用后油品作為食用油樣品，按照上述確定的前處理方法進(jìn)行甲酯化后進(jìn)行氣相色譜分析，共處理5組平行樣品，比較各樣品中所含的反式脂肪酸的種類及含量（結(jié)果見表6）。

表6　油樣中各反式脂肪酸含量分析Table 6 Content analysis of trans fatty acids in the samples

由表6數(shù)據(jù)可以看出，以所含脂肪為基準(zhǔn)，常見食用油品中反式脂肪酸含量較多的是反式棕櫚油酸和反式油酸，各種反式脂肪酸均能定量測定[20]。這為以后分析高溫長時間油炸對反式脂肪酸的生成及影響分析打下了基礎(chǔ)，為食品質(zhì)量安全服務(wù)。

3　結(jié)論

確立優(yōu)化了方便高效的對食用油反式脂肪酸甲酯化的前處理和氣相色譜分離檢測方法條件。

在極性DB-23（30 m×0.32 mm ID，0.25 μm）毛細(xì)管色譜柱上，配合適當(dāng)?shù)纳郎爻绦颍聪仍?40℃時保持1 min，然后以10℃·min-1的升溫速度升高至180℃，接著以2℃·min-1的升溫速度升高至220℃，在220℃時保持20 min后再以5℃·min-1的升溫速度升高至230℃，最后在230℃時保持16 min，食用油中常見的8種反式脂肪酸甲酯基本能夠分離，方法的線性相關(guān)性、檢出限和回收率基本能滿足定性和定量分析的要求。確定了萃取劑的類型及用量后，將單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合，分析了兩步酯化法中酯化劑類型和濃度、酯化溫度和時間對酯化反應(yīng)效率的影響，確定優(yōu)化了兩步酯化最佳條件，即先加入2 mL 0.4 mol·L-1氫氧化鈉-甲醇，在40℃下先酯化30 min，然后再加入2 mL 0. 4 mol·L-1硫酸-甲醇在70℃下二次酯化50 min。應(yīng)用所優(yōu)化確定的檢測食用油中反式脂肪酸時氣相色譜和樣品前處理條件對幾種常見食用油品進(jìn)行檢測，可對含有的反式脂肪酸進(jìn)行定性和定量分析。

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Study on the Gas Chromatography Analysis of Trans Fatty Acids in Edible Oils

SUN Hui-zhen，QU Sai-nan，QIU Li-qun*，SONG Shao-fang*
College of Chemistry and Material Science/Shandong Agricultural University, Taian 271018，China

Abstract:The analysis of trans fatty acids in edible oils was very important for their content control. Conditions of gas chromatography and sample preparation were optimized for analysis of trans fatty acids by gas chromatography. After treated by proper extractant and two-step methyl esterifying under the conditions determined by orthogonal design，trans fatty acids in edible oils were transformed successfully into corresponding trans fatty acid methyl esters. The conditions of two-step methyl esterification were as follows. The first step esterification was kept for 30 min under 40℃in 0.4 mol·L-1 sodium hydroxide-methanol and the second step esterification was kept for 50 min under 70℃in 0.5 mol·L-1 sulfuric acid-methanol. Those transformed trans fatty acid methyl esters could be separated and detected by three-step programmed temperature gas chromatography equipping polarity DB-23 capillary chromatographic column. Three-step temperature program was as follows. First，the column temperature was hold at 140℃for 1 min and then elevated to 180℃at the rate of 10℃·min-1 and subsequently to 220℃at the rate of 2℃·min-1. After maintained for 20 min at 220℃，the temperature was elevated to 230 ℃at the rate of 5℃·min-1 and was retained for 16 min at 230℃. This gas chromatography could analyze eight common trans fatty acids in edible oils and its linear correlation coefficient，detection limit and recovery rate all could meet the demands of qualitative and quantitative analysis.

Keywords:Edible oil；trans fatty acids（FTA）；gas chromatography；two-step methyl esterification

*通訊作者:Author for correspondence. E-mail:ssf@sdau.edu.cn

作者簡介:孫慧珍（1991-），女，碩士研究生，主要從事色譜分離分析工作. E-mail:1534049288@qq.com

基金項目:山東省食品安全中心的省科技發(fā)展計劃項目（2013GZX20109）

收稿日期:2015-08-01修回日期: 2015-09-22

中圖法分類號：O657.7

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-2324（2016）01-0047-05