槲皮素對口腔鱗狀細胞癌ISG15表達及細胞遷移侵襲影響*

張齊梅，周 驄，伍寶琴，聶敏海

（西南醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜科，四川瀘州 646000）

槲皮素對口腔鱗狀細胞癌ISG15表達及細胞遷移侵襲影響*

張齊梅，周 驄，伍寶琴，聶敏海

（西南醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院牙周黏膜科，四川瀘州 646000）

目的：探討槲皮素對人口腔鱗狀細胞癌SCC-15細胞株中干擾素刺激基因15（interferon stimulated gene 15，ISG15）的表達及細胞遷移侵襲能力的影響。方法：培養(yǎng)人口腔鱗狀細胞癌SCC-15細胞株，槲皮素干預后，Western blotting法檢測ISG15蛋白表達水平，劃痕法檢測細胞遷移，Transwell法檢測細胞侵襲能力。結(jié)果：槲皮素干預人口腔鱗癌SCC-15細胞株24 h后，ISG15蛋白表達、細胞遷移及侵襲能力均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論：槲皮素干預后能夠降低人口腔鱗癌SCC-15細胞株ISG15表達，抑制細胞遷移、侵襲能力。

口腔鱗狀細胞癌；槲皮素；干擾素刺激基因15

口腔鱗狀細胞癌 （oral squamous cell carcinomas，OSCC）屬于人類頭頸部常見的惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率高、死亡率高、存活率低等特點[1]。目前對OSCC發(fā)病機制研究仍不清楚，其治療效果也不理想。在眾多機制中，泛素-蛋白酶體通路（ubiquitin proteasome pathway,UPP）可能具有重要作用。有研究指出由于UPP具有降解細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的作用，因此UPP可能參與了OSCC的發(fā)生發(fā)展過程[2]。干擾素刺激基因15（interferon stimulated gene 15，ISG15）是由I型干擾素誘導后高表達的小分子量蛋白質(zhì)，是UPP通路上游調(diào)節(jié)因子，目前已發(fā)現(xiàn)ISG15在眾多腫瘤中高表達。 UPP與ISG15在腫瘤中的表達差異可能與腫瘤發(fā)展有關(guān)，比如在前列腺癌中，ISG15表達增加而泛素化蛋白相應減少[3]，但ISG15在口腔鱗狀細胞癌中表達尚不清楚，因此研究ISG15在OSCC中的表達具有重要意義。槲皮素（quercetin，Que）作為一種具有抗炎 、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤的黃酮類化合物，可能對OSCC具有一定抑制作用，但目前研究較少[4]。因此本文旨在通過檢測槲皮素干預對人口腔鱗癌SCC-15細胞株中ISG15的蛋白表達以及細胞運動侵襲能力改變，探討槲皮素對OSCC的治療效果和機制影響。

1 材料與方法

1.1 材料

槲皮素（Sigma公司，純度98%，溶于DMSO中，終濃度低于1‰）；兔抗人β-actin、ISG15多克隆抗體，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體（Abcam公司）。人口腔鱗狀癌SCC-15細胞株（購自上海拜力生物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 ISG15蛋白提取及檢測

SCC-15（oral squamous cell carcinoma）細胞株采用含L-谷氨酸和10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，每隔3~5 d傳代1次。將細胞分為SCC-15組與槲皮素組，細胞傳代后待細胞鋪滿瓶底，SCC-15組僅給予培養(yǎng)基，槲皮素依據(jù)前期預實驗結(jié)果與相關(guān)文獻，選擇100 μmol/L作為干預濃度，因此槲皮素組給予槲皮素100 μmol/L，干預時間為24 h[5]。24 h后將細胞用胰酶消化后收集，之后加入預冷的RIPA裂解液 （50 mM Tris-base,1 mM EDTA,150 mM NaCl,0.1%SDS,1%TritonX-100,1%Sodium deoxycholate）600 μl，冰上裂解50 min，4℃、12 000 r/ min離心5 min，用BCA法測蛋白濃度。上樣量為40 μg，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，100 V恒壓轉(zhuǎn)膜，50 g/L脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入適當濃度一抗（ISG15 1∶800，β-actin 1∶2 000），冰箱4度孵育過夜，之后PBST漂洗15 min×3次，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗（羊抗兔1∶1 000），室溫孵育1 h，PBST漂洗15 min×3次。化學試劑發(fā)光，曝光并采集圖像，Image Lab軟件3.0版分析目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參條帶的灰度值，取三次試驗平均值作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學比較。

1.2.2 細胞遷移實驗

將細胞分為SCC-15組與槲皮素組，采用劃痕法觀察槲皮素對SCC-15細胞遷移能力的影響。先在6孔板后劃出均勻橫線，胰酶消化制備單細胞懸液后將細胞按5×105/ml加入6孔板中，24 h后用槍頭劃痕。槲皮素組給予槲皮素100 μmol/L。24 h后拍照，image proplus 6.0軟件分析，計算遷移率。遷移率=（初始邊緣距離-24 h后邊緣距離）/初始邊緣距離。

1.2.3 細胞侵襲實驗

SCC-15細胞侵襲分組同細胞遷移實驗，采用BD公司的基質(zhì)膠包被的侵襲小室 （growth-factor depleted Matrigel invasion chambers）觀察槲皮素對SCC-15細胞侵襲能力的影響。在Matrigel chambers加入500 μl不含血清的DMEM培養(yǎng)基中室溫放置1 h，使基質(zhì)膠水化，再棄多余培養(yǎng)基。下室孔板內(nèi)加入750 μl含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基。胰酶消化并離心收集細胞，用含0.1%BSA的DMEM重懸細胞至4×105/ml，取200 μl加入上室。槲皮素組給予槲皮素100 μmol/L，干預時間為24 h。24 h后，用棉簽抹去上室未能穿膜的細胞，用100%甲醇固定10 min。用0.1%結(jié)晶紫染色細胞并在顯微鏡下計數(shù)。

1.2.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對SCC-15細胞株中ISG15蛋白表達影響

實驗結(jié)果顯示，SCC-15細胞株中ISG15蛋白表達增加，蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參條帶的灰度值比值為1.82±0.11。槲皮素100 μmol/L干預后，SCC-15細胞株中ISG15蛋白表達減少，蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參條帶的灰度值比值為1.02±0.08，與SCC-15組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1。

2.2 槲皮素對SCC-15細胞株遷移和侵襲能力影響

細胞遷移結(jié)果顯示，24 h后SCC-15組細胞株的遷移率為（42.5±5.57）%，槲皮素100 μmol/L干預后遷移率為（11.34±1.79）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

細胞侵襲結(jié)果顯示，SCC-15組細胞穿膜個數(shù)為（112.20±24.36）個，槲皮素100 μmol/L干預后穿膜細胞數(shù)為（28.87±6.47）個，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

實驗結(jié)果提示槲皮素能顯著降低人口腔鱗狀細胞癌SCC-15細胞株的遷移和侵襲能力，表明槲皮素具有一定抑制人口腔鱗狀細胞癌SCC-15細胞運動力。

3 討論

ISG15結(jié)構(gòu)與泛素類似，屬于類泛素修飾蛋白，是一種干擾素誘導后產(chǎn)生的小分子量蛋白質(zhì)[6]。ISG15可通過一系列酶系反應調(diào)節(jié)靶蛋白的作用，參與免疫調(diào)節(jié)及腫瘤的發(fā)生發(fā)展。目前已發(fā)現(xiàn)有200多種作用于ISG15的靶蛋白[7-9]。ISGl5蛋白表達差異較大，表現(xiàn)在不同腫瘤細胞、同一組織來源的腫瘤細胞均存在差異[10]。槲皮素及其衍生物具有包括抗腫瘤在內(nèi)的多種生物學活性，具有較廣的抗瘤譜，對前列腺癌等多種腫瘤具有抑制作用[11]。為研究ISG15蛋白在人口腔鱗狀癌SCC-15細胞株中表達情況以及篩選針對ISG15蛋白的藥物，本研究通過免疫印跡法比較ISG15蛋白在SCC-15細胞株的表達以及槲皮素干預后ISG15在OSCC中表達的差異，推測槲皮素是否通過干預ISG15蛋白表達抑制人口腔鱗癌細胞。結(jié)果顯示，與100 μmol/L的槲皮素干預后比較，ISG15蛋白在人口腔鱗狀癌SCC-15細胞株中表達增加，提示100 μmol/L的槲皮素能夠明顯抑制人口腔鱗狀細胞癌 SCC-15細胞株中ISG15蛋白表達。

腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移與細胞侵襲、遷移能力有關(guān)，因此本研究還進一步檢測了槲皮素對OSCC侵襲、遷移能力影響，細胞遷移實驗結(jié)果顯示，24 h后SCC-15組細胞株的遷移率為（42.5±5.57）%，槲皮素100 μmol/L干預后遷移率為（11.34±1.79）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。細胞侵襲結(jié)果顯示，SCC-15組細胞穿膜細胞數(shù)為（112.20±24.36）個，槲皮素100 μmol/L干預后穿膜細胞數(shù)為（28.87±6.47）個，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。提示槲皮素能夠抑制人口腔鱗狀細胞癌SCC-15細胞運動力，表現(xiàn)在槲皮素能降低人口腔鱗狀細胞癌SCC-15細胞株的遷移和侵襲能力。

綜上所述，本研究顯示槲皮素可能對口腔鱗狀細胞癌有抑制作用，其機制與抑制ISG15表達，抑制口腔鱗狀細胞癌的轉(zhuǎn)移與細胞侵襲有關(guān)，其是否還通過其他機制干預口腔鱗狀細胞癌還可進一步研究。

圖1 槲皮素對SCC-15細胞株中ISG15蛋白表達影響

圖2 槲皮素對SCC-15細胞株遷移能力影響

圖3 槲皮素對SCC-15細胞株侵襲能力影響

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（2016-03-14收稿）

Effects of quercetin on the expression of ISG15 and the migration and invasion of oral squamous cell carcinoma

Zhang Qimei，Zhou Cong,Wu Baoqin,Nie Minhai

Department of Periodontics and Oral Medicine,the Affiliated Stomatological Hospital of Southwest Medical University,Luzhou，Sichuan Province 646000，China

ObjectiveTo investigate the effects of quercetin on the expression of ISG15 and the migration and invasion of oral squamous cell carcinoma.Methods:Oral squamous cell carcinoma cell line,SCC-15 was treated with quercetin,and the expression of ISG15 was determined by Western blotting.The invasion and migration of SCC-15 were determined by wound healing assay and transwell assay respectively.Results:After 24 hours quercetin treatment,the expression of ISG-15,and the invasion and migration of SCC-15 were decreased significantly（P＜0.05）.Conclusion:Our results show that quercetin could inhibit ISG15 expression and the invasion and migration of SCC-15 cells.

Oral squamous cell carcinomas;Quercetin;Interferon stimulated gene 15

R780.1

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.03.013

*四川省科技廳課題（2014LY-62）

張齊梅（1977-），女，主治醫(yī)師，碩士。

聶敏海（1967-），男，教授。E-mail：nieminhai@126.com